WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение частично основывается и притязает на приоритет предварительных заявок на патент США 60/223360, ...»

-- [ Страница 1 ] --

009288

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение частично основывается и притязает на приоритет предварительных заявок на

патент США 60/223360, поданной 7 августа 2000 г., и 60/236826, поданной 29 сентября 2000 г., включенных в данное описание в качестве ссылок.

Настоящее изобретение относится к антителам, включая определенные части или варианты, специфичные для по меньшей мере одного белка фактора некроза опухоли альфа (TNF) или его фрагмента, а также нуклеиновой кислоте, кодирующей такие антитела против TNF, комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам и способам их получения и применения, включая лекарственные композиции, введение и устройства.

Уровень техники TNF-альфа представляет собой растворимый гомотример субъединиц белка массой 17 кД (Smith et al., J. Biol. Chem., 262:6951-6954 (1987)). Также существует мембраносвязанная форма предшественника TNF массой 26 кД (Kriegler et al., Cell, 53:45-53 (1988)). Для общего представления о TNF см. Beutler et al., Nature, 320:584 (1986); Old, Science, 230:630 (1986); и Le et al., Lab. Invest., 56:234 (1987).

Другие клетки, кроме моноцитов или макрофагов, также продуцируют TNF-альфа. Например, TNFальфа продуцируют человеческие немоноцитарные клеточные линии опухоли (Rubin et al., J. Exp. Med., 164:1350 (1986); Spriggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6563 (1987)). Т-Лимфоциты периферической крови CD4 + и CD8+ и некоторые культивированные линии Т- и В-клеток (Cuturi et al., J. Exp. Med., 165:1581 (1987); Sung et al., J. Exp. Med., 168:1539 (1988); Turner et al., Eur. J. Immunol., 17:1807- (1987)) также продуцируют TNF-альфа.

TNF-альфа оказывает провоспалительное действие, приводящее к повреждению тканей, такое как разрушение хрящей и костей (Saklatvala, Nature, 322:547-549 (1986); Bertolini, Nature, 319:516-518 (1986)), индукции фактора адгезии, индукции прокоагулянтной активности на эндотелиальных клетках сосудов (Pober et al., J. Immunol., 136:1680 (1986)), усилению прилипания нейтрофилов и лимфоцитов (Pober et al., J. Immunol., 138:3319 (1987)), стимуляции высвобождения фактора активации тромбоцитов из макрофагов, нейтрофилов и эндотелиальных клеток сосудов (Camussi et al., J. Exp. Med., 166:1390 (1987)).

Последние факты связывают TNF-альфа с инфекционными заболеваниями (Cerami et al., Immunol.

Today, 9:28 (1988)), иммунными нарушениями, новообразованиями (Oliff et al., Cell, 50:555 (1987)), аутоиммунными нарушениями и реакцией «трансплатата против хозяина» (Piguet et al., J. Exp. Med., 166: (1987)). Связь TNF-альфа со злокачественными и инфекционными заболеваниями часто относят к катаболическому состоянию хозяина. Больные злокачественными опухолями страдают от потери веса, как правило, связанной с анорексией.




Сильное истощение, связанное со злокачественными опухолями и другими болезнями известны как "кахексия" (Kern et al., J. Parent. Enter. Nutr., 12:286-298 (1988)). Кахексия включает прогрессирующую потерю массы, анорексию и стойкую потерю недостаточной массы тела в ответ на рост злокачественной опухоли. Кахектическое состояние вызывает наибольшую болезненность и смертность при злокачественной опухоли. Имеются доказательства, что TNF-альфа участвует в развитии кахексии при злокачественной опухоли, инфекционных заболеваниях и других каболических состояниях (см., например, Beutler and Cerami, Ann. Rev. Immunol., 7:625-655 (1989)).

Полагают, что TNF-альфа играет центральную роль в грамотрицательном сепсисе и эндотоксическом шоке (Michie et al., Br. J. Surg., 76:670-671 (1989); Debets et al., Second Vienna Shock Forum, p.463Simpson et al., Crit. Care Clin., 5:27-47 (1989)), включая лихорадку, недомогание, анорексию и кахексию. Эндотоксин сильно активирует продуцирование моноцитов/макрофагов и секрецию TNFальфа и других цитокинов (Kornbluth et al., J. Immunol., 137:2585-2591 (1986)). TNF-альфа и другие цитокины, образованные моноцитами, опосредуют метаболические и нейрогуморальные реакции на эндотоксин (Michie et al., New Engl. J. Med., 318:1481-1486 (1988)). Введение эндотоксина добровольцам вызывает острое заболевание с симптомами, напоминающими грипп, включая лихорадку, тахикардию, ускоренный метаболизм и выделение гормонов стресса (Revhaug et al., Arch. Surg., 123:162-170 (1988)). У пациентов, страдающих от грамотрицательного сепсиса, увеличивается уровень TNF-альфа в кровотоке (Waage et al., Lancet, 1:355-357 (1987); Hammerle et al., Second Vienna Shock Forum, p.715-718 (1989); Debets et al., Crit. Care Med., 17:489-497 (1989); Calandra et al., J. Infect. Dis., 161:982-987 (1990)).

Таким образом, TNF-альфа вовлекается в воспалительные заболевания, аутоиммунные заболевания, вирусные, бактериальные и паразитарные инфекции, злокачественные опухоли и/или нейрогенеративные заболевания и является удобной мишенью для специфического биологического лечения при таких заболеваниях, как ревматоидный артрит и болезнь Крона. Сообщается о благоприятном действии при испытаниях с открытой меткой с химерными моноклональными антителами против TNF-альфа (сА2) с подавлением воспаления и успешным повторным лечением после рецидива при ревматоидном артрите (Elliott et al., Arthritis Rheum., 36:1681-1690 (1983); и Elliott et al., Lancet, 344:1125-1127 (1994)) и при болезни Крона (Van Dullemen et al., Gastroenterology, 109:129-135 (1995)). Также сообщается о благоприятных результатах при случайном двойном слепом плацебо-контролируемом испытании сА2 при ревматоидном артрите с подавлением воспаления (Elliott et al., Lancet, 344:1105-1110 (1994)). Антитела к веществумодулятору", который характеризуется как кахектин (обнаружено, что последний идентичен TNF), описаны Cerami et al. (публикация патента ЕРО 0212489, 4 марта 1987 года). Такие антитела указаны как применимые при диагностических иммуноанализах и лечении шока при бактериальных инфекциях.





Rubin et al. (публикация патента ЕРО 0218868, 22 апреля 1987 года) описывают моноклональные антитела против TNF человека, гибридомы, секретирующие такие антитела, способы получения таких антител и применение таких антител при иммуноанализе TNF. Yone et al. (публикация патента ЕРО 0288088, октября 1988 года) описывают антитела против TNF, в том числе mAb, и их применимость для диагностики заболеваний методом иммуноанализа, в частности болезни Кавасаки и бактериальной инфекции.

Сообщается, что жидкости организма больных болезнью Кавасаки (острый лихорадочный синдром кожно-слизистых лимфоузлов у детей: Kawasaki Т., Allergy, 16:178 (1967); Kawasaki Т., Shonica (Pediatrics), 26:935 (1985)) содержат повышенные концентрации TNF, связанные с развитием патологии (Yone et al., см. выше).

Другие исследователи описывают mAb, специфические для рекомбинатного TNF человека, с нейтрализующей активностью in vitro (Liang, C-M. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 137:847-854 (1986);

Meager A. et al., Hybridoma, 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma, 6:359-369 (1987); Bringman T.S. et al., Hybridoma, 6:489-507 (1987); Hirai M. et al., J. Immunol. Meth., 96:57-62 (1987); Moller A. et al., Cytokine, 2:162-169 (1990)). Некоторые из таких mAb использовали для картирования эпитопов TNF человека и разработки иммуноферментных анализов (Fendly et al., см. выше; Hirai et al., см. выше; Moller et al., см.

выше) и для обеспечения очистки рекомбинантного TNF (Bringman et al., см. выше). Однако указанные исследования не обеспечивают основу для получения антител, нейтрализующих TNF, которые можно использовать при диагностике in vivo или лечении людей, из-за иммуногенности, отсутствия специфичности и/или фармацевтической пригодности.

Показано, что нейтрализующие антисыворотки или mAb против TNF у других млекопитающих, отличных от человека, отменяют вредные физиологические изменения и предупреждают гибель после летального заражения при экспериментальной эндотоксемии и бактериемии. Такое действие показано, например, при анализах летальности грызунов и на модельных системах болезни приматов (Mathison J.C. et al., J. Clin. Invest., 81:1925-1937 (1988); Beutler B. et al., Science, 229:869-871 (1985); Tracey K.J. et al., Nature, 330:662-664 (1987); Shimamoto Y. et al., Immunol. Lett., 17:311-318 (1988); Silva A.T. et al., J. Infect.

Dis., 162:421-427 (1990); Opal S.M. et al., J. Infect. Dis., 161:1148-1152 (1990); Hinshaw L.B. et al., Circ.

Shock, 30:279-292 (1990)).

Предполагаемые локусы связывания рецепторов hTNF описываются Eck and Sprang, J. Biol. Chem., 264(29), 17595-17605 (1989), которые идентифицировали локусы связывания TNF-a как состоящие из аминокислот 11-13, 37-42, 49-57 и 155-157. В заявке РСТ WO91/02078 (дата приоритета 7 августа года) описываются лиганды TNF, которые могут связываться с моноклональными антителами, имеющими следующие эпитопы: по меньшей мере один из 1-20, 56-77 и 108-127; по меньшей мере два из 1-20, 56-77, 108-127 и 138-149; все из 1-18, 58-65, 115-125 и 138-149; все из 1-18 и 108-128; все из 56-79, 110и 135- или 136-155; все из 1-30, 117-128 и 141-153; все из 1-26, 117-128 и 141-153; все из 22-40, 49- или -97, 110-127 и 136-153; все из 12-22, 36-45, 96-105 и 132-157; все как из 1-20, так и из 76-90; все из 22-40, 69-97, 105-128 и 135-155; все из 22-31 и 146-157; все из 22-40 и 49-98; по меньшей мере один из 22-40, 49-98 и 69-97, оба из 22-40 и 70-87.

Антитела млекопитающих, отличных от человека, химерные, поликлональные (например, антисыворотки) и/или моноклональные антитела (Mab) и фрагменты (например, продукты их протеолитического расщепления или их слитые белки) являются потенциальными лекарственными средствами, которые в ряде случаев исследуются с целью попытки лечения некоторых заболеваний. Однако такие антитела или фрагменты при введении людям могут дать иммунную реакцию. Такая иммунная реакция может привести к опосредуемому иммунным комплексом клиренсу антител или их фрагментов из кровообращения и сделать повторное введение неподходящим для лечения, что снижает лечебную пользу для пациента и ограничивается повторное введение антител или фрагментов. Например, повторное введение антител или фрагментов, содержащих части, не происходящие от человека, может привести к сывороточной болезни и/или анафилаксии. Для того чтобы избежать указанных и других проблем, использован ряд подходов для снижения иммуногенности таких антител и их частей, включая химеризацию и гуманизацию, хорошо известные из уровня техники. Однако такие и другие подходы все еще могут привести к образованию антител или фрагментов с некоторой иммуногенностью, низкой аффинностью, низкой авидностью или к проблемам с культурами клеток, масштабированием, получением, и/или низким выходом.

Таким образом, такие антитела или фрагменты могут оказаться не идеально подходящими для получения или применения в качестве лекарственных белков.

Соответственно, существует потребность в создании антител против TNF или фрагментов, преодолевающих большинство указанных проблем, а также превосходящих известные антитела или их фрагменты.

Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к выделенным антителам человека, приматов, грызунов, млекопитающих, химерным, гуманизированным и/или CDR-слитым антителам против TNF, иммуноглобулинам, продуктам их расщепления и другим их специфическим частям и вариантам, а также к композициям -2с антителами против TNF, кодирующим или комплементарным нуклеиновым кислотам, векторам, клеткам-хозяевам, композициям, составам, устройствам, трансгенным животным, трансгенным растениям и способам их получения и применения, описанным в данном описании, в сочетании с известным в технике.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному антителу против TNF, описанному в данном описании. Антитело согласно настоящему изобретению включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой цепи или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой цепи или легкой цепи, константную область тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный участок, или любую его часть, которые можно включить в антитело настоящего изобретения. Антитело изобретения может включать антитело или может происходить от любого млекопитающего, такого как человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат или другое млекопитающее, или любое их сочетание, и т.п.

Настоящее изобретение относится, в одном аспекте, к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, включающим, комплементарным или гибридизующимся с полинуклеотидом, кодирующим специфические антитела против TNF, содержащим по меньшей мере одну его специфическую последовательность, домен, часть или вариант. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот антител против TNF, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антител, векторов и/или клеток-хозяев.

По меньшей мере одно антитело изобретения связывается по меньшей мере с одним специфическим эпитопом, специфическим по меньшей мере к одному белку TNF, субъединице, фрагменту, части или любой их комбинации. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере один связывающийся с антителом участок, который содержит по меньшей мере одну часть указанного белка, и указанный эпитоп предпочтительно состоит по меньшей мере из 1-5 аминокислот, по меньшей мере из одной его части, такой как по меньшей мере один функциональный, внеклеточный, растворимый, гидрофильный, внешний или цитоплазматический домен, указанного белка или любой его части.

По меньшей мере одно антитело может, необязательно, содержать по меньшей мере одну специфическую часть по меньшей мере одного гипервариабельного участка (CDR) (например, CDR1, CDR2 или CDR3 вариабельной области тяжелой или легкой цепи) и/или по меньшей мере одну константную или вариабельную область каркасного участка или любую его часть. По меньшей мере одна аминокислотная последовательность антитела также может, необязательно, содержать по меньшей мере одну специфическую замену, вставку или делецию, описанные в данном описании или известные в технике.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному выделенному антителу против TNF, описанному в данном описании, где антитело обладает по меньшей мере одной активностью, такой как, но не ограничиваясь этим, ингибирование индуцированных TNF факторов адгезии клетки, ингибирование связывания TNF с рецептором, улучшенным артритным индексом на мышиной модели (см., например, примеры 3-7). Антитело против TNF можно, таким образом, скринировать на соответствующую активность известными методами, такую как биологоческая активность в отношении белка TNF, и другую активность.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному антиидиотипическому антителу против TNF по меньшей мере к одному антителу против TNF настоящего изобретения. Антиидиотипическое антитело включает любой белок или пептид, содержащий молекулу, содержащую по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, например, но не ограничиваясь этим, по меньшей один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина или его лигандсвязывающую часть, вариабельную область тяжелой или легкой цепи, константную область тяжелой или легкой цепи, каркасный участок, или любую его часть, которые можно ввести в антитело настоящего изобретения.

Антитело изобретения может содержаться в или происходить от любого млекопитающего, такого как человек, мышь, кролик, грызун, примат или другое млекопитающее.

Настоящее изобретение относится, в одном аспекте, к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, содержащих, комплементарных или гибридизующихся с полинуклеотидом, кодирующим по меньшей мере одно антиидиотипическое антитело против TNF, содержащим по меньшей мере одну специфическую его последовательность, домен, часть или вариант. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим указанные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антиидиотипическое антитело против TNF, клеткам-хозяевам, содержащим такие нуклеиновые кислоты и/или рекомбинантные векторы, а также к способам получения и/или применения таких нуклеиновых кислот антиидиотипических антител, векторов и/или клеток-хозяев.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу экспрессии по меньшей мере одного антитела против TNF, или антиидиотипического антитела против TNF, в клеткехозяине, включающему культивирование клеток-хозяев, как описывается в данном описании, в условиях, где по меньшей мере одно антитело против TNF экспрессируется в количествах, которые можно обнаружить и/или извлечь.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, содержащей (а) данном описании, и (b) подходящий носитель или разбавитель. Композиция также может содержать, необязательно, по меньшей мере одно другое соединение, белок или композицию.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу введения терапевтически эффективного количества антител против TNF или композиции для модуляции или лечения по меньшей мере одного связанного с TNF состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, и/или введения до, после или во время такого состояния, как известно в технике и/или описано в данном описании.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки терапевтически или профилактически эффективного количества по меньшей мере одного антитела против TNF по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одному способу или композиции с антителами против TNF для диагностики по меньшей мере одного связанного с TNF состояния в клетке, ткани, органе, у животного или пациента, и/или диагностики до, после или во время такого состояния, как известно в технике и/или описано в данном описании.

Настоящее изобретение также относится по меньшей мере к одной композиции, устройству и/или способу доставки с целью диагностики по меньшей мере одного антитела против TNF по настоящему изобретению.

Фиг. 1 дает графическое представление, отражающее анализ способности mAb TNV в супернатантах клеток гибридом ингибировать связывание TNF с рецептором рекомбинантного TNF. Различные количества супернатантаов клеток гибридом, содержащих известные количества mAb TNV, предварительно инкубируют с фиксированной концентрацией (5 нг/мл) 125I-меченного TNFV. Смесь переносят в 96-луночные планшеты Optiplates, предварительно сенсибилизированные p55-sf2 - слитым белком рецептор рекомбинантного TNF/IgG. Количество TNF, связанного с рецептором р55 в присутствии mAb, определяют после вымывания несвязанного вещества и подсчета с использованием счетчика гаммаквантов. Хотя в данных экспериментах проверяли восемь образцов mAb TNV, для простоты три mAb, идентичных, как показал анализ последовательности ДНК, одному из других mAb TNV (см. раздел 5.2.2), на фиг. не указаны. Каждый образец испытывают дважды. Приведенные результаты являются характерными результатами двух независимых экспериментов.

Фиг. 2 показывает последовательности ДНК вариабельных областей тяжелой цепи mAb TNV. Показанный ген зародышевой линии является геном DP-46. "TNV" показывает, что приведенная последовательность является последовательностью TNV14, TNV15, TNV148 и TNV196. Первые три нуклеотида в последовательности TNV определяют кодон инициации трансляции Met. Точки в последовательностях гена mAb TNV показывают, что нуклеотид тот же, что и в последовательности зародышевой линии. Первые 19 нуклеотидов (подчеркнуты) последовательностей TNV соответствуют олигонуклеотиду, используемому для амплификации вариабельной области методом ПЦР (PCR). Начало трансляции аминокислоты (однобуквенная аббревиатура) со зрелого mAb показана только для гена зародышевой линии. Три домена CDR в трансляции аминокислоты зародышевой линии отмечены жирным шрифтом и подчеркнуты. Линии, отмеченные TNV148(В), показывают, что приведенная последовательность имеет отношение как к TNV148, так и к TNV148B. "Бреши" в последовательности ДНК зародышевой линии (CDR3) имеют место из-за того, что последовательность неизвестна или не существует в гене зародышевой линии. Тяжелые цепи mAb TNV используют соединяющий участок J6.

Фиг. 3 показывает последовательности ДНК вариабельных областей легких цепей mAb TNV. Показанный ген зародышевой линии является характерным членом семейства человеческих генов Vg/38K с вариабельной областью каппа зародышевой линии. Точки в последовательностях гена mAb TNV показывают, что нуклеотид тот же, что и в последовательности зародышевой линии. Первые 16 нуклеотидов (подчеркнуты) последовательностей TNV соответствуют олигонуклеотиду, используемому для ПЦРамплификации вариабельной области. Начало трансляции аминокислоты зрелого mAb (однобуквенная аббревиатура) показана только для гена зародышевой линии. Три домена CDR в трансляции аминокислоты зародышевой линии отмечены жирным шрифтом и подчеркнуты. Линии, отмеченные TNV148(В), показывают, что приведенная последовательность имеет отношение как к TNV148, так и к TNV148B.

"Бреши" в последовательности ДНК зародышевой линии (CDR3) имеют место из-за того, что последовательность неизвестна или отсутствуют в гене зародышевой линии. Легкие цепи mAb TNV используют соединяющий участок J3.

Фиг. 4 показывает расшифрованные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи mAb TNV. Приведенные аминокислотные последовательности (однобуквенная аббревиатура) расшифрованы из последовательности ДНК, определенной как из неклонированных продуктов ПЦР, так и из клонированных продуктов ПЦР. Аминокислотные последовательности показаны по частям в доменах выделенной сигнальной последовательности (сигнал), каркасном участке (FW) и гипервариабельном участке (CDR). Аминокислотная последовательность для гена зародышевой линии DP-46 приводится на верхней линии для каждого домена. Точки показывают, что аминокислотная последовательность mAb TNV идентична гену зародышевой линии. TNV148(В) показывает, что приведенная последовательность имеет отношение как к TNV148, так и к TNV148B. "TNVs" показывает, что приведенная последовательность имеет отношение ко всем mAb, если не приводится другая последовательность.

Штрихи в последовательности зародышевой линии (CDR3) показывают, что последовательности неизвестны или не существуют в гене зародышевой линии.

Фиг. 5 показывает расшифрованные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи mAb TNV. Приведенные аминокислотные последовательности (однобуквенная аббревиатура) расшифрованы из последовательности ДНК, определенной как из неклонированных продуктов ПЦР, так и из клонированных продуктов ПЦР. Аминокислотные последовательности показаны по частям в доменах выделенной сигнальной последовательности (сигнал), каркасном участке (FW) и гипервариабельном участке (CDR). Аминокислотная последовательность для гена с легкой цепью типа Vg/38K приводится на верхней линии для каждого домена. Точки показывают, что аминокислота в mAb TNV идентична гену зародышевой линии. TNV148(В) показывает, что приведенная последовательность имеет отношение как к TNV148, так и к TNV148B. "Все" показывает, что приведенная последовательность имеет отношение к TNV14, TNV15, TNV148, TNV148B и TNV186.

Фиг. 6 показывает схематические пояснения к экспрессирующим плазмидам тяжелой и легкой цепи, используемым для получения клеток С466, экспрессирующих rTNV148B. p1783 является плазмидой тяжелой цепи, и р1776 является плазмидой легкой цепи. Кодирующие домены вариабельной и константной областей rTNV148B показаны черными участками. Иммуноглобулиновые энхансеры в интронах J-C показаны серыми участками. Приводятся соответствующие сайты рестрикции. Плазмиды показаны ориентированными таким образом, что транскрипция генов Ab происходит в направлении по часовой стрелке. Плазмида р1783 имеет длину 19,53 т.п.н., и плазмида р1776 имеет длину 15,06 т.п.н. Полные нуклеотидные последовательности обеих плазмид известны. Кодирующую последовательность вариабельной области в р1783 можно легко заменить другой последовательностью вариабельной области тяжелой цепи посредством замены рестрикционного фрагмента BsiWI/BstBI. Кодирующую последовательность вариабельной области в р1776 можно заменить другой последовательностью вариабельной области посредством замены рестрикционного фрагмента SalI/AflII.

Фиг. 7 дает графическое представление об анализе кривой роста пяти клеточных линий, продуцирующих rTNV148B. Культуры инициируют в день 0, высевая клетки в колбы Т75 в среды I5Q+MHX, и получают плотность жизнеспособных клеток 1,0 х 105 клеток/мл в объеме 30 мл. Клеточные культуры, используемые для данных исследований, культивируют непрерывно, так как осуществляют трансфекции и субклонирование. В последующие дни клетки в Т-колбах тщательно ресуспендируют, и извлекают аликвоты культуры в 0,3 мл. Исследования кривой роста заканчивают, когда число клеток падает ниже 1,5 х 105 клеток/мл. Число живых клеток в аликвоте определяют путем исключения трипанового синего, и оставшуюся аликвоту хранят для последнего определения концентрации mAb. На всех аликвотах образцов одновременно осуществляют ELISA на человеческий IgG.

Фиг. 8 показывает графическое сравнение скоростей роста клеток в присутствии различных концентраций МНХ для отбора. Субклоны клеток С466А и С466В распускают в свободных от МНХ средах (IMDM, 5% FBS, 2 мМ глутамина) и культивируют еще в течение двух суток. Затем обе клеточные культуры делят на три культуры, которые или не содержат МНХ, или содержат 0,2Х МНХ или 1X МНХ. На другой день культуры высевают в свежие колбы Т75 в исходной плотности 1 х 105 клеток/мл, и клетки подсчитывают с интервалом в 24 ч в течение одной недели. Время удвоения в течение первых 5 суток вычисляют с использованием формулы в SOP PD32.025 и показывают в виде столбцов.

Фиг. 9 дает графическое представление о стабильности продуцирования mAb со временем в двух клеточных линиях, продуцирующих rTNVl48B. Субклоны клеток, культивируемых непрерывно с тех пор, как осуществляют трансфекции и субклонирование, используют для начала длительного культивирования в 24-луночных культуральных планшетах. Клетки культивируют в средах I5Q с или без МНХ для отбора. Клетки непрерывно пересевают путем расщепления культур каждые 4-6 дней и сохранения новых жизнеспособных культур, в то время как прежние культуры истощаются. Аликвоты супернатанта отработанных клеток собирают сразу после истощения культур и хранят до определения концентраций mAb. На всех аликвотах образцов одновременно осуществляют ELISA на человеческий IgG.

Фиг. 10 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Tg 197 в ответ на антитела против TNF настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 4. Для исследования на Tg 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом - в мг/кг или 10 мг/кг - PBS Дульбекко (D-PBS) или антителами против TNF настоящего изобретения (TNV14, TNV148 или TNV196). Когда массы анализируют как изменение по сравнению с массой до введения, животные, обработанные 10 мг/кг сА2, на протяжении всего исследования последовательно показывают более высокое прибавление массы, чем животные, обработанные D-PBS. Такое прибавление массы существенно в недели 3-7. Животные, обработанные 10 мг/кг TNV148, также достигают существенного прибавления массы на неделе 7 исследования.

представлено в примере 4. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, ниже, чем у контрольной группы с D-PBS, начиная с недели 3 и на протяжении остальной части исследования (неделя 7).

Животным, обработанным 1 мг/кг TNV14, и животным, обработанным 1 мг/кг сА2, после 3 недели не удается показать значительное снижение AI по сравнению с группой, обработанной D-PBS. Нет существенного различил между группами, обработанными 10 мг/кг, при сравнении групп с подобными дозами друг с другом (10 мг/кг сА2 по сравнению с 10 мг/кг TNV14, 148 и 196). Когда сравнивают группы, обработанные 1 мг/кг, группа, обработанная 1 мг/кг TNV148, показывает существенно более низкий AI, чем обработанная 1 мг/кг сА2, на 3, 4 и 7 неделях. Обработка 1 мг/кг TNV148 также дает существенно более низкий AI, чем в группах, обработанных 1 мг/кг TNV14, на 3 и 4 неделях. Хотя TNV196 показывает существенное снижение AI до 6 недели исследования (при сравнении с группой, обработанной D-PBS), значимой в заключение исследования признана только обработка 1 мг/кг TNV148.

Фиг. 12 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Tg 197 в ответ на антитела против TNF настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 5. Для исследования на Tg 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 8 обрабатываемых групп и обрабатывают интраперитонеальным болюсом контрольного вещества (D-PBS) или антителами (TNV14, TNV148) в 3 мг/кг (неделя 0). Инъекции повторяют всем животным в недели 1, 2, 3 и 4. Группы 1-6 оценивают на эффективность испытываемого вещества. Образцы сывороток, полученные от животных групп 7 и 8, оценивают на индукцию иммунной реакции и фармакокинетический клиренс TNV14 или TNV148 в недели 2, 3 и 4.

Фиг. 13, А-С, являются графиками, представляющими развитие тяжести заболевания в примере 5 на основании артритного индекса. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, значительно ниже, чем у контрольной группы с D-PBS, начиная с недели 2 и на протяжении остальной части исследования (неделя 5). Животным, обработанным 1 мг/кг или 3 мг/кг сА2, и животным, обработанным 3 мг/кг сА2 TNV14, не удается достичь значительного снижения AI в любое время исследования по сравнению с контрольной группой, обработанной D-PBS. Животные, обработанные 3 мг/кг TNV148, показывают значительное снижение при сравнении с группой, обработанной D-PBS, на недели 3 и далее до недели 5.

Животные, обработанные 10 мг/кг сА2, показывают значительное снижение AI при сравнении с обеими более низкими дозами (1 мг/кг и 3 мг/кг) сА2 в недели 4 и 5 исследования, а также существенно более низкий AI, чем у животных, обработанных TNV14, в недели 3-5. Хотя существенных различий между любыми группами, обработанными 3 мг/кг, не выявлено, AI для животных, обработанных 3 мг/кг TNV14, в некоторые моменты времени существенно выше, чем при обработке 10 мг/кг, в то время как животные, обработанные TNV148, существенно не отличались от животных, обработанных 10 мг/кг сА2.

Фиг. 14 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Tg 197 в ответ на антитела против TNF настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 6. Для исследования на Tg 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 6 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом антител (сА2 или TNV148) или в 3 мг/кг или в 5 мг/кг. В данном исследовании используют контрольные группы, обработанные D-PBS и 10 мг/кг сА2.

Фиг. 15 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса, как представлено в примере 6. Все обрабатываемые группы показывают некоторую защиту в более ранние моменты времени, причем обработанные 5 мг/кг сА2 и 5 мг/кг TNV148 показывают значительное снижение AI в недели 1-3, и все обработанные группы показывают значительное снижение AI в неделю 2. Позднее при исследовании животные, обработанные 5 мг/кг сА2, показывают некоторую защиту со значительным снижением в недели 4,6 и 7. Низкая доза (3 мг/кг) как сА2, так и TNV148, показывает существенное снижение в 6 неделю, и все обработанные группы показывают существенное снижение в неделю 7. Ни одна из обработанных групп не способна сохранить существенное снижение в заключение исследования (неделя 8). Нет существенных различий между какими-либо обработанными группами (за исключением контрольной группы с физиологическим раствором) в какой-либо момент времени.

Фиг. 16 показывает изменение массы на мышиной модели артрита Tg 197 в ответ на антитела против TNF настоящего изобретения по сравнению с контрольными антителами в примере 7. Сравнивают эффективность однократного интраперитонеального болюса TNV148 (полученного из клеток гибридомы) и rTNV148B (полученного из трансфицированных клеток). Для исследования на Tg 197 мышей в возрасте приблизительно 4 недель, основываясь на виде и массе тела, отбирают в одну из 9 обрабатываемых групп и обрабатывают однократным интраперитонеальным болюсом PBS Дульбекко (D-PBS) или антителами (TNV148, rTNV148B) в 1 мг/кг.

Фиг. 17 представляет развитие тяжести заболевания на основании артритного индекса, как представлено в примере 7. Артритный индекс группы, обработанной 10 мг/кг сА2, ниже, чем контрольной группы с D-PBS, начиная с недели 4 и на протяжении остальной части исследования (неделя 8). Как группы, обработанные TNV148, так и группа, обработанная 1 мг/кг сА2, показывают значительное снижение AI в неделю 4. Хотя предыдущее исследование (Р-099-017) показало, что TNV148 несколько эффективнее в отношении снижения артритного индекса после однократного интраперитонеального болюса в 1 мг/кг, данное исследование показывает, что AI групп, обработанных обоими вариантами антител TNV, несколько выше. Хотя (за исключением недели 6) в группе, обработанной 1 мг/кг сА2, нет существенного повышения по сравнению с группой, обработанной 10 мг/кг сА2, и в группах, обработанных TNV148, происходит некоторое повышение в недели 7 и 8, существенных различий в AI при обработке мг/кг сА2, 1 мг/кг TNV148 и 1 мг/кг TNV148B, не имеется в любой момент исследования.

Настоящее изобретение относится к выделенным, рекомбинантным и/или синтетическим антителам против TNF человека, приматов, грызунов, млекопитающих, химерным, гуманизированным и/или CDRслитым антителам против TNF и антиидиотипическим антителам TNF к ним, а также к композициям и кодирующим молекулам нуклеиновых кислот, содержащих по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий по меньшей мере одно антитело против TNF или антиидиотипическое антитело. Настоящее изобретение также относится, но не ограничивается перечисленным, к способам получения и применения таких нуклеиновых кислот и антител и антиидиотипических антител, включая диагностические и терапевтические композиции, способы и устройства.

Используемые в данном описании термины "антитело против фактора некроза опухоли альфа", "антитело против TNF", "часть антитела против TNF" или "фрагмент антитела против TNF" и/или "вариант антитела против TNF" и подобные термины относятся к любому белку или пептиду, содержащему молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, такую как по меньшей мере один гипервариабельный участок (CDR) тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающую часть, вариабельная область тяжелой или легкой цепи, константная область тяжелой или легкой цепи, каркасный участок, или любую ее часть, или по меньшей мере одну часть рецептора TNF или связывающего белка, которую можно ввести в антитело настоящего изобретения. Такое антитело также, необязательно, может воздействовать на специфический лиганд, такой, но не ограничиваясь этим, где такое антитело модулирует, снижает, повышает, выступает антагонистом, агонистом, смягчает, облегчает, блокирует, ингибирует, нейтрализует, препятствует, или иным образом воздействует на по меньшей мере одну активность или связывание TNF, или на активность или связывание рецептора TNF in vitro, in situ и/или in vivo. В качестве примера, не являющегося ограничением, подходящее антитело против TNF, специфическая часть или вариант по настоящему изобретению может связываться по меньшей мере с одним TNF или его специфическими частями, вариантами или доменами. Подходящее антитело против TNF, специфическая часть или вариант также могут, необязательно, воздействовать на по меньшей мере одну активность или функцию TNF, такую как синтез РНК, ДНК или белка, высвобождение TNF, передача сигнала рецептором TNF, расщепление мембраны TNF, активность TNF, продуцирование и/или синтез TNF, или другую активность или функцию. Также подразумевается, что термин "анти-тело" охватывает антитела, фрагменты их расщепления, специфические части и варианты, включая миметики антител или части антител, имитирующие строение и/или функцию антитела или его специфического фрагмента или его части, включая одноцепочечные антитела и их фрагменты. К функциональным фрагментам относятся антигенсвязывающие фрагменты, связывающиеся с TNF млекопитающего. Например, изобретением охватываются фрагменты антител, способные связываться с TNF или его частью, в том числе Fab (например, при расщеплении папаином), Fab' (например, при расщеплении пепсином и частичном восстановлении) и F(ab')2 (например, при расщеплении пепсином), facb (например, при расщеплении плазмином), pFc' (например, при расщеплении пепсином или плазмином), Fd (например, при расщеплении пепсином, частичном восстановлении и реагрегации), фрагменты Fv или scFv (например, методами молекулярной биологии), и другие фрагменты (см., например, Colligan, Immunology, см. выше).

Такие фрагменты можно получить ферментативным расщеплением, синтетическими или рекомбинантными методами, известными в технике и/или описанными в данном описании. Антитела также можно получить во многих процессированных формах с использованием генов антител, в которых один или несколько стоп-кодонов введены в обратном направлении естественного сайта терминации. Например, можно создать комбинированный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(ab')2, для включения последовательностей ДНК, кодирующих CH1-домен и/или шарнирную область тяжелой цепи. Различные части антител можно соединить химически обычными методами или методами генной инженерии можно получить белок с определенной последовательностью.

Используемый в данном описании термин "человеческое антитело" относится к антителу, в котором, по существу, каждая часть белка (например, CDR, каркасный участок, домены CL, CH (например, СН1, СН2, СН3), шарнир (VL, VH)) является неиммуногенной для людей только с незначительными изменениями или вариациями последовательности. Подобным образом, антитела называемые антителами приматов (обезьяны, бабуина, шимпанзе и т.п.), грызуна (мыши, кролика, морской свинки, хомяка и т.п.) и других млекопитающих, означают такие специфические антитела вида, подрода, рода, подсемейства, семейства. Кроме того, химерные тела включают любую комбинацию вышеназванных антител. Такие изменения или вариации необязательно, и предпочтительно, сохраняют или снижают иммуногенность в отношении людей или других видов, по сравнению с немодифицированными антителами. Таким образом, человеческие антитела отличаются от химерных или гуманизированных антител. Отмечается, что человеческие антитела могут продуцироваться животными, не относящимися к человеку, или прокариотическими или эукариотическими клетками, способными экспрессировать гены функциональности реаранжированного иммуноглобулина человека (например, тяжелой цепи и/или легкой цепи). Кроме того, когда человеческое антитело представляет собой одноцепочечное антитело, оно может содержать линкерный пептид, не обнаруживаемый в нативных человеческих антителах. Например, Fv может содержать линкерный пептид, такой как от двух до примерно восьми остатков глицина или других аминокислот, связывающий вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. Считают, что такие линкерные пептиды происходят от человека.

Можно также использовать биспецифические, гетероспецифические, гетероконъюгированные или подобные антитела, являющиеся моноклональными, предпочтительно человеческими антителами или гуманизированными, обладающие специфичностями связывания с по меньшей мере двумя различными антигенами. В данном случае одна из специфичностей связывания существует для по меньшей мере одного белка TNF, другая специфичность - для любого другого антигена. Способы получения биспецифических антител известны в технике. Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител основывается на совместной экспрессии двух пар тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина, где две тяжелые цепи имеют различные специфичности (Milstein and Cuello, Nature, 305:537 (1983)). Из-за случайного выбора тяжелых и легких цепей иммуноглобулина такие гибридомы (квадромы) продуцируют возможную смесь молекул 10 различных антител, из которых только одна имеет правильную биспецифическую структуру. Очистка нужных молекул, которую обычно проводят на стадиях аффинной хроматографии, весьма громоздкая, а выход продукта низкий. Подобные процедуры описываются, например, в WO 93/08829, патентах США №№ 6210668, 6193967, 6132992, 6106833, 6060285, 6037453, 6010902, 5989530, 5959084, 5959083, 5932448, 5833985, 5821333, 5807706, 5643759, 5601819, 5582996, 5496549, 4676980, WO 91/00360, WO 92/00373, ЕР 03089, Traunecker et al., EMBO J., 10:3655 (1991), Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986), включенных в данное описание в качестве ссылок.

Антитела против TNF (также называемые антителами против TNF), полезные в способах и композициях настоящего изобретения, можно, необязательно, охарактеризовать высокой аффинностью связывания с TNF и, необязательно и предпочтительно, как имеющие низкую токсичность. В частности, в настоящем изобретении полезны антитела, специфические фрагменты или варианты по изобретению, где отдельные компоненты, такие как вариабельная область, константная область и каркасный участок, отдельно и/или коллективно, необязательно и предпочтительно, обладают низкой иммуногенностью. Антитела, которые можно использовать в изобретении, необязательно, характеризуются своей способностью оказывать лечебное действие на пациентов в течение длительного периода с поддающимся оценке смягчением симптомов и низкой и/или приемлемой токсичностью. Низкая или приемлемая иммуногенность и/или высокая аффинность, а также другие подходящие свойства, могут вносить вклад в достигаемые результаты лечения. "Низкая иммуногенность" в данном случае определяется как появление достаточных реакций НАНА, НАСА или НАМА у менее 75%, или предпочтительно - у менее 50%, пациентов, которых лечат, и/или появление у пациента низких титров (менее примерно 300, предпочтительно - менее примерно 100, при измерении иммуноферментным анализом методом двойных антигенов) (Elliott et al., Lancet, 344:1125-1127 (1994), работа включена в данное описание в качестве ссылки).

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно использовать для получения по меньшей мере одного антитела против TNF или его специфического варианта, которые можно использовать для измерения или воздействия на клетку, орган или животное (включая млекопитающих и людей), для диагностики, контроля, модуляции, лечения, облегчения, в помощь для предупреждения распространения или ослабления симптомов по меныцей мере одного связанного с TNF состояния, выбранного из числа по меньшей мере одного иммунного нарушения или заболевания, сердечно-сосудистого нарушения или заболевания, инфекции, злокачественности и/или неврологического нарушения или заболевания, и других расстройств и заболеваний.

Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело против TNF, в клетку, ткань, орган, животному или пациенту, нуждающемуся в такой модуляции, лечении, облегчении, предупреждении или ослаблении симптомов, действий или механизмов. Эффективное количество может включать количество в примерно 0,001-500 мг/кг на однократное (например, болюсное), многократное или непрерывное введение, или для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл сыворотки на однократное, многократное или непрерывное введение, или в любом эффективном интервале или величине в нем, установленных и определенных с использованием известных способов, описанных в данном описании или известных в технике.

Все публикации или патенты, цитированные в данном описании, включены в него в качестве ссылок, так как указывают на состояние уровня техники на момент создания настоящего изобретения, и/или относятся к описанию и возможностям настоящего изобретения. Публикации относятся к любым научным и патентным публикациям или любой другой информации, доступной в любом информационном формате, включая все записанные, электронные или печатные форматы. Перечисленные далее работы Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001);

Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1997-2001).

По меньшей мере одно антитело против TNF настоящего изобретения может, необязательно, продуцироваться клеточной линией, смешанной клеточной линией, иммортализованной клеточной линией или клональной популяцией иммортализованных клеток, хорошо известных в технике. См., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1997-2001); работы включены в данное описание в качестве ссылок.

Человеческие антитела, специфические к белкам TNF человека или их фрагментам, можно создать против соответствующего иммунногенного антигена, такого как выделенный белок TNF и/или его часть (включая синтетические молекулы, такие как синтетические пептиды). Подобным образом можно создать генерализованные антитела других млекопитающих. Получение иммунногенных антигенов и получение моноклональных антител можно осуществить с использованием любых подходящих методов.

При одном из подходов получают гибридому посредством слияния подходящей иммортализованной клеточной линии (например, миеломной клеточной линии, такой как, но без ограничений, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, 243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2SA5, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A или подобной, или другой, или гетеромиелом, продуктов их слияния или любых образованных из них гибридных клеток) или любой подходящей клеточной линии, известной в технике (см., например, www.atcc.org, www.lifetech.com., и т.п.), с клетками, продуцирующими антитела, такими как, без ограничений, выделенные или клонированные клетки селезенки, периферической крови, лимфы, миндалин или другие В-клетки, или любыми другими клетками, экспрессирующими константную или вариабельную области или каркасный участок или последовательности CDR тяжелой или легкой цепи, или эндогенные или гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как рекомбинантные или эндогенные, вирусные, бактериальные, водорослей, прокариотические, амфибий, насекомых, рептилий, рыб, млекопитающих, грызунов, лошадиные, овечьи, козьи, приматов, эукариотические, геномная ДНК, кДНК, рДНК, митохондриальная ДНК или РНК, хлоропластовая ДНК или РНК, гяРНК, мРНК, тРНК, одноцепочечные, двухцепочечные или трехцепочечные, гибридизированные и т.п., или любое их сочетание. См., например, Ausubel, см. выше, и Colligan, Immunology, см. выше, глава 2, включена в данное описание в качестве ссылки.

Клетки, продуцирующие антитела, также можно получить из периферической крови или, предпочтительно, селезенки или лимфоузлов людей или других подходящих животных, иммунизированных представляющими интерес антигенами. Любую другую подходящую клетку-хозяина также можно использовать для экспрессии гетерологичной или эндогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело настоящего изобретения, его специфический фрагмент или вариант. Слитые клетки (гибридомы) или рекомбинантные клетки можно выделить с использованием условий селективного культивирования или других известных способов, и клонировать путем предельного разведения или сортировки клеток или другими известными способами. Клетки, продуцирующие антитела с нужной специфичностью, можно отобрать подходящим методом анализа (например, ELISA).

Можно использовать другие подходящие способы получения или выделения антител с требуемой специфичностью, включая, но не ограничиваясь ими, способы, при которых отбирают рекомбинантные антитела из библиотеки пептидов или белков (например, библиотеки бактериофагов, рибосом, олигонуклеотидов, РНК, кДНК или подобной, или другой библиотеки; например, доступной от Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland UK; Biolnvent, Lund, Sweeden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkely, CA; Ixsys. См., например, ЕР 368684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/ 00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC);

WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US94/1234; WO92/18619; WO96/07754; (Scripps); EP 614989 (MorphoSys); WO95/16027 (Biolnvent); WO88/06630; WO90/3809 (Dayx); US 4704692 (Enzon);

PCT/US91/02989 (Affymax); WO 89/06283; EP 371998; EP 550400; (Xoma); EP 229046; PCT/US 91/ (Ixsys); или стохастически полученных пептидов или белков - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, ЕР 590689 (Ixsys, теперь Applied Molecular Evolution (AME)), все включены в настоящее описание в качестве ссылок, или способы, имеющие в основе иммунизацию животных (например, мышей SCID, Nguyen et al., Microbiol. Immunol., 41:901-907 (1997); Sandhu et al., Crit. Rev.

Biotechnol., 16:95-118 (1996); Eren et al., Immunol., 93:154-161 (1998), все работы включены в настоящее антител, известные в технике и/или описанные в данном описании. Такие методы включают воспроизведение рибосом (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); технологии получения антител из малого числа клеток (например, selected lymphocyte antibody method ("SLAM") (патент США № 5627052), Wen et al., J. Immunol., 17:887-892 (1987); Badcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996)); метод микрокапелек в геле и проточную цитометрию (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J.Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787-790 (1995)0; B-cell selection (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)).

Способы конструирования или гуманизации антител, отличных от человека и человека, также можно использовать, и они хорошо известны в технике. Как правило, гуманизированное или сконструированное антитело содержит один или несколько аминокислотных остатков из источника, не являющегося человеком, например, крысы, кролика, не являющегося человеком примата или другого млекопитающего. Такие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, взятыми, обычно, из "импортной" вариабельной, константной или другой области известной последовательности человека. Известные последовательности человеческого Ig описываются, например, в которые все полностью включены в данное описание в качестве ссылок.

Такие импортированные последовательности можно использовать для снижения иммуногенности или ослабления, усиления или изменения связывания, аффинности, ускорения, замедления, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других подходящих характеристик, как известно в технике. Как правило, сохраняются часть или все отличные от человеческих и человеческие CDR, в то время как отличные от человеческих последовательности вариабельной и константной областей заменяются на человеческие или другие аминокислоты. Антитела также можно, необязательно, гуманизировать с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для того, чтобы достичь такой цели, гуманизированные антитела можно, необязательно, получить способом анализа родительских последовательностей и различных концептуальных гуманизированных продуктов с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов обычно доступны и знакомы специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и отображающие трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов. Просмотр таких отображений позволяет проанализировать вероятную роль остатков в функционировании последовательностей-кандидатов иммуноглобулинов, т.е., проанализировать остатки, влияющие на способность иммуноглобулина-кандидата связываться со своим антигеном. Таким образом, можно выбрать остатки FR из консенсусной и импортной последовательностей и соединить, так что достигаются нужные характеристики антител, такие как повышенная аффинность в отношении антигена(ов)-мишени(ей). Как правило, остатки CDR прямо и весьма существенно вовлекаются во влияние на связывание антигена. Гуманизицию или инженерию антител настоящего изобретения можно осуществить с использованием любого известного способа, такого как способы, описанные в Winter (Jones et al., Nature, 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol., 151: (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 (1987); Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993), патенты США №№ 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539, 4816567, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, ЕР 229246, включенных в данное описание в качестве ссылок, включая ссылки, цитированные в них, и в других работах.

Антитела против TNF также можно получить, необязательно, путем иммунизации трансгенных животных (например, мыши, крысы, хомяка, примата, не относящегося к человеку, и т.п.), способных продуцировать спектр человеческих антител, как описывается в данном описании и/или как известно в технике. Клетки, продуцирующие антитела против TNF человека, можно выделить из таких животных и иммортализовать с использованием подходящих способов, таких как способы, описанные в данном описании.

Трансгенных мышей, которые могут продуцировать спектр человеческих антител, связывающихся с человеческими антигенами, можно получить известными способами (например, описанными в патентах США №№ 5770428, 5569825, 5545806, 5625126, 5625825, 5633425, 5661016 и 5789650, выданных Lonberg et al.;

включенных в данное описание в качестве ссылок, и в других работах). Как правило, такие мыши содержат по меньшей мере одну трансгенсодержащую ДНК по меньшей мере от одного локуса иммуноглобулина человека, который функционально реаранжирован, или который может претерпевать функциональную реаранжировку. Эндогенные локусы иммуноглобулина в таких мышах можно разрушить или удалить для устранения способности животных продуцировать антитела, кодируемые эндогенными генами.

Скриниг антител на специфическое связывание с подобными белками или фрагментами можно удобно осуществить с использованием библиотек отображений пептидов. Такой способ включает скрининг больших коллекций пептидов на отдельные члены с нужными функцией или строением. Скрининг антител из библиотек отображений пептидов хорошо известен в технике. Отображенные пептидные последовательности могут иметь длину от 3 до 5000 или более аминокислот, часто - 5-100 аминокислот, и часто - от примерно 8 до 25 аминокислот.

Кроме методов прямого химического синтеза получения пептидных библиотек описаны некоторые методы рекомбинантных ДНК. Один тип включает отображение пептидной последовательности на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую определенную отображенную пептидную последовательность. Такие способы описываются в патентных публикациях РСТ №№ 91/17271, 91/18980, 91/19818 и 93/08278. Другие системы получения библиотек пептидов содержат аспекты как химического синтеза in vitro, так и рекомбинантных способов. См. патентные публикации РСТ №№ - 11 и 96/19256. См. также патенты США №№ 5658754 и 5643768. Библиотеки отображений пептидов, вектор и набор для скрининга коммерчески доступны от таких поставщиков, как Invitrogen (Карлсбад, Калифорния) и Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). См., например, патенты США №№ 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, принадлежащие Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, принадлежащие Dyax, 5427908, 5580717, принадлежащие Affymax; 5885793, принадлежащий Cambridge antibody Technologies; 5750373, принадлежащий Genetech; 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, принадлежащие Xoma; Colligan, см. выше; Ausubel, см. выше; или Sambrook, см. выше; все перечисленные выше патенты и публикации включены в данное описание в качестве ссылок.

Антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против TNF, с целью получения трансгенных животных или млекопитающих, таких как козы, коровы, лошади, овцы и т.п., которые продуцируют такие антитела в своем молоке. Таких животных можно получить с использованием известных способов. См., например, патенты США №№ 5827690; 5849992; 4873316; 5849992; 5994616; 5565362; 5304489, и т.п., включенные в данное описание в качестве ссылок, и другие работы.

Антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело против TNF, с целью получения трансгенных растений и культивированных растительных клеток (например, табака, маиса и других), продуцирующих такие антитела, специфические части или варианты в частях растений или в клетках, культивируемых из них.

Как пример, не являющийся ограничением, листья трансгенного табака, экспрессирующие рекомбинантные белки, успешно используют для получения больших количеств рекомбинантных белков, например, с использованием индуцируемого промотора. См. Cramer et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 240:95- (1999) и цитированные в указанной работе ссылки. Также используют трансгенную кукурузу для экспрессии на коммерческих уровнях производства белков млекопитающих с биологическими активностями, равноценными активностям, получаемым в других рекомбинантных системах или выделенных в чистом виде из природных источников. См., например, Hood et al., Adv. Exp. Med. Biol., 464:127-147 (1999), и цитированные в указанной работе ссылки. Антитела, в том числе фрагменты антител, такие как одноцепочечные антитела (scFv), получают в больших количествах также из семян трансгенных растений, включая семена табака и клубни картофеля. См., например, Conrad et al., Plant. Mol. Biol., 38:101- (1998), и цитированные в указанной работе ссылки. Таким образом, антитела настоящего изобретения также можно получить с использованием трансгенных растений согласно известным способам. См. также Fischer et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 30:99-108 (Oct., 1999), Ma et al., Trends Biotechnol., 13:522- (1995); Ma et al., Plant. Physiol., 109:341-6 (1995); Whitelam et al., Biochem. Soc. Trans., 22:940-944 (1994);

и ссылки, цитированные в указанных работах. См. также литературу для общего представления об экспрессии антител растениями, и не только. Каждая из указанных выше ссылок включена в данное описание в качестве ссылки.

Антитела изобретения могут связываться с TNF человека в широком интервале аффинности (KD). В предпочтительном варианте по меньшей мере одно человеческое mAb настоящего изобретения может, необязательно, связываться с TNF человека с высокой аффинностью. Например, человеческое mAb может связываться с TNF человека с KD, по величине равным или меньше примерно 10-7 М, таким как, без ограничений 0,1-9,9 (или любого интервала или величины в указанном пределе) х 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13 или любого интервала или величины в указанном пределе.

Аффинность или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально с использованием любого подходящего способа. (См., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions", в Fundamental Immunology, Paul W.E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis, Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, NY (1992); и способы, описанные в данном описании). Измеряемая аффинность взаимодействия конкретных антитела и антигена может изменяться, если измеряется в разных условиях (например, таких как концентрация соли, рН). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Ka, Kd) осуществляют, предпочтительно, в стандартных растворах антител и антигенов и стандартном буфере, таком как буфер, описанный в данном описании.

С использованием приведенных в данном описании сведений, таких как о нуклеотидных последовательностях, кодирующих по меньшей мере 70-100% последовательных аминокислот по меньшей мере одной из SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, их специфических фрагментах, вариантах или консенсусных последовательностях, или депозитном векторе, содержащем по меньшей мере одну из таких последовательностей, можно получить молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей по меньшей мере одно антитело против TNF, с использованием способов, описанных в данном описании или известных в технике.

Молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут находиться в форме РНК, такой как мРНК, гяРНК, тРНК, или любой другой форме, или в форме ДНК, в том числе кДНК и геномной ДНК, или другой ДНК, полученной клонированием или полученной синтетически или любыми их сочетаниями. ДНК может являться трехцепочечной, двухцепочечной или одноцепочечной, или представлять любое их сочетание. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может представлять собой кодирующую цепь, также известную как смысловая цепь, или она может представлять собой некодирующую цепь, также известную как антисмысловая цепь.

Выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения могут являться молекулами нуклеиновых кислот, содержащими открытую рамку считывания (ORF), необязательно, с одним или несколькими интронами, например, по меньшей мере одной специфической частью по меньшей мере одного CDR, например, CDR1, CDR2 и/или CDR3, по меньшей мере одной тяжелой цепи (например, SEQ ID NO: 1-3) или легкой цепи (например, SEQ ID NO: 4-6), или другими интронами; молекулами нуклеиновых кислот, содержащими кодирующую последовательность для антитела против TNF или вариабельной области (например, SEQ ID NO: 7,8); и молекулами нуклеиновых кислот, содержащими нуклеотидную последовательность, по существу, отличающуюся от описанных выше, но которая, из-за вырожденности генетического кода, еще кодирует по меньшей мере одно антитело против TNF, описанное в данном описании и/или известное в технике. Конечно, генетический код хорошо известен в технике. Таким образом, для специалиста в данной области техники будет самым обычным делом получение таких вырожденных вариантов нуклеиновых кислот, кодирующих специфические антитела против TNF настоящего изобретения. См., например, Ausubel et al., см. выше, и такие варианты нуклеиновых кислот включены в настоящее изобретение. Не являющиеся ограничительными примеры выделенных молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, соответствующие не являющимся ограничительными примерам нуклеиновой кислоты, кодирующей, соответственно, НС CDR1, НС CDR2, НС CDR3, LC CDR1, LC CDR2, LC CDR3, вариабельную область НС и вариабельную область LC.

В другом аспекте изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих антитело против TNF с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеиновой кислотой, содержащейся в плазмиде.

Как указывается в данном описании, молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретения, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело против TNF, могут включать, но не ограничиваться перечисленным, молекулы, сами кодирующие аминокислотную последовательность фрагмента антитела; кодирующую последовательность для всего антитела или его части; кодирующую последовательность для антитела, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, такие как кодирующая последовательность по меньшей мере одной сигнальной последовательности или слитого пептида, с или без вышеуказанных дополнительных кодирующих последовательностей, таких как по меньшей мере один интрон, вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая, но не ограничиваясь перечисленным, некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслируемые последовательности, которые играют роль при транскрипции, процессировании мРНК, включая сплайсинг, и сигналы полиаденилирования (например, связывания рибосом и устойчивости мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, кодирующую дополнительные аминокислоты, такие как обеспечивающие дополнительные функциональности. Таким образом, последовательность, кодирующая антитело, может быть слита с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, что облегчает очистку слитых антител, содержащих фрагменты или части антител.

Полинуклеотиды, селективно гибридизующиеся с полинуклеотидом, описанным Настоящее изобретение относится к выделенным нуклеиновым кислотам, гибридизурующимся в условиях селективной гибридизации с полинуклеотидом, описанным в данном описании. Таким образом, полинуклеотиды в таком варианте можно использовать для выделения, детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды настоящего изобретения можно использовать для идентификации, выделения или амплификации неполных или полноразмерных клонов в депонированной библиотеке. В некоторых вариантах полинуклеотиды представляют собой геномные последовательности или последовательности кДНК, выделенные или иным образом комплементарные кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.

Предпочтительно, библиотека кДНК содержит по меньшей мере 80% полноразмерных последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 85 или 90% полноразмерных последовательностей, и предпочтительнее по меньшей мере 95% полноразмерных последовательностей. Библиотеки кДНК можно нормализовать для повышения представления редких последовательностей. Условия гибридизации низкой или умеренной жесткости как правило, но не исключительно, используются с последовательностями с пониженной идентичностью последовательности относительно комплементарных последовательностей. Условия умеренной и высокой жесткости можно использовать, необязательно, в случае последовательностей большей идентичности. Условия низкой жесткости допускают селективную гибридизацию последовательностей с примерно 70% идентичностью последовательностей и могут использоваться для идентификации ортологичных или паралогичных последовательностей.

- 13 Необязательно, полинуклеотиды данного изобретения будут кодировать по меньшей мере часть антитела, кодируемого полинуклеотидами, описанными в данном описании. Полинуклеотиды данного изобретения включают нуклеотидные последовательности, которые можно использовать для селективной гибридизации с полинуклеотидом, кодирующим антитело настоящего изобретения. См., например, Ausubel, см. выше; Colligan, см. выше, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно создать с использованием (а) рекомбинантных методов, (b) синтетических методов, (с) методами очистки или их сочетанием, хорошо известными в технике.

Обычно нуклеиновые кислоты могут содержать последовательности в дополнение к полинуклеотиду настоящего изобретения. Например, в нуклеиновую кислоту можно встроить сайт множественного клонирования, содержащий одну или несколько эндонуклеаз, для того, чтобы способствовать выделению полинуклеотида. Также можно встроить транслируемые последовательности для того, чтобы способствовать выделению транслируемого полинуклеотида настоящего изобретения. Например, гексагистидиновая маркерная последовательность является удобным средством для очистки белков настоящего изобретения. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения, исключая кодирующую последовательность, представляет собой, необязательно, вектор, адаптор или линкер для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида настоящего изобретения.

Можно добавить дополнительные последовательности к таким клонирующим и/или экспрессирующим последовательностям, с целью оптимизации их функции при клонировании и/или экспрессии, для того, чтобы способствовать выделению полинуклеотида, или с целью улучшения введения полинуклеотида в клетку. Использование клонирующих векторов, экспрессирующих векторов и линкеров хорошо известно в технике (см., например, Ausubel, см. выше; или Sambrook, см. выше).

Рекомбинантные способы конструирования нуклеиновых кислот Выделенные композиции нуклеиновых кислот данного изобретения, таких как РНК, кДНК, геномная ДНК или любое их сочетание, можно получить из биологических источников с использованием любого числа методологий клонирования, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах олигонуклеотидные зонды, селективно гибиридизирующие с полинуклеотидами настоящего изобретения в условиях высокой жесткости, используют для идентификации нужной последовательности в библиотеке кДНК или геномной ДНК. Выделение РНК и конструирование библиотек кДНК и ДНК хорошо известно рядовым специалистам в данной области техники (см., например, Ausubel, см. выше;

или Sambrook, см. выше).

Библиотеку кДНК или геномную библиотеку можно скринировать с использованием зонда на основе последовательности полинуклеотида настоящего изобретения, как описано в данном описании. Зонды можно использовать для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в одних и тех же или разных организмах. Специалистам в данной области техники будет понятно, что при анализе можно использовать различную степень жесткости; и жесткой может быть среда или для гибридизация или для промывки. Так как условия гибридизации становятся более жесткими, должна существовать большая степень комплементарности между зондом и мишенью для того, чтобы происходило образование дуплекса. Степень жесткости можно регулировать с помощью одного или нескольких факторов, таких как температура, ионная сила, рН и наличие растворителя для неполной денатурации, такого как формамид. Например, жесткость гибридизации обычно изменяют путем изменения полярности реагирующего раствора через, например, манипуляции с концентрацией формамида в интервале от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичность последовательностей), требуемая для детектируемого связывания, будет изменяться в соответствии с жесткостью среды для гибридизации и/или среды для промывки. Степень комплементарности оптимально будет составлять 100% или 70-100%, или любой интервал или величину в указанных пределах. Однако следует представлять, что незначительные изменения последовательности в зондах и праймерах можно компенсировать снижением жесткости среды для гибридизации и/или промывки.

Способы амплификации РНК или ДНК хорошо известны в технике и могут использоваться согласно настоящему изобретению без излишнего экспериментирования на основании указаний, представленных в данном описании.

Известными способами амплификации ДНК или РНК являются полимеразная цепная реакция (ПЦР) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США №№ 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Mullis et al.; 4795699 и 4921794, Tabor et al.; 5142033, Innis; 5122464, Wilson et al.;

5091310, Innis; 5066584, Gyllensten et al.; 4889818, Gelfand et al.; 4994370, Silver et al.; 4766067, Biswas;

4656134, Ringold), и амплификация, опосредуемая РНК, при которой используют РНК, антисмысловую к последовательности-мишени, в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК (патент США № 5130238, Malek et al., торговое наименование NASBA) (все указанные ссылки внесены в данное описание в качестве ссылок, см., например, Ausubel, см. выше; или Sambrook, см. выше), и другие способы.

Например, технологию полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно использовать для амплификации последовательностей полинуклеотидов настоящего изобретения и родственных генов непосредственно из библиотек геномной ДНК или кДНК. ПЦР и другие способы амплификации in vitro также могут быть полезны, например, для клонирования последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих экспрессируемые белки, для получения нуклеиновых кислот для применения в качестве зондов для детекции присутствия нужной РНК в образцах, для секвенирования нуклеиновых кислот или для других целей. Примеры методов, достаточные для ориентации специалистов в способах амплификации in vitro, имеются в Berger, см. выше, Sambrook, см. выше, а также в Mullis et al., патент США № 4683202 (1987), и Innis et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds, Academic Press Inc., San Diego, CA (1990). Коммерчески доступные наборы для геномной ПЦР-амплификации известны в технике. См., например, набор для геномной ПЦР Advantage-GC (Clontech). Кроме того, для улучшения выхода длинных продуктов ПЦР можно использовать белок Т4 гена 32 (Boehringer Mannheim).

Синтетические способы конструирования нуклеиновых кислот Выделенные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно также получить прямым химическим синтезом известными способами (см., например, Ausubel, см. выше). Химический синтез, как правило, дает одноцепочечные олигонуклеотиды, которые можно превратить в двухцепочечную ДНК методом гибридизации с комплементарной последовательностью или полимеризацией с ДНКполимеразой с использованием одной цепи в качестве матрицы. Специалисту в данной области техники будет понятно, что хотя химический синтез ДНК может быть ограничен последовательностями в примерно 100 или больше оснований, можно получить более длительные последовательности лигированием более коротких последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным экспрессирующим кассетам, содержащим нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, например, кДНК, или геномную последовательность, кодирующую антитело настоящего изобретения, можно использовать для конструирования рекомбинантной экспрессирующей кассеты, которую можно ввести в по меньшей мере одну клетку-хозяина. Рекомбинантная экспрессирующая кассета обычно будет содержать полинуклеотид настоящего изобретения, оперативно соединенный с регуляторными последовательностями инициации транскрипции, которые будут управлять транскрипцией полинуклеотида в предполагаемой клетке-хозяине. Как гетерологичные, так и негетерологичные (т.е., эндогенные) промоторы можно использовать для управления экспрессией нуклеиновых кислот настоящего изобретения.

В некоторых вариантах выделенные нуклеиновые кислоты служат в качестве промоторов, эхансеров или других элементов, которые можно ввести в соответствующую позицию (в обратном направлении, в прямом направлении или в интрон) негетерологичной формы полинуклеотида настоящего изобретения таким образом, чтобы положительно или отрицательно регулировать экспрессию полинуклеотида настоящего изобретения. Например, эндогенные промоторы можно изменить in vivo или in vitro путем мутации, делеции и/или замены.

Настоящее изобретение также относится к векторам, включающим нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, клеткам-хозяевам, генетически созданным с помощью рекомбинантных векторов, и получению по меньшей мере одного антитела против TNF рекомбинантными методами, хорошо известными в технике. См., например, Sambrook et al., см. выше; Ausubel et al., см. выше; работы, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Полинуклеотиды, необязательно, можно соединить с вектором, содержащим селектируемый маркер для размножения в хозяине. Как правило, плазмидный вектор вводят в преципитат, такой как кальцийфосфатный преципитат, или в комплекс с нагруженным липидом. Если вектор представляет собой вирус, его можно упаковать in vitro с использованием соответствующей пакующей клеточной линии и затем трансдуцировать в клетки-хозяева.

ДНК-вставка должна оперативно связываться с соответствующим промотором. Экспрессирующие конструкции также будут содержать сайты для инициации транскрипции, терминации и, в транскрибируемом участке, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессированных конструкциями, будет, предпочтительно, включать инициацию трансляции в начале и кодон терминации (например, UAA, UGA или UAG), соответственно располагающиеся в конце транслируемой мРНК, с UAA и UAG, предпочтительными для экспрессии клеток млекопитающих или эукариот.

Экспрессирующие векторы, предпочтительно, но необязательно, будут включать по меньшей мере один селектируемый маркер. Такие маркеры включают, но не ограничиваются перечисленным, гены устойчивости к метотрексату (МТХ), дигидрофолатредуктазе (DHFR, патенты США №№ 4399216;

4634665; 4656134; 4956288; 5149636; 5179017), ампициллину, неомицину (G418), микофеноловой кислоте или глутаминсинтетазе (GS, патенты США №№ 5122464; 5770359; 5827739) для культуры эукариотических клеток и гены устойчивости к ампициллину для культивирования в Е. coli и других бактериях или прокариотах (вышеперечисленные патенты включены в данное описание в качестве ссылок). Соответствующие культуральные среды и условия для вышеописанных клеток-хозяев известны в технике. Подходящие векторы будут очевидны для специалистов. Введение векторной конструкции в клетку-хозяина можно осуществить кальцийфосфатной трансфекцией, опосредованной DEAE-декстраном трансфекцией, опосредованной катионным липидом трансфекцией, электропорацией, трансдукцией, инфицированием или другими известными способами. Такие способы описаны, например, в Sambrook, см. выше, главы 1- и 16-18; в Ausubel, см. выше, главы 1, 9, 13, 15, 16.

По меньшей мере одно антитело настоящего изобретения можно экспрессировать в модифицированной форме, такой как слитый белок, и можно включить не только сигналы секреции, но также дополнительные гетерологичные функциональные участки. Например, участок дополнительных аминокислот, в частности заряженных аминокислот, можно добавить к N-концу антитела для улучшения устойчивости и сохранности в клетке-хозяине, во время очистки или во время последующих операций и хранения.

Также к антителу настоящего изобретения можно добавить пептидные группы для облегчения очистки.

Такие участки можно удалить до окончательного получения антитела или по меньшей мере одного его фрагмента. Такие способы описываются во многих известных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, см. выше, главы 17.29-17.42 и 18.1-18.74; Ausubel, выше, главы 16, 17 и 18.

Рядовым специалистам в данной области техники известны многочисленные экспрессирующие системы, доступные для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей белок настоящего изобретения.

С другой стороны, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения можно экспрессировать в клеткехозяине, манипулируя клеткой-хозяином, содержащим эндогенную ДНК, кодирующую антитело настоящего изобретения. Такие способы хорошо известны в технике, например, описанные в патентах США №№ 5580734, 5641670, 5733746 и 5733761, включенных в данное описание в качестве ссылок.

Примерами клеточных культур, полезных для продуцирования антител, их специфических частей или вариантов являются клетки млекопитающих. Системы клеток млекопитающих часто будут находиться в форме монослоев клеток, хотя также можно использовать суспензии клеток млекопитающих или биореакторы. В технике разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных экспрессировать интактные гликозилированные белки, в том числе, клеточные линии COS-1 (например, АТСС CRL 1650), COS-7 (например, АТСС CRL 1651), НЕК293, ВНК21 (например, АТСС CRL-10), СНО (например, АТСС CRL 1610) и BSC-1 (например, АТСС CRL-26), клетки Cos-7, клетки СНО, клетки hep G2, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, клетки 293, клетки Hela и т.п., которые легко доступны, например, от Американской коллекции типовых культур, Manassas, Va (www.atcc.org). Предпочтительными клеткамихозяевами являются клетки лимфоидного происхождения, такие как миеломные и лимфомные клетки.

Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки P3X63Ag8.653 (ATCC, инвентарный № CRL-1580) и клетки SP2/0-Agl4 (ATCC, инвентарный № CRL-1851). В особенно предпочтительном варианте рекомбинантной клеткой является клетка Р3Х63Ab8.653 или клетка SP2/0-Ag14.

Экспрессирующие векторы для указанных клеток могут включать одну или несколько из перечисленных далее регулирующих экспрессию последовательностей, таких как сайт начала репликации; промотор (например, поздние или ранние промоторы SV40, промотор CMV (патенты США №№ 5168062;

5385839), промотор HSV tk, промотор pgk (фосфоглицераткиназа), промотор EF-1-альфа (патент США № 5266491), по меньшей мере один промотор иммуноглобулина человека); энхансер и/или процессингинформирующие сайты, такие как сайты связывания рибосом, сайты РНК-сплайсинга, сайты полиаденилирования (например, сайт присоединения большого T-Ag-поли-А SV40), и последовательности терминаторов транскрипции. См., например, Ausubel, см. выше; Sambrook, см. выше. Другие клетки, полезные для получения нуклеиновых кислот или белков настоящего изобретения, известны и/или доступны, например, из каталога клеточных линий и гибридом Американской коллекции типовых культур (www.atcc.org) или других известных или коммерческих источников.

Когда используют эукариотические клетки в качестве хозяев, в вектор обычно включают последовательности полиаденилирования или терминации транскрипции. Примером терминаторной последовательности является последовательность полиаденилирования из гена гормона роста коровы. Также можно включать последовательности для точного сплайсинга транскрипта. Примером сплайсингпоследовательности является интрон VP1 из SV40 (Sprague et al., J. Virol., 45:773-781 (1983)). Кроме того, в вектор можно ввести последовательности генов для регулирования репликации в клетке-хозяине, известные в технике.

Антитела против TNF можно извлечь из рекомбинантных клеточных культур и очистить хорошо известными способами, включая очистку с протеином А, осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите и хроматографию на лектинах, и другие способы. Для очистки также можно использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию ("ВЭЖХ"). См., например, Colligan, Current Protocols in Immunology, или Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY (1997-2001), например, главы 1, 4, 6, 8, 9, 10, включенные в данное описание в качестве ссылок.

Антитела настоящего изобретения включают очищенные природные продукты, продукты химического синтеза и продукты, полученные рекомбинантными методами из эукариотного хозяина, в том числе, например, из клеток дрожжей, высшего растения, насекомого и млекопитающего. В зависимости от хозяина, используемого при получении рекомбинантным способом, антитела настоящего изобретения могут быть гликозилированными или негликозилированными, и гликозилированные предпочтительнее.

Такие способы описываются во многих известных лабораторных руководствах, таких как Sambrook, см.

выше, разделы 17.37-17.42; Ausubel, см. выше, главы 10, 12, 13, 15, 16, 18 и 20; Colligan, Protein Science, см. выше, главы 12-14, которые все включены в данное описание в качестве ссылок.

Выделенные антитела настоящего изобретения содержат аминокислотные последовательности антител, описанные в данном описании, кодируемые любым подходящим полинуклеотидом, или любые выделенные или полученные антитела. Предпочтительно, человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с TNF человека и посредством этого частично или полностью нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка. Антитело или его специфическая часть или вариант, которые частично или, предпочтительно, полностью нейтрализует по меньшей мере одну биологическую активность белка TNF или фрагмента, могут связываться с белком или фрагментом и посредством этого ингибируют активности, опосредуемые через связывание TNF с рецептором TNF или через другие TNF-зависимые или опосредуемые механизмы. Используемый в данном описании термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу, которое может ингибировать TNF-зависимую активность примерно на 20-120%, предпочтительно, по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или более, в зависимости от анализа. Способность антитела против TNF ингибировать TNF-зависимую активность оценивают, предпочтительно, методом по меньшей мере одного подходящего анализа белка или рецептора, описанным в данном описании и/или известным в технике. Человеческое антитело по изобретению может быть любого класса (IgG, IgA, IgM, IgE, IgD и т.п.) или изотипа и может содержать легкую цепь каппа или лямбда. В одном варианте человеческое антитело содержит тяжелую цепь IgG или определенный фрагмент, например, по меньшей мере одного из изотипов IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела такого типа можно получить, используя трансгенную мышь или другое трансгенное млекопитающее, не относящееся к человеку, содержащее трансгены с по меньшей мере одной человеческой легкой цепью (например, IgG, IgA и IgM (например, D1, D2, D3, D4), описанные в данном описании и/или известные в технике. В другом варианте человеческое антитело против TNF человека содержит тяжелую цепь IgGl и легкую цепь IgGl.

По меньшей мере одно антитело изобретения связывается с по меньшей мере одним специфическим эпитопом, специфическим к по меньшей мере одному белку TNF, его субъединице, фрагменту, части или любому их сочетанию. По меньшей мере один эпитоп может содержать по меньшей мере один антителосвязывющий участок, содержащий по меньшей мере одну часть указанного белка, где эпитоп, предпочтительно, состоит из по меньшей мере одной внеклеточной, растворимой, гидрофильной, внешней или цитоплазматической части указанного белка. По меньшей мере один специфический эпитоп может содержать любую комбинацию от по меньшей мере одной аминокислотной последовательности из по меньшей мере 1-3 аминокислот до полной специфической части последовательных аминокислот SEQ ID No: 9.

Как правило, человеческое антитело или антигенсвязывающий фрагмент настоящего изобретения будет содержать по меньшей мере один человеческий гипервариабельный участок (CDR1, CDR2 и CDR3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области тяжелой цепи, и по меньшей мере один человеческий гипервариабельный участок (CDR1, CDR2 и CDR3) или вариант по меньшей мере одной вариабельной области легкой цепи. Как пример, не являющийся ограничением, антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант могут содержать по меньшей мере одну тяжелую цепь CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 3 и/или легкую цепь CDR3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID No: 6. В частном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут содержать антигенсвязывающий участок, содержащий по меньшей мере часть по меньшей мере одной тяжелой цепи CDR (т.е., CDR1, CDR2 и/или CDR3) с аминокислотной последовательностью, соответствующей CDR 1, 2 и/или 3 (например, SEQ ID NO: 1, 2 и/или 3). В другом частном варианте антитело или антигенсвязывающий фрагмент или вариант могут содержать антигенсвязывающий участок, содержащий по меньшей мере часть по меньшей мере одной легкой цепи CDR (т.е., CDR1, CDR2 и/или CDR3) с аминокислотной последовательностью, соответствующей CDR 1, 2 и/или 3 (например, SEQ ID No: 4, и/или 6). В предпочтительном варианте три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента имеют аминокислотную последовательность, соответствующую CDR по меньшей мере одного mAb TNV148, TNV14, TNV15, TNV196, TNV118, TNV32, TNV86, описанных в данном описании. Такие антитела можно получить, соединяя химически различные части (например, CDR, каркасный участок) антитела с использованием обычных методов, путем получения и экспрессии (т.е., одной или нескольких) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, с использованием обычных методов технологии рекомбинантных ДНК, или используя любой другой подходящий способ.



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«Сергей Довлатов Соло на IВМ Серия Записные книжки, книга 2 Аннотация Записные книжки Сергей Довлатов подготовил к изданию незадолго до своей смерти в 1990 году. Они состоят из двух частей. Первая – Соло на ундервуде – перед этим публиковалась дважды (1980 и 1983), вторая – Соло на IВМ – была представлена читателям впервые. И сегодня в этих забавных микроновеллах отчетливо слышны неповторимые интонации довлатовского голоса, его искренний смех. Содержание *** 4 Сергей Довлатов Соло на IВМ ***...»

«№ 7 июль 2013 Корпоративное издание ОАО РУ-Энерджи Групп В симбиозе с государством КОЛОНКА ПРЕДСЕДАТЕЛЯ СОВЕТА ДИРЕКТОРОВ Президент РУ-Энерджи Групп принял участие в заседании по проблемам российского нефтесервиса и производителей нефтегазового оборудования в Госдуме. Уважаемые коллеги! Поздравляю вас с сезоном отпусков! Ж елаю хорошего отдыха, чтобы осенью с новыми силами вы могли включиться в работу. Лето – замечательная пора. С одной стороны, это прекрасная возможность пообщаться с близкими...»

«Рабочая группа I КоК-НВО 16 апреля 2009 года Обсуждение проекта системы результатов (Стратегические цели и Функциональные цели) Исполнительное резюме После обсуждения на последнем заседании Рабочей Группы основных вопросов, касающихся уточнения системы результатов для установленных 11 Стратегических целей и 2 Функциональных целей и анализа двух примеров Стратегических целей, на рассмотрение и для критических замечаний (в Приложениях 2-14) Рабочей группы был представлен полный набор систем в...»

«МЕЖДУ МОГИЛОЙ И ТЮРЬМОЙ: Голубые глаза и горячая лобная кость. О. Мандельштама на пересечении поэтических кодов (Статья вторая 1 ) ЕВГЕНИЙ СОШКИН II Голубая версия глобальной тюрьмы Голубая тюрьма. Чтобы разобраться в этой формуле, нам потребуется поочередно рассмотреть обе ее лексических составляющих. Начнем с тюрьмы. В смысловом поле тюрьмы как метафизической величины можно выделить два основных направления, на которых логическим шагам будут соответствовать конкретные поэтические мотивы 2....»

«УТВЕРЖДЕН приказом Минобрнауки России от 22 августа 2008 г. N 242 АДМИНИСТРАТИВНЫЙ РЕГЛАМЕНТ исполнения Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки государственной функции по осуществлению контроля качества образования (в части федеральных государственных образовательных стандартов, федеральных государственных требований и образовательных стандартов и требований, самостоятельно устанавливаемых федеральными государственными образовательными учреждениями высшего профессионального...»

«МХТ 100 Настоящее издание – это переиздание оригинала, переработанное This edition is the republication of the original copy, edited for the use для использования в цифровом, а также в печатном виде, изда- in digital, and also in the printed form, published in the single copies ваемое в единичных экземплярах на условиях Print-On-Demand on the conditions of Print-On-Demand (requirements of press in the (печать по требованию в единичных экземплярах). Но это не single copies). This is not a...»

«Сергей Шоргин ВОРОЖБА Избранные поэтические переводы PUBLISHERS 2005 УДК 821.11/134 14 ББК 84(4) 5 Ш79 ОТ АВТОР А ОТ АВТОР А ОТ АВТОР А ОТ АВТОРА ОТ АВТОР А Дорогой читатель! Я собрал в этой книге значительную часть переводов, вы В оформлении обложки использована картина М.Чюрлёниса полненных мной начиная с 2001 года. Замечу, что основная часть Зима. II (Ziema. II) переводов появилась после марта 2003 года (интернетное зна комство с Евгением Владимировичем Витковским). Подробнее Литературный...»

«Диета для молодой мамы Каждая женщина хочет выглядеть идеально. Но идеальным должно быть не только лицо, но и фигура. Путь к успеху заключается в хорошо подобранной диете и спортивных занятиях. Но как быть молодым мамам? Женщинам, находящимся в положении или только что подаривших жизнь малышу? Для них тоже были разработаны специальные диеты. В этой книге вы сможете найти ответы на такие вопросы, как Что необходимо предпринять для того, чтобы сохранить форму после беременности? и Как, не...»

«Святая праведная блаженная Матрона Московская Краткое описание жизни, подвига и чудотворений блаженной старицы Все, все приходите ко мне и рассказывайте, как живой, о своих скорбях, я буду вас видеть, и слышать, и помогать вам 2014 г. http://svmatrona.ru Эта небольшая книга подготовлена по материалам сайта Святая Матрона Московская. Книга включает краткое описание жизни блаженной старицы, чудеса и подвиги, которые она совершала помогая людям. Включены также акафист и молитва Святой Матроне...»

«ИНФОРМАЦИОННЫЙ БЮЛЛЕТЕНЬ РБА № 59 Официальное издание Российской библиотечной ассоциации 2011 Издается с 1995 года ISSN 1991-8062 СОДЕРЖАНИЕ 48 в Диссертационном совете при 7 В РОССИЙСКОЙ БИБЛИОТЕЧНОЙ АССОЦИАЦИИ гпнтБ Со рАн в 2010 году. Е.Б. Артемьева 7 СовмеСтный проект FAIFE IFLA – рБА 51 БИБЛИОТЕЧНАЯ ПРОФЕССИЯ 7 руководство ИФЛА/ЮнеСко по 51 неЗАБывАемые ИменА манифесту ИФЛА об Интернете:...»

«СОДЕРЖАНИЕ Предисловие iv Участники издания vi Методология создания и программа обеспечения качества ix Аббревиатуры xiv ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ОНКОЛОГИИ Реабилитация онкологических больных Хронический болевой синдром в онкологии Серологические опухоль ассоциированные маркёры Лучевая терапия в онкологии ЧАСТНЫЕ ВОПРОСЫ ОНКОЛОГИИ Опухоли головы и шеи Рак гортани Рак щитовидной железы Злокачественные опухоли носа и околоносовых пазух Рак слизистой оболочки полости рта Рак губы Опухоли грудной полости Рак...»

«ЛАТВИЯ ПОД ВЛАСТЬЮ СОВЕТСКОГО СОЮЗА И НАЦИОНАЛ-СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ ГЕРМАНИИ 1940–1991 МУЗЕЙ ОККУПАЦИИ ЛАТВИИ 1 ЛАТВИЯ ПОД ВЛАСТЬЮ СОВЕТСКОГО СОЮЗА И НАЦИОНАЛ-СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ ГЕРМАНИИ 1940–1991 МУЗЕЙ ОККУПАЦИИ ЛАТВИИ Latvijas Okupcijas muzeja biedrba Общество Музея оккупации Латвии Рига, 2010 ЛАТВИЯ ПОД ВЛАСТЬЮ СОВЕТСКОГО СОЮЗА И НАЦИОНАЛ-СОЦИАЛИСТИЧЕСКОЙ ГЕРМАНИИ 1940– МУЗЕЙ ОККУПАЦИИ ЛАТВИИ LATVIJA...»

«Книга ДЕНЕГ. Версия 1.3 Оглавление Оглавление Нужны ли Вам деньги? А Вы готовы рисковать? Gold Line Что такое Gold Line Как работает Gold Line Регистрация в Gold Line Активация Доход от участия в системе Приглашение новых участников Как выводить деньги из Gold Line Способ первый – PIN код Способ второй – OkPay OKPAY Регистрация в OkPay Верификация счёта Заработок с OkPay Дебетовая карта OKPAY Как получать деньги, раздавая эту книгу Как рекламироваться Книга ДЕНЕГ предназначена для свободного...»

«Девственная природа Гайаны, 13 дней Вариант международного авиаперелета DL 31 01OCT SVOJFK 1255 1525 DL383 02OCT JFKGEO 0110 0700 DL384 14OCT GEOJFK 0808 1405 DL 30 14OCT JFKSVO 1710 1055 Подробная программа путешествия День 1 Джорджтаун, Гайана 0700 Прибытие в международный аэропорт Гайаны. 0715 Трансфер в Джорджтаун. 0800 Размещение в отеле и небольшой отдых после авиаперелета. 1400 Обед в отеле. Затем отправление на восток от Джорджтауна на экскурсию по наблюдению за обитателями местной...»

«ДЛЯ СПЕЦИАЛИСТОВ В ОБЛАСТИ БУХГАЛТЕРСКОГО УЧЕТА И ОТЧЕТНОСТИ МСФО (IAS) 28 Инвестиции в ассоциированные и совместные предприятия http://www.finotchet.ru/standard.html?id=19#tab3 2012г. МСФО (IAS) 28 Инвестиции в ассоциированные и совместные предприятия УЧЕБНЫЕ ПОСОБИЯ ПО МСФО (миллион скачанных копий) Вас приветствует пятый выпуск (2012 г.) учебных пособий по МСФО, выходящих в рамках проекта TACIS при поддержке Евросоюза! По сравнению с выпуском 2011 года были сделаны небольшие изменения, не...»

«УДК 597.6/.9:575.8 Е.М. Писанец, С.Н. Литвинчук, Ю.М. Розанов 2, 1 2 В.Ю. Реминный 1, Р.А. Пасынкова 2, Н.Н. Сурядная 3, А.С. Матвеев 4 Национальный научно-природоведческий музей НАН Украины, 1 ул. Б. Хмельницкого, 15, Киев, 01601, Украина E-mail: zoomus@museumkiev.org Институт цитологии Российской академии наук, 2 пр. Тихорецкий, 4, С.-Петербург, 194064, Россия E-mail: slitvinchuk@yahoo.com Отдел герпетологии НИИ биоразнообразия наземных и водных экосистем Украины при Мелитопольском...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИКАЗ от 17 октября 2013 г. N 1155 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО СТАНДАРТА ДОШКОЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ В соответствии с пунктом 6 части 1 статьи 6 Федерального закона от 29 декабря 2012 г. N 273-ФЗ Об образовании в Российской Федерации (Собрание законодательства Российской Федерации, 2012, N 53, ст. 7598; 2013, N 19, ст. 2326; N 30, ст. 4036), подпунктом 5.2.41 Положения о Министерстве образования и науки...»

«Авторы — руководители и специалисты ЛАНИТ — посвящают эту книгу 15 летию своей компании Lanit_BPM.indd 1 02.09.2004 15:31:58 Process Black Издание подготовлено при поддержке компании Hyperion Solutions Corp. Корпорация Hyperion — мировой лидер в области программного обеспечения для управления эффективностью деятельности (Business Performance Management, BPM). Более 9000 клиентов во всем мире уже сделали свой выбор в пользу решений Hyperion, благодаря которым они трансформируют стратегии в...»

«АлексАндр ЦыгАнков ТросТниковАя флейТА АЛЕКСАНДР ЦЫГАНКОВ ТРОСТНИКОВАЯ ФЛЕЙТА ПЕРВАЯ КНИГА СТИХОВ второе издание ББК 84.Р1 Ц22 Цыганков А.К. Тростниковая флейта. — Томск, издательство Ветер, 2005, 168 с. Оформление, иллюстрации и редакция текста — автора. ISBN 5-98428-009-4 © Цыганков А.К., 1995. © Цыганков А.К., 2005. Версия для электронной библиотеки ***** скромное ожерелье плеяд пощёлкивает бусинками звёзд северная корона размыкается и увеличивается в размерах звёздное вещество...»

«Администрация Озёрского городского округа Челябинской области Муниципальное специальное (коррекционное) образовательное учреждение для обучающихся, воспитанников с ограниченными возможностями здоровья “Специальная (коррекционная) общеобразовательная школа-интернат № 37 VIII вида” ПОРТФОЛИО учителя специального класса для детей с глубокой умственной отсталостью первой квалификационной категории Ивановой Ирины Ивановны г. Озрск 2011/2012 учебный год 1 Оглавление Раздел 1. Общие сведения об...»





Загрузка...



 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.