WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«Данная заявка содержит притязания на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США № 60/439918, поданной 14 января 2003г., полное содержание которой, таким ...»

-- [ Страница 1 ] --

009123

Данная заявка содержит притязания на приоритет предварительной заявки на выдачу патента США

№ 60/439918, поданной 14 января 2003г., полное содержание которой, таким образом, включено в виде

ссылки.

В данной заявке ссылки на различные публикации даны посредством полного цитирования. Описания указанных публикаций в полном объеме включены при этом в данную заявку в виде ссылки, чтобы

более полно описать состояние уровня техники, которое известно специалистам на дату изобретения, описанного и заявленного в данном описании.

Уровень техники Системная красная волчанка (СКВ) или волчанка является ослабляющим здоровье аутоиммунным заболеванием, характеризующимся наличием множества аутоантител, включая антитела к днДНК, к ядерным антигенам и к рибонуклеопротеинам. СКВ поражает примерно 1 из 2000 человек (в США 1 из 700 женщин). Заболевание, главным образом, поражает молодых женщин при соотношении женщин к мужчинам, составляющем примерно 9:1.

Системная красная волчанка может поражать почти любой орган или систему организма. Системная красная волчанка может включать периоды, когда выражено немного симптомов, если они вообще выражены ("ремиссия"), и другие периоды, когда заболевание становится более активным ("вспышка").

Наиболее часто, когда люди упоминают "волчанку", они относят ее к системной форме заболевания.

Кортикостероиды являются главной опорой при лечении системных аутоиммунных заболеваний.

Угрожающие жизни, приводящие к тяжелой инвалидности проявления СКВ лечат высокими дозами глюкокортикоидов (1-2 мг/кг/сутки). Нежелательные эффекты хронического введения глюкокортикоидов включают множество заметных неблагоприятных эффектов, таких как кушингоидный габитус, ожирение центрального действия, гипертония, инфекция, ломкость капилляров, гирсутизм, усиленный остеопороз, катаракты, сахарный диабет, миопатия и психоз. Кроме токсичности кортикостероидов соблюдение пациентами схемы дозирования также представляет собой серьезную проблему.

Для борьбы с активным заболеванием также используют цитотоксические агенты, снижающие частоту вспышек заболевания и уменьшающие потребность в стероидах. Нежелательные побочные эффекты последних включают угнетение костного мозга, повышенную частоту инфекций оппортунистическими организмами, необратимую недостаточность функции яичников, алопецию и повышенный риск злокачественных новообразований.

СКВ является воспалительным заболеванием, для которого до настоящего времени не существует определенного способа лечения или средства. Заболевание приводит к острым и хроническим осложнениям. Единственными способами лечения являются паллиативные способы, предназначенные для снятия острых симптомов и предотвращения хронических осложнений, часто с сильными побочными эффектами. Поэтому существует неудовлетворенная потребность в данной области, и врачи, и пациенты были бы рады новым способам лечения, которые потенциально могли бы устранить или уменьшить нежелательные проявления болезни.

Несмотря на всестороннее исследование механизмов, лежащих в основе индукции СКВ, информация об этиологии заболевания очень ограничена. До недавнего времени исследования СКВ проводились с использованием лимфоцитов периферической крови (PBL) пациентов на разных клинических стадиях и при использовании разных протоколов лечения. Альтернативно, в качестве модели СКВ исследовали линии мышей, у которых развивается спонтанное СКВ-подобное заболевание. Данный вид анализа приводит к неполным и запутанным интерпретациям роли различных иммунологических и неиммунологических факторов либо в индукции, либо в поддержании заболевания, главным образом, вследствие гетерогенности пациентов, с одной стороны, и невозможности контролировать фазу индукции заболевания в линиях мышей с СКВ, с другой стороны.

Несколько лет назад разработана модель СКВ на животных. В указанной модели, основанной на концепции идиотипической сети, формировался широкий спектр связанных с волчанкой аутоантител и клинические проявления (Mendlovic, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2260 (1988)). Индукцию осуществляли иммунизацией линий мышей, у которых не развивается какое-либо спонтанное аутоиммунное заболевание, с помощью человеческого моноклонального антитела против ДНК (мАт), которое несет общий идиотип, названный 16/6 Id (Shoenfeld, Y. et al., J. Exp. Med. 158: 718 (1983)).

Человеческое мАт 16/6 является анти-ДНК-антителом исходного изотипа IgM и в культуре переключаемого на IgG1. мАт получали от пациента, и они несут общий идиотип, 16/6 Id (Shoenfeld et al., 1983; Mendlovic et al., 1988). Клетки гибридомы, секретирующие указанное мАт, обычно выращивают в культуре и антитело выделяют из надосадков культур, используя аффинную колонку с белком G, связанным с сефарозой. Человеческое анти-ДНК-мАт 16/6 (IgG1/) описано в Shoenfeld, Y. et al., J. Clin. Invest.

70: 205-208 (1982) и в Waisman, A. et al., Int. Immunol. 7: 689-696 (1995).

После иммунизации мыши продуцировали антитела, специфичные по отношению к 16/6 Id, антитела, которые несут 16/6 Id, и антитела, направленные против разных ядерных антигенов (днДНК, онДНК, Sm, рибонуклеопротеидну (РНП), Ro, La и др.). Серологические данные были связаны с лейкопенией, повышенной скоростью оседания эритроцитов, протеинурией, избытком иммунных комплексов в почках и склерозом клубочков (Mendlovic et al., 1988), которые являются типичными проявлениями СКВ. Кроме -1того, было показано, что экспериментальное заболевание может быть индуцировано мышиным анти-16/ Id-мАт (Mendlovic, S. et al., Eur. J. Immunol. 19: 729 (1989)) и мышиным анти-анти-16/6 Id (16/6 Id+)-мАт (Waisman, A. et al., Internatl. Immunol. 5: 1293 (1993); Waisman, A. and Mozes, E. Eur. J. Immunol. 23: 1566, (1993)). Индукция заболевания регулируется генетически и, таким образом, зависит от линии (Mendlovic, S. et al., Immunology 69: 228 (1990)). Указанная уникальная модель индукции экспериментальной СКВ обеспечивает подходящие средства для ясного анализа различных стадий и связанных иммунных параметров, вовлеченных в индукцию и развитие СКВ.

СКВ является системным аутоиммунным заболеванием, характеризующимся образованием аутоантител против собственных антигенов, таких как ДНК, Sm, Ro, La, РНП, кардиолипин и гистоны. Этиология СКВ неизвестна, и понимание механизма, посредством которого возникают указанные аутоантитела, дало бы возможность в этом разобраться. Обнаружено, что моноклональные аутоантитела, которые способны вызывать появление антител, которые несут 16/6 Id или взаимодействуют с ним, являются патогенными и, таким образом, способны индуцировать экспериментальную СКВ (Fricke, H. et al., Internatl.

Immunol. 2: 225 (1990); Sthoeger, Z.M. et al., J. Clin. Immunol. 13: 127 (1993)). Секвенированы вариабельные (V) области девяти аутоантител, которые связываются либо с ДНК, либо с экстрактом ядер (NE) HeLa, выделенные из организма мышей C3H.SW с экспериментальной СКВ (Waisman and Mozes, 1993).

Анализировали моноклональные антитела с разной специфичностью, чтобы попытаться определить связи между разными аутоантителами. Обнаружено, что три мАт связываются с ДНК, и было показано, что они имеют признаки последовательности, характерные для патогенных анти-ДНК-антител. Показано, что в одном из указанных мАт, названном 2С4С2, используется ген V-области тяжелой (Н) цепи (VH), идентичный VH анти-ДНК-мАт, выделенного из других склонных к развитию волчанки мышей, а именно (NZBxNZW)F1. Ген V-области легкой (L) цепи (VL) мАт 2С4С2 на 98% гомологичен VL другого антиДНК-мАт, также выделенного от мышей (NZBxNZW)F1. Два других анти-ДНК-мАт, названных 5G12- и 5G12-6, имеют 93% общих последовательностей VH с последовательностями мАт 2С4С2. Шесть мАт связывают белки NE HeLa. Девять мАт используют всего пять генов VH и четыре гена VL зародышевой линии, свидетельствуя, что аутоантитела, индуцированные у мышей с экспериментальной СКВ, не происходят из одного клона В-клеток. Три из девяти VH и VL оказались идентичными по последовательности генам зародышевой линии, тогда как по меньшей мере три других имели соматические мутации. Последнее подтверждает, что указанные аутоантитела возникают у мышей как при использовании существующих (непримированных) В-клеток, так и посредством запускаемого антигеном процесса. Кроме того, очевидно, что в случае аутоантител, обнаруженных у мышей с экспериментальной СКВ, используются генетические элементы, сходные с элементами, используемыми в мАт, которые выделяли из линий мышей, у которых волчанка развивается спонтанно.

Т-клетки играют важную роль в индукции и развитии экспериментальной СКВ. Так, было показано, что Т-клеточные линии и клоны, специфичные к 16/6 Id, индуцируют экспериментальную СКВ у сингенных реципиентов подобно 16/6-антителу. Поэтому после инокуляции активированных клеток линий у мышей развивались как серологические признаки, так и повреждение почек, которое типично для СКВ (Fricke, H. et al., Immunology 73: 421 (1991)). Кроме того, 16/6 Id-специфичная линия Т-клеток, происходящих от мышей C3H.SW, индуцировала СКВ у мышей C57BL/6, которые, как было показано, резистентны к индукции заболевания после инъекций либо 16/6 Id-, либо анти-16/6 Id-мАт (Mendlovic et al., 1990).

При попытке идентифицировать патогенную область 16/6 Id были получены (Fab')2-фрагменты 16/ Id-мАт, и обнаружено, что они сохраняют специфичность и патогенную способность целой молекулы 16/6 Id (Ruiz, P.J., et al., Immun. Let. 41: 79 (1994)).

мАт 5G12, которое было выделено из организма мышей с экспериментальной СКВ и которое, как было показано, связывается с ДНК и несет 16/6 Id, способно индуцировать экспериментальную СКВ у мышей (Waisman, A. et al., Internatl. Immunol. 5: 1293 (1993)). Т-клетки, которые специфично реагируют на мАт пролиферацией, вероятно, реагируют на пептиды, представляющие последовательности из их областей, определяющих комплементарность (CDR). Весьма вероятно, что Т-клетки узнают V-области указанных выше антител, так как они не реагируют с другими антителами, которые несут такую же константную область, но имеют другие специфичности. В пределах вариабельной области наиболее вероятно узнаваемыми областями являются CDR, так как они представляют собой области, которые наиболее различаются среди разных антител. CDR-области последовательностей VH девяти патогенных мышиных мАт, указанных выше, которые индуцируют СКВ у мышей, заключены в прямоугольники на фиг. 1 в работе Waisman and Mozes, 1993, на которой представлены полные нуклеотидные и рассчитанные аминокислотные последовательности VH девяти мАт.

В экспериментальных моделях СКВ - мыши Balb/c и склонные к СКВ мыши, т.е. мыши (NZBxNZW)F1 - лечение либо пептидами, основанными на mCDR, либо соединением 1 значимо снижало связанные с СКВ показатели, особенно отложения иммунных комплексов (ICD) в почке, протеинурию и лейкопению. Лечение не оказывало влияния на 16/6 Id-специфичный гуморальный ответ (Waisman, A., et al. "Modulation of murrine systemic lupus erythematosus with peptides based on complementarity determining regions of pathogenic anti-DNA monoclonal antibodies". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997), 94(4): 620; Eilat, -2E., et al. "Prevention of systemic lupus erythematosus-like disease in (NZBxNZW)F1 mice by treating with CDR1- and CDR3- based peptides of pathogenic autoantibody". J. Clin. Immunol. (2000), 20: 268; Eilat, E., et al. "The mechanism by which a peptide based on complementarity determining region-1 of pathogenic anti-DNA antibody ameliorates experimental SLE" (2001), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98: 1148).

CDR1 человека, соединение 1, показанное на фиг. 1, является синтетическим пептидом из 19 аминокислот, основанным на определяющей комплементарность области 1 (CDR1) анти-днДНК-мАт человека, названного 16/6 Id (Waisman, A., et al. "Modulation of murine systemic lupus erythematosus with peptides based on complementarity determining regions of pathogenic anti-DNA monoclonal antibodies". Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1997), 94 (4): 4620-4625).

Указанные пептиды, подобно многим пептидам, не очень хорошо растворимы. Поэтому в данной заявке предлагаются композиции, которые улучшают растворимость пептидов.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель;

от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли a) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (i) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Id-антитела, или (ii) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (i) TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG (SEQ ID NO: 11), где X1 означает Met, Ala или Val; X2 означает Gln, Asp, Glu или Arg; X3 означает Trp или Ala; X4 означает Val или Ser и X5 означает Lys, Glu или Ala;

(ii) EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT (SEQ ID NO: 12), где Х6 и Х7, каждый означает Thr, Val или Ala; X8 означает Tyr или Phe; X9 означает Asn или Asp; X означает Gln или Glu; Х11 означает Lys или Glu и X12 означает Phe или Tyr;

(iii) YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS (SEQ ID NO: 13), где Х13 означает Phe, Thr или Gly; X14 означает Leu, Ala или Ser; X15 означает Trp или Ala; X16 означает Glu или Lys; X17 означает Met или Ala и X18 означает Asp, Lys или Ser;

(iv) GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG (SEQ ID NO: 14), где X19 означает Met или Ala; X20 означает Asn, Asp или Arg; X21 означает Trp или Ala; X22 означает Val или Ser; X23 означает Lys или Glu; X24 означает Gln или Ala; X25 означает Lys или Glu и Х26 означает Ser или Ala;

(v) YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL (SEQ ID NO: 15), где Х27 означает Ser или Phe; X28 означает Gly или Ala; X29 означает Arg, Ala или Glu; X30 означает Asn или Asp; X31 означает Tyr или Phe и Х32 означает Trp, His или Ala;

(vi) X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG (SEQ ID NO: 16), где Х33 означает Gly или Thr Gly; X34 означает Arg или Lys; X35 означает Pro или Ser; X36 означает Gly или Glu; X37 означает Lys или Asp и X38 означает Glu, Leu или Ser;

(vii) YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV (SEQ ID NO: 17), где X39 означает Gly или Phe; X40 означает Arg или Ala; X41 означает Gly или Ala; X42 означает Gly или Ala; X43 означает Trp или Ala; X44 означает Asn или Ala; X45 означает Tyr или Trp; X46 означает Met или Gln;

(viii) FSGYYWS (SEQ ID NO: 8);

(ix) EINHSGSTNYKTSLKS (SEQ ID NO: 9); или (x) GLLRGGWNDVDYYYGMDV (SEQ ID NO: 10), или c) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и b) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (a)(i), (a)(ii) и (b)(i)-(b)(х), или d) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)b)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, N-мeтил-2-пиppoлидинoнa, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного -циклодекстрина, в которой и пептид, и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему в себя введение человеку любой из фармацевтических композиций согласно изобретению в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Фиг. 1. CDR1 человека (соединение 1) в виде ацетатной соли - показаны молекулярная и структурная формулы hCDR1, аминокислотная последовательность и физические параметры.

Фиг. 2. Секреция IL-2 из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1 и каптизолом, после того, как затем клетки были активированы раствором соединения 1 в PBS.

- соединение 1 (RS) 200 мкг/мышь.

Фиг. 3. Секреция IFN- из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1, после того, как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (2,5106 клеток/лунку).

- соединение 1 50 мкг/мышь (лечебная доза).

- соединение 1 100 мкг/мышь (лечебная доза).

- соединение 1 200 мкг/мышь (лечебная доза).

Фиг. 4. Секреция IFN- из клеток, взятых от мышей, обработанных раствором соединения 1, после того, как клетки были затем активированы раствором соединения 1 в ЕМ-1 (5106 клеток/лунку).

Фиг. 5. Анти-днДНК-антитела у мышей (NZBxNZW)F1 после 10 инъекций соединения 1 в каптизоле [ОD=оптическая плотность; соединение 1 (С) = соединение 1, растворенное в каптизоле].

Фиг. 6. Срезы почек от мышей (NZBxNZW)F1, показывающие интенсивность отложений иммунных комплексов. Срезы в верхнем ряду получены от мыши, обработанной каптизолом, срезы среднего ряда от мыши, обработанной 50 мкг/мышь соединения 1, и срезы нижнего ряда от мыши, обработанной 25 мкг/мышь соединения 1.

Увеличение - левые: 100, правые: 400. ФИТЦ-иммуногистология.

Фиг. 7. Титры антител в сыворотках пациентов с СКВ и контрольных сыворотках здоровых людей при тестировании их сывороток в отношении способности связываться с пептидами Iа, IIa и IIIа, или мАт 5G12, или контрольным пептидом.

Фиг. 8. Концентрация человеческих анти-ДНК 16/6 Id-мАт, требуемая для оптимальной стимуляции PBL пациентов с СКВ и здоровых людей в контроле. PBL стимулировали различными концентрациями (0,1-40 мкг/лунку) 16/6 Id-мАт. Концентрацию, дающую самый высокий индекс стимуляции, определяли как оптимальную для запуска пролиферативного ответа.

Фиг. 9. Пролиферация PBL от одного пациента с СКВ, стимулированных митогеном фитогемагглютинином (ФГА), в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3.

Фиг. 10. Пролиферация PBL от одного пациента с СКВ, стимулированных человеческим мАт 16/6 I, в отсутствие или в присутствии пептидов hCDR1 или hCDR3 человека или пептида mCDR3 мыши.

Фиг. 11. Пролиферация PBL от одного пациента с CKB, стимулированных человеческим мАт 16/6 I, в отсутствие или в присутствии пептидов hCDR1 или hCDR3 человека или мышиных пептидов с обратной последовательностью revmCDR1 и revmCDR3.

Фиг. 12. Ингибирование секреции IL-2 в PBL пациентов с СКВ, запускаемой мАт 16/6 Id человека, в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3.

Фиг. 13. Повышающая регуляция секреции TGF- в PBL одного типичного пациента с СКВ, стимулированной человеческим мАт 16/6 Id, в отсутствие или в присутствии hCDR1 или hCDR3.

Фиг. 14. Типичный гель, показывающий активность ММР-2 и ММР-9 в сыворотках пациентов с СКВ и здоровых людей в контроле. Сыворотки (5 мкл) 40 пациентов с СКВ и 25 здоровых людей в качестве контролей анализировали в отношении активности ММР-2 или ММР-9 зимографией в геле. На фигуре показаны типичные результаты с образцами сыворотки из двух групп.

Фиг. 15. График, показывающий количественный анализ активностей ММР-2 и ММР-9 в сыворотках пациентов с СКВ (темные колонки) и здоровых людей в качестве контролей (белые колонки). 36 образцов сыворотки пациентов с СКВ и 15 образцов сыворотки здоровых людей в качестве контролей тестировали в отношении активности ММР-2 или ММР-9, используя специальные наборы для анализа активности. Результаты выражены в виде средней ± s.e.m. *P=0,0302.

Фиг. 16А-В. Графики, показывающие уровни активности ММР-9 и индексы активности заболевания (SLEDAI) у пациентов с СКВ. 35 образцов сыворотки от 8 пациентов с СКВ мужского пола (фиг. 16А) и 27 женского пола (фиг. 16В) тестировали в отношении активности ММР-9 с помощью специального набора для анализа активности. Представлено распределение активности ММР-9 в соответствии с SLEDAI пациентов. Пунктирной линией указана активность ММР-9 у здоровых людей в контроле.

Фиг. 17А-В. Графики, показывающие характер активности ММР-2 (белые кружки) и ММР-9 (черные кружки) в сыворотках двух пациентов с СКВ, собранных в течение 4-6 лет заболевания. Сыворотки тестировали в отношении активностей ММР-2 или ММР-9 с помощью специальных наборов для анализа активности. Анализы осуществляли в двух повторах.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей водный носитель;

от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли а) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (i) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Id-антитела, или (ii) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (i) TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG (SEQ ID NO: 11), где X1 означает Met, Ala или Val; X2 означает Gln, Asp, Glu или Arg; X3 означает Trp или Ala; X4 означает Val или Ser и X5 означает Lys, Glu или Ala;

(ii) EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT (SEQ ID NO: 12), где Х6 и Х7, каждый означает Thr, Val или Ala; X8 означает Tyr или Phe; X9 означает Asn или Asp; X означает Gln или Glu; Х11 означает Lys или Glu и X12 означает Phe или Tyr;

(iii) YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS (SEQ ID NO: 13), где Х13 означает Phe, Thr или Gly; X14 означает Leu, Ala или Ser; X15 означает Trp или Ala; X16 означает Glu или Lys; X17 означает Met или Ala и Х18 означает Asp, Lys или Ser;

(iv) GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG (SEQ ID NO: 14), где X19 означает Met или Ala; X20 означает Asn, Asp или Arg; X21 означает Trp или Ala; X22 означает Val или Ser; X23 означает Lys или Glu; X24 означает Gln или Ala; X25 означает Lys или Glu и Х26 означает Ser или Ala;

(v) YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL (SEQ ID NO: 15), где Х27 означает Ser или Phe; X28 означает Gly или Ala; X29 означает Arg, Ala или Glu; X30 означает Asn или Asp; X31 означает Tyr или Phe и X32 означает Trp, His или Ala;

(vi) X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG (SEQ ID NO: 16), где Х33 означает Gly или Thr Gly; X34 означает Arg или Lys; X35 означает Pro или Ser; X36 означает Gly или Glu; X37 означает Lys или Asp и Х38 означает Glu, Leu или Ser;

(vii) YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV (SEQ ID NO: 17), где Х39 означает Gly или Phe; X40 означает Arg или Ala; Х41 означает Gly или Ala; X42 означает Gly или Ala; X43 означает Trp или Ala; X44 означает Asn или Ala; X45 означает Tyr или Trp; Х46 означает Met или Gln;

(viii) FSGYYWS (SEQ ID NO: 8);

(ix) EINHSGSTNYKTSLKS (SEQ ID NO: 9); или (x) GLLRGGWNDVDYYYGMDV (SEQ ID NO: 10), или c) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и b) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)-(b)(х), или d) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)b)(х); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, N-мeтил-2-пиppoлидинoнa, 1-этенил-2-пирролидинона, в которой и пептид, и усилитель растворимости растворены в водном носителе; и при этом композиция имеет рН от 4 до 9.

В одном варианте по меньшей мере 0,5 мг/мл композиции составляет фармацевтически приемлемая соль пептида.

В другом варианте пептид имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из NH2-Thr Gly Tyr Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu-Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO: 1);

NH2-Glu Ilе Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr-COOH (SEQ ID NO: 2);

NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Leu Trp Glu Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Ser-COOH (SEQ ID NO: 3);

NH2-Gly Tyr Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO: 4);

NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Thr Leu-COOH (SEQ ID NO: 5);

NH2-Gly Tyr Туr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO: 6);

NH2-Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Gly Met Asp ValCOOH (SEQ ID NO: 7);

NH2-Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser-COOH (SEQ ID NO: 8);

NH2-Glu lle Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Lys Ser-COOH (SEQ ID NO: 9); и NH2-Gly Leu Leu Arg Gly Gly Trp Asn Asp Val Asp Tyr Tyr Туr Gly Met Asp Val-COOH (SEQ ID NO: 10).

В одном варианте пептид содержит следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG (SEQ ID NO: 16), где Х33 означает Gly или Thr Gly; X34 означает Arg или Lys; Х35 означает Pro или Ser; X36 означает Gly или Glu; X37 означает Lys или Asp и Х38 означает Glu, Leu или Ser.

В другом варианте любой из описанных выше фармацевтических композиций усилителем растворимости является замещенный -циклодекстрин.

В одном варианте замещенным -циклодекстрином является -циклодекстрин, замещенный гидроксипропилом, сульфобутиловым эфиром или сульфопропиловым эфиром.

В другом варианте замещенным -циклодекстрином является -циклодекстрин, замещенный сульфобутиловым эфиром.

В следующем варианте любой из описанных выше композиций концентрация пептида в растворе составляет по меньшей мере 1,0 мг/мл.

В следующем варианте концентрация пептида в растворе составляет по меньшей мере 2,5 мг/мл.

В одном варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 0,5 до 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 2,5 до 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 5 до 7 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 7 до 8,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 8,5 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 9 до 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 10 до 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет от 15 до 20 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 1,0 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 2,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 10 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли пептида составляет 15 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,5 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,1 до 0,2 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,2 до 0,3 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,3 до 0,4 мг/мл.

В другом варианте концентрация соли составляет от 0,4 до 0,5 мг/мл.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7,5 до 8,5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 4 до 5.

В следующем варианте композиция имеет рН от 5 до 6.

В следующем варианте композиция имеет рН от 6 до 7.

В следующем варианте композиция имеет рН от 7 до 8.

В следующем варианте композиция имеет рН от 8 до 9.

приемлемой солью является ацетатная соль.

В следующем варианте фармацевтически приемлемой солью является ацетатная соль, а замещенным -циклодекстрином является гепта(сульфобутиловый эфир)--циклодекстрин.

В другом варианте композиция, кроме того, содержит фармацевтически приемлемый буфер в количестве и типа, подходящего для получения рН фармацевтической композиции в диапазоне 4-9. Буфером может быть ацетатный буфер, нитратный буфер или карбонат натрия.

Настоящее изобретение также относится к способу ослабления симптомов системной красной волчанки (СКВ) у человека, включающему введение человеку любой из указанных выше фармацевтических композиций в количестве, эффективном для ослабления симптомов СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к указанным выше фармацевтическим композициям для применения при лечении СКВ у человека.

Настоящее изобретение также относится к способу производства любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему следующие стадии:

a) приготовление раствора диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, N-метил-2-пирролидинона, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана или замещенного -циклодекстрина в водном носителе с предварительно определенной концентрацией;

b) добавление предварительно определенного количества фармацевтически приемлемой соли 1) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (i) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Id-антитела, или (ii) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, 2) пептида, содержащего аминокислоты, имеющие последовательность (i) TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG (SEQ ID NO: 11), где X1 означает Met, Ala или Val; X2 означает Gln, Asp, Glu или Arg; X3 означает Trp или Ala; X4 означает Val или Ser и X5 означает Lys, Glu или Ala;

(ii) EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT (SEQ ID NO: 12), где Х6 и Х7, каждый означает Thr, Val или Ala; X8 означает Tyr или Phe; Х9 означает Asn или Asp; X означает Gln или Glu; Х11 означает Lys или Glu и X12 означает Phe или Tyr;

(iii) YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS (SEQ ID NO: 13), где Х13 означает Phe, Thr или Gly; X14 означает Leu, Ala или Ser; X15 означает Trp или Ala; X16 означает Glu или Lys; X17 означает Met или Ala и X18 означает Asp, Lys или Ser;

(iv) GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG (SEQ ID NO: 14), где X19 означает Met или Ala; X20 означает Asn, Asp или Arg; X21 означает Trp или Ala; X22 означает Val или Ser; Х23 означает Lys или Glu; X24 означает Gln или Ala; X25 означает Lys или Glu и Х26 означает Ser или Ala;

(v) YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL (SEQ ID NO: 15), где Х27 означает Ser или Phe; X28 означает Gly или Ala; X29 означает Arg, Ala или Glu; X30 означает Asn или Asp; X31 означает Tyr или Phe и Х32 означает Trp, His или Ala;

(vi) X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG (SEQ ID NO: 16), где X33 означает Gly или Thr Gly; X34 означает Arg или Lys; Х35 означает Pro или Ser; X36 означает Gly или Glu; X37 означает Lys или Asp и Х38 означает Glu, Leu или Ser;

(vii) YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV (SEQ ID NO: 17), где Х39 означает Gly или Phe; X40 означает Arg или Ala; X41 означает Gly или Ala; X42 означает Gly или Ala; X43 означает Trp или Ala; X44 означает Asn или Ala; X45 означает Tyr или Trp; X46 означает Met или Gln;

(viii) FSGYYWS (SEQ ID NO: 8);

(ix) EINHSGSTNYKTSLKS (SEQ ID NO: 9); или (x) GLLRGGWNDVDYYYGMDV (SEQ ID NO: 10), или 3) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и b) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)-(b)(х), или 4) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)b)(х); и c) доведение рН раствора со стадии b) вплоть до растворения пептида в растворе; и d) при необходимости доведение рН раствора со стадии с) до рН 4-9, таким образом получая фармацевтическую композицию.

В одном варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньшей мере 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей по меньшей мере 0,5 мг/мл.

В следующем варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

В другом варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 5, 10 или 15 мг/мл.

В одном варианте способа полученная в результате конечная концентрация замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции составляет от 70 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 80 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 90 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 100 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 110 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 120 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 130 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 140 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 150 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции от 160 до 170 мг/мл.

В одном варианте способа предварительно определенной концентрацией замещенного -циклодекстрина является такая концентрация, которая приводит к конечной концентрации замещенного -циклодекстрина в фармацевтической композиции, составляющей 120 мг/мл.

В следующем варианте стадия b), кроме того, включает перемешивание раствора в течение 1 ч.

В другом варианте на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НСl или NaOH.

В следующем варианте способ, кроме того, включает фильтрование раствора со стадии d) через фильтр из ацетата целлюлозы.

В следующем варианте предварительно определенным количеством пептида является такое количество, которое приводит к конечной концентрации пептида в фармацевтической композиции, составляющей 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл;

стадия b), кроме того, включает перемешивание раствора в течение 1 ч; и на стадии с) рН корректируют, используя 1,0н. НСl или NaOH, и способ, кроме того, включает фильтрование раствора со стадии d) через фильтр из ацетата целлюлозы.

Настоящее изобретение также относится к композиции, полученной любым из указанных выше способов.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, содержащей от 0,1 до 20 мг/мл композиции фармацевтически приемлемой соли a) пептида, содержащего по меньшей мере 12 и самое большее 30 следующих друг за другом аминокислот, имеющих последовательность, соответствующую (i) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи человеческого моноклонального анти-ДНК 16/6 Id-антитела, или (ii) последовательности аминокислот, обнаруживаемой в определяющей комплементарность области (CDR) тяжелой или легкой цепи патогенного моноклонального анти-ДНК-антитела, которое индуцирует ответ, подобный заболеванию системной красной волчанкой (СКВ), у мышей, или b) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность (i) TGYYX1X2X3X4X5QSPEKSLEWIG (SEQ ID NO: 11), где X1 означает Met, Ala или Val; X2 означает Gln, Asp, Glu или Arg; X3 означает Trp или Ala; X4 означает Val или Ser и Х5 означает Lys, Glu или Ala;

(ii) EINPSTGGX6X7X8X9X10X11X12KAKAT (SEQ ID NO: 12), где Х6 и Х7, каждый означает Thr, Val или Ala; X8 означает Tyr или Phe; X9 означает Asn или Asp; X означает Gln или Glu; X11 означает Lys или Glu и X12 означает Phe или Tyr;

(iii) YYCARX13X14X15X16PYAX17X18YWGQGS (SEQ ID NO: 13), где Х13 означает Phe, Thr или Gly; X14 означает Leu, Ala или Ser; X15 означает Trp или Ala; X16 означает Glu или Lys; X17 означает Met или Ala и X18 означает Asp, Lys или Ser;

(iv) GYNX19X20X21X22X23X24SHGX25X26LEWIG (SEQ ID NO: 14), где X19 означает Met или Ala; X20 означает Asn, Asp или Arg; X21 означает Trp или Ala; X22 означает Val или Ser; Х23 означает Lys или Glu; Х24 означает Gln или Ala; X25 означает Lys или Glu и Х26 означает Ser или Ala;

(v) YYCARX27X28X29YGX30X31X32GQTL (SEQ ID NO: 15), где Х27 означает Ser или Phe; X28 означает Gly или Ala; X29 означает Arg, Ala или Glu; X30 означает Asn или Asp; X31 означает Tyr или Phe и Х32 означает Trp, His или Ala;

(vi) X33YYWSWIX34QX35PX36X37GX38EWIG (SEQ ID NO: 16), где X33 означает Gly или Thr Gly; X34 означает Arg или Lys; X35 означает Pro или Ser; X36 означает Gly или Glu; X37 означает Lys или Asp и Х38 означает Glu, Leu или Ser;

(vii) YYCARX39LLX40X41X42X43X44DVDYX45GX46DV (SEQ ID NO: 17), где X39 означает Gly или Phe; X40 означает Arg или Ala; X41 означает Gly или Ala; X42 означает Gly или Ala; X43 означает Trp или Ala; X44 означает Asn или Ala; X45 означает Tyr или Trp; Х46 означает Met или Gln;

(viii) FSGYYWS (SEQ ID NO: 8);

(ix) EINHSGSTNYKTSLKS (SEQ ID NO: 9); или (x) GLLRGGWNDVDYYYGMDV (SEQ ID NO: 10), или c) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие любую последовательность из а) и b) или по меньшей мере две последовательности из последовательностей (a)(i), (a)(ii) и (b)(i)-(b)(х), или d) пептида, содержащего следующие друг за другом аминокислоты, имеющие последовательность, содержащую по меньшей мере две идентичные последовательности, включенные в (a)(i), (а)(ii) и (b)(i)b)(x); и усилитель растворимости, выбранный из группы, состоящей из диметилацетамида, полиэтиленгликоля, полиоксилированного касторового масла, N-мeтил-2-пиppoлидинoнa, 1-этенил-2-пирролидинона, сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана и замещенного -циклодекстрина.

В одном варианте лиофилизованной фармацевтической композиции по меньшей мере 0,5 мг/мл композиции составляет фармацевтически приемлемая соль пептида.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему следующие стадии:

a) снижение температуры фармацевтической композиции до -40°С;

b) поддержание температуры при -40°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышение температуры раствора до 20°С;

d) поддержание температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени и e) снижение давления и поддержание температуры при 20°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В одном варианте стадию а) осуществляют в течение 2 ч.

В другом варианте стадию b) осуществляют в течение 3 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В другом варианте стадию d) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию d) осуществляют при давлении 110 мкбар.

В другом варианте на стадии е) давление понижают до 10 мкбар.

В другом варианте стадию е) осуществляют в течение 5 ч.

В другом варианте стадию а) осуществляют в течение 2 ч;

стадию с) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар;

стадию d) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 110 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 5 ч и давление понижают до 10 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, полученной любым из указанных выше способов.

Настоящее изобретение также относится к способу лиофилизации любой из указанных выше фармацевтических композиций, включающему в себя следующие стадии:

a) снижение температуры фармацевтической композиции до -45°С;

b) поддержание температуры при -45°С в течение предварительно определенного периода времени;

c) повышение температуры раствора до -20°С;

d) повышение температуры раствора до 25°С и e) поддержание температуры при 25°С в течение предварительно определенного периода времени, таким образом лиофилизируя фармацевтическую композицию.

В одном варианте стадию а) осуществляют в течение 6 ч.

В другом варианте стадию b) осуществляют в течение 3 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют в течение 19 ч.

В другом варианте стадию с) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию d) осуществляют в течение 13 ч.

В другом варианте стадию d) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию е) осуществляют в течение 8 ч.

В другом варианте стадию е) осуществляют при давлении 150 мкбар.

В другом варианте стадию а) осуществляют в течение 6 ч;

стадию b) осуществляют в течение 3 ч;

стадию с) осуществляют в течение 19 ч и при давлении 150 мкбар;

стадию d) осуществляют в течение 13 ч и при давлении 150 мкбар и стадию е) осуществляют в течение 8 ч и при давлении 150 мкбар.

Настоящее изобретение также относится к лиофилизованной фармацевтической композиции, полученной любым из указанных выше способов.

Настоящее изобретение также относится к указанной выше лиофилизованной фармацевтической композиции, в которой содержание воды в композиции составляет менее 5%.

В одном варианте содержание воды в композиции составляет менее 4%.

В другом варианте содержание воды в композиции составляет менее 3,5%.

Настоящее изобретение также относится к упакованной фармацевтической композиции, состоящей из упаковочного материала и предварительно определенного количества любой из указанных выше лиофилизованных фармацевтических композиций.

В другом варианте пептид имеет формулу NH2-Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp lle Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Glu Glu Trp Ile Gly-COOH (SEQ ID NO: 6).

Синтетические пептиды согласно данному изобретению основаны на CDR моноклональных патогенных аутоантител, выделенных от мышей с экспериментальной СКВ. Такие моноклональные антитела получают из надосадков гибридом, полученных слиянием, например, клеток селезенки мышей C3H.SW, иммунизированных анти-16/6 Id-мАт, с клетками плазмоцитомы Х63.653 (Waisman and Mozes, 1993).

Примерами таких пептидов являются пептиды формул Ia-Va, приведенных в данном описании, основанные, соответственно, на областях CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи мАт 5G12 и областях CDR1 и CDR3 тяжелой цепи мАт 2С4С2 (Waisman and Mozes, 1993), и их аналоги.

Подразумевается, что пептиды согласно настоящему изобретению включают аналоги пептидов IaVa, включая аналоги, содержащие замену, делецию и добавление, которые приведены в данном описании. Аналоги с заменами имеют замены аминокислот в разных положениях, при этом указанные замены производят на основе объема, гидрофобного-гидрофильного характера и заряда аминокислот.

Аминокислоты можно разделить в соответствии с объемом, гидрофобным-гидрофильным характером и зарядом. Что касается объема, то специалистам в данной области понятно, что аминокислотами с наибольшим занимаемым объемом являются Trp, Tyr, Phe, Arg, Lys, Ile, Leu, Met и His, тогда как аминокислотами с наименьшими объемами являются Gly, Ala, Ser, Asp, Thr и Pro, остальные занимают промежуточное положение между ними.

Что касается гидрофобного-гидрофильного характера, то хорошо известно, что аминокислоты Gly, Ala, Phe, Val, Leu, Ile, Pro, Met и Trp являются гидрофобными в то время, как все остальные аминокислоты являются гидрофильными. Среди гидрофильных аминокислот Ser, Thr, Gln и Tyr не имеют заряда, тогда как Arg, Lys, His и Asn имеют положительный заряд, a Asp и Glu имеют отрицательные заряды.

При отборе пептидов для тестирования в отношении их возможности ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие аутоантитела, важно, чтобы замены были выбраны из таких замен, которые в совокупности существенно не изменяют объем, гидрофобный-гидрофильный характер и заряд соответствующей части не подвергнутого заменам исходного пептида. Таким образом, гидрофобный остаток может быть заменен гидрофильным остатком или наоборот при условии, что общий эффект существенно не изменит объем, гиброфобный-гидрофильный характер и заряд соответствующего не подвергнутого заменам исходного пептида.

Следует понимать, что другие модификации пептидов также входят в объем настоящего изобретения. Таким образом, подразумевается, что пептид согласно настоящему изобретению включает его "химическое производное", которое сохраняет по меньшей мере часть функции пептида, которая дает возможность использовать его для предотвращения или ингибирования пролиферативных ответов Т-клеток и аутоиммунного заболевания.

"Химическое производное" пептида согласно настоящему изобретению содержит дополнительные химические остатки, обычно не являющиеся частью пептида. В объем данного изобретения включены ковалентные модификации пептида. Такие модификации могут быть введены в молекулу в результате взаимодействия являющихся мишенью аминокислотных остатков пептида с органическим дериватизирующим агентом, который способен взаимодействовать с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Большое количества таких химических производных и способов их получения хорошо известны в данной области.

Также в объем изобретения включены соли пептидов согласно изобретению. В используемом в данном описании смысле термин "соли" относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотноаддитивным солям аминогрупп пептидной молекулы. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа и цинка и т.п., и соли с органическими основаниями, такие как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п.

К кислотно-аддитивным солям относятся, например, соли с неорганическими кислотами, такими, например, как хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, такими, например, как уксусная кислота или щавелевая кислота. Такие химические производные и соли предпочтительно используют для модификации фармацевтических свойств пептида, когда речь идет о стабильности, растворимости и т.д.

Синтетические пептиды и их аналоги согласно изобретению могут быть выбраны из группы, состоящей из пептидов, имеющих последовательности I-V, приведенные в данном описании, где:

(i) пептид с последовательностью I имеет формулу (SEQ ID NO: 11) где X1 означает Met, Ala или Val; X2 означает Gln, Asp, Glu или Arg; X3 означает Trp или Ala; X4 означает Val или Ser и Х5 означает Lys, Glu или Ala.

В одном варианте пептид с последовательностью I имеет формулу (Ia) (SEQ ID NO: 1)

T G Y Y M Q W V K Q S Р Е K S L E W I G (Iа)

(ii) пептид с последовательностью II имеет формулу (SEQ ID NO: 12) где каждый из Х6 и Х7 является Thr, Val или Ala; X8 является Tyr или Phe; X9 является Asn или Asp; X является Gln или Glu; Х11 является Lys или Glu и X12 является Phe или Tyr.

В одном варианте пептид с последовательностью II имеет формулу (IIа) (SEQ ID NO: 2)

E I N P S T G G T T Y N Q K F K А K А Т (IIа)

(iii) пептид с последовательностью III имеет формулу (SEQ ID NO: 13) где X13 означает Phe, Thr или Gly; X14 означает Leu, Ala или Ser; X15 означает Trp или Ala; X16 означает Glu или Lys; X17 означает Met или Ala и X18 означает Asp, Lys или Ser.

В одном варианте пептид с последовательностью III имеет формулу (IIIa) (SEQ ID NO: 3)

Y Y C A R F L W E P Y A M D Y W G Q G S (IIIа)

(iv) пептид с последовательностью IV имеет формулу (SEQ ID NO: 14) где X19 означает Met или Ala; X20 означает Asn, Asp или Arg; X21 означает Trp или Ala; X22 означает Val или Ser; Х23 означает Lys или Glu; Х24 означает Gln или Ala; X25 означает Lys или Glu и Х26 означает Ser или Ala.

В одном варианте пептид с последовательностью IV имеет формулу (IVa) (SEQ ID NO: 4)

G Y N M N W V K Q S H G K S L E W I G (IVa)

(v) пептид с последовательностью V имеет формулу (SEQ ID NO: 15) где Х27 означает Ser или Phe; X28 означает Gly или Ala; X29 означает Arg, Ala или Glu; X30 означает Asn или Asp; X31 означает Tyr или Phe и Х32 означает Trp, His или Ala.

В одном варианте пептид с последовательностью V имеет формулу (Va) (SEQ ID NO: 5) Пептиды Ia-IIIa основаны, соответственно, на областях CDR1, CDR2 и CDR3 VH-цепи мАт 5G12, а and Mozes, 1993).

После получения пептида согласно настоящему изобретению его способность ингибировать пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие аутоантитела, легко может быть определена специалистами в данной области без того, чтобы прибегнуть к большему, чем это необходимо, экспериментированию, используя такие тесты, которые приведены в данном описании. Одним из тестов, который может быть легко проведен, является тест в отношении способности пептидов с заменами ингибировать in vitro пролиферативные ответы некоторых Т-клеточных линий и клонов, специфичных по отношению к СКВ-индуцирующим аутоантителам. Т-клеточные линии и клоны могут, например, представлять собой Т-клеточные линии и клоны, специфичные по отношению к 16/6 Id-мАт (Fricke et al., 1991), созданные из клеток лимфатических узлов иммунизированных мышей ранее описанным способом (Axelrod, О. and Mozes, E. Immunobiology 172: 99 (1986)). На клетки воздействуют стимулирующим антителом, презентированным на облученных сингенных клетках селезенки, в присутствии обогащенной среды, каждые 2 недели. Линии Т-клеток клонируют стандартным способом лимитирующего разведения. Пролиферативные ответы указанных Т-клеточных линий и клонов тестируют, например, способом, описанным в разделе "Материалы и способы" в данном описании.

Другим тестом, который может быть проведен для того, чтобы выбрать пептиды, обладающие требуемой активностью, является тест в отношении способности пептидов с заменами ингибировать способность Т-клеточных линий и клонов обеспечивать помощь специфичным по отношению к пептидам Вклеткам в присутствии исходного пептида. Пептиды с заменами также можно тестировать в отношении их способности связываться непосредственно, после биотинилирования с продуктами ММС класса II на антигенпрезентирующих клетках соответствующих линий. С этой целью осуществляют N-концевое биотинилирование соответствующих пептидов при 0°С с избытком биотин-N-гидроксисукцинимида в водном растворе (Mozes, E. et al., EMBO J. 8: 4049 (1989)). Прилипающие клетки селезенки мышей или прилипающие клетки лимфоцитов периферической крови (PBL) человека (1106/образец) инкубируют с биотинилированными пептидами в PBS, содержащем 0,1% бычий сывороточный альбумин (PBS/БСА) при 37°С в течение 20 ч с последующей инкубацией с фикоэритринстрептавидином в течение 30 мин при 4°С. После каждой инкубации клетки дважды промывают указанным выше раствором. Затем клетки анализируют проточной цитометрией, используя FACScan. В каждом анализе исследуют, минимум, 5000 клеток (что касается указанных выше способов, см., например, Mozes et al., 1989; Zisman et al., 1991).

Следующим тестом, который может быть проведен, является тест в отношении способности пептидов ингибировать секрецию цитокина линией Т-клеток или Т-лимфоцитами мышей, которые являются высокоотвечающими на СКВ-индуцирующие аутоантитела. Цитокины регистрируют следующим образом: активность IL-1 оценивают либо в ELISA, используя пару антител: для захвата и регистрирующее антитело (как описано ниже для IL-4, IL-6, IL-10), или используя анализ LBRM-33(1A5) (Conlon, P.J. J.

Immune. 134: 1280 (1983)), в котором клетки 1А5 стимулируют в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) либо надосадками, либо рекомбинантным IL-1 в разных концентрациях для секреции IL-2. После инкубации в течение ночи надосадки клеток 1А5 переносят к IL-2-зависимой линии цитотоксических Тлимфоцитов (CTLL). Стимуляцию линии CTLL посредством IL-2 измеряют через 24 ч по включению [Н]-тимидина. IL-2 непосредственно регистрируют, используя IL-2-зависимую линию CTLL или посредством ELISA. Уровни IL-4, IL-6, IL-10, INF- и TNF- в надосадках определяют в ELISA, используя антитела к различным цитокинам (Phamingen/San Diego/Ca./USA) согласно инструкциям производителя.

В случае пептидов, которые являются позитивными при тестировании в одном или нескольких указанных тестах in vitro, будут основания предполагать наличие активности in vivo. Однако тесты in vivo также можно проводить, не прибегая к большему, чем это необходимо, экспериментированию. Так, например, можно инъецировать взрослым мышам выбранный для исследования пептид либо в день -3, либо в 0 день. Затем мышей иммунизируют индуцирующим заболевание аутоантителом или пептидом.

Спустя 10 дней тестируют клетки лимфатических узлов мышей в отношении их способности пролиферировать в ответ на иммуноген, чтобы выявить ингибирующую способность выбранного для исследования пептида.

Другой такой тест на животных in vivo заключается в измерении терапевтической активности непосредственно в мышиной модели in vivo в отношении возникновения СКВ, как описано выше. Пептиды можно инъецировать мышам, у которых экспериментальная СКВ индуцируется различными путями, в разных дозах и в разных временных режимах. Чтобы определить фармакокинетические параметры пептидов, включая объем распределения, захват антигенпрезентирующими клетками и клиренс, можно использовать биотинилированные производные пептидов. Концентрацию растворимой фракции пептидов в различных жидкостях организма можно определить посредством ELISA, используя покрытые авидином планшеты и специфичные антитела против пептидов. Связанные с клетками пептиды можно анализировать посредством FACS, используя конъюгированный с флуорохромом авидин или стрептавидин. Кроме того, обработанных мышей можно периодически тестировать для того, чтобы определить влияние пептидов на ответы в виде аутоантител и на проявления заболевания, вызванного у мышей СКВ-индуцирующим антителом.

Другой способ in vivo заключается в толеризации новорожденных мышей выбранным для исследования пептидом с последующей иммунизацией мышей патогенным аутоантителом, таким как 16/6 Id+, или таким же пептидом и наблюдении за проявлениями заболевания, такими как серологические показатели, связанные с лейкопенией, повышенной скоростью оседания эритроцитов, протеинурией, обилием иммунных комплексов в почках и склерозом клубочков. Таким образом, можно видеть, что, кроме предпочтительных вариантов, которые, как было показано, применимы в примерах, приведенных в данном описании, специалисты в данной области смогут определить дополнительные пептиды, которые также будут применимы, следуя руководствам, приведенным в данном описании, без чрезмерного экспериментирования.

Также можно осуществить относительно простой тест in vitro, чтобы проанализировать предполагаемую терапевтическую эффективность любого данного пептида с заменами у любого данного пациента с СКВ. Чтобы оценить достижение конечной цели создания пептидов, которые будут связываться с высокой аффинностью с соответствующими молекулами МНС класса II, но не будут приводить к дальнейшей активации Т-клеток и поэтому будут оказывать терапевтическое действие на пациентов с СКВ, можно анализировать пептиды после их биотинилирования в отношении их способности связываться непосредственно с продуктами HLA класса II на антигенпрезентирующих клетках в лимфоцитах периферической крови пациентов с СКВ. В таких анализах можно использовать здоровых контрольных доноров и контрольные пептиды, чтобы подтвердить их специфичность.

В одном варианте терапевтическим агентом согласно изобретению является пептид, выбранный из группы пептидов формул I-V, приведенных в данном описании, включая пептиды Ia-Va и их аналоги с заменами и/или делециями.

В другом варианте терапевтическим агентом согласно настоящему изобретению является форма одного полиэпитопного пептида. Так, в предпочтительном варианте двойные пептиды, состоящие из двух разных пептидов, выбранных из группы пептидов формул I-V, приведенных в данном описании, ковалентно связывают друг с другом, например коротким участком из остатков аланина или предполагаемым сайтом для протеолиза катепсином. См., например, патент США 5126249 и европейский патент 495049 в отношении таких сайтов. Это будет индуцировать сайт-специфичный протеолиз предпочтительной формы на два требуемых аналога. Альтернативно, из определенного количества одинаковых или разных пептидов согласно изобретению можно образовать пептидный полимер, например, полимеризацией пептидов с использованием подходящего полимеризующего агента, такого как 0,1% глутаральдегид (Audibert et al. (1981), Nature 289: 593). Полимер предпочтительно будет содержать от 5 до 20 остатков пептидов. Такие полимеры пептидов также можно образовать перекрестным сшиванием пептидов или прикреплением множества пептидов на макромолекулярных носителях. Подходящими макромолекулярными носителями являются, например, белки, такие как столбнячный токсоид, и линейные и разветвленные сополимеры аминокислот, такие как линейный сополимер L-аланина, L-глутаминовой кислоты и Lлизина и разветвленный сополимер L-тирозина, L-глутаминовой кислоты, L-аланина и L-лизина (T,G)-AL-, или многоцепочечный пoли-DL-aлaнин (М. Sela et al. 1955, J. Am. Chem. Soc. 77: 6175). Конъюгаты получают, например, сначала связывая пептид с водорастворимым карбодиимидом, таким как гидрохлорид 1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимида, и затем осуществляя конъюгацию с макромолекулярным носителем, как описано Muller, G.M. et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 569. Содержание связанного пептида в каждом конъюгате определяют анализом аминокислот по сравнению с составом отдельного носителя.

Согласно одному варианту настоящего изобретения один или несколько активных пептидов могут быть связаны с подходящим макромолекулярным носителем или могут быть полимеризованы в присутствии глутаральдегида.

Пептиды, их полимеры или их конъюгаты с подходящими макромолекулярными носителями будут вводиться пациентам в форме, которая обеспечивает их биодоступность, делая их подходящими для лечения. В том случае, если обнаружено, что более одного пептида обладают значительной ингибирующей активностью, то указанные пептиды будут вводиться пациентам в виде препарата, содержащего смесь данных пептидов.

Изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере один синтетический пептид согласно изобретению, его конъюгат с подходящим макромолекулярным носителем или его полимер необязательно с фармацевтически приемлемым носителем.

В объем изобретения включен любой подходящий путь введения, включая пероральный, внутривенный, подкожный, внутрисуставной, внутримышечный, ингаляционный, интраназальный, интратекальный, внутрибрюшинный, интрадермальный, трансдермальный или другие известные пути, включая энтеральный путь.

Пределы доз для введения композиций согласно настоящему изобретению должны быть достаточно большими, чтобы получить эффект, при котором, например, иммунный ответ на СКВ-индуцирующие аутоантитела, который измеряется по пролиферации Т-клеток in vitro, был существенно предотвращен или ингибирован, и в дальнейшем заболевание значимо подвергалось лечению.

такие как нежелательные перекрестные реакции, генерализованная иммуносупрессия, анафилактические реакции и т.п.

Эффективные дозы пептидов согласно данному изобретению для применения при лечении СКВ находятся в диапазоне от 1 мкг/кг до 1 мг/кг массы тела. Вводимая доза будет зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, если таковое имеется, частоты лечения и природы требуемого эффекта.

Синтетические пептиды согласно изобретению, в частности пептиды с последовательностями I-V, приведенными в данном описании, нацелены на ингибирование или подавление специфичных ответов на антигены у пациентов с СКВ, не влияя на все другие иммунные ответы. Такой подход имеет огромнейшее значение, так как большинство диагностируемых пациентов являются молодыми женщинами, которых необходимо лечить в течение многих лет, а в настоящее время принятое лечение СКВ заключается во введении иммуносупрессирующих агентов, таких как кортикостероиды, и/или цитотоксических лекарственных средств, и те и другие являются неспецифичными и имеют множество неблагоприятных побочных эффектов.

Препараты согласно настоящему изобретению могут быть введены парентерально, местно или ректально. Конечно, они могут быть введены в форме, подходящей для каждого пути введения. Например, их можно вводить посредством инъекции, ингаляции, мази, суппозитория и т.д., введение может быть путем инъекции, инфузии или ингаляции; местное - посредством примочки или мази; и ректальное - посредством суппозиториев.

Фразы "парентеральное введение" и "введенный парентерально" в используемом в данном описании смысле означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно посредством инъекции, и включают, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, внутрикапсулярную, внутриглазничную, внутрисердечную, интрадермальную, внутрибрюшинную, через трахею, подкожную, под кутикулу, внутрисуставную, подкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и внутригрудинную инъекцию и инфузию.

Фразы "системное введение" и "введенный системно", "периферическое введение" и "введенный периферически" в используемом в данном описании смысле означают введение соединения, лекарственного средства или другого вещества, отличное от прямого введения в центральную нервную систему так, что оно поступает в систему пациента и таким образом подвергается метаболизму и другим подобным процессам, например подкожное введение.

Подробности способов общего приготовления композиций и информацию о дополнительных эксципиентах можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition.

Синтетические пептиды могут быть получены, как описано в международной публикации РСТ № WO 02/067848 или в международной публикации РСТ № WO 96/30057.

Данное изобретение будет более понятным на основании подробного описания экспериментов, которое следует далее. Однако специалист в данной области без труда поймет, что обсуждаемые конкретные способы и результаты являются только иллюстративными для изобретения, которое более полно описано в формуле изобретения, которая следует далее.

Синтез пептидов I-V и тестирование, показывающее эффективность синтезированных пептидов для лечения СКВ в моделях на животных, описаны в международной публикации РСТ № WO 96/30057. Дополнительное тестирование на животных описано в международной публикации РСТ № WO 02/067848.

Пример 1. Разработка композиции для соединения 1.

Пептиды согласно настоящей заявке описаны в международной патентной публикации WO 02/067848, опубликованной 6 сентября 2002г., и могут быть получены способами, хорошо известными в данной области (см., например, Peptides: Synthesis, Structure and Applications, ed. by B. Gutte, Academic Press, 1995;

Peptide Synthesis Protocols, ed. by M. Pennington and B. Dunn, Humana Press, 1994; Schnolzer, M. et al. "In situ neutralization in Boc-chemistry solid phase synhesis. Rapid, High yield assembly of difficult sequences".

Int. J. Pept. Protein Res. (1992) 40: 180-193).

Соединение 1 является синтетическим полипептидом, состоящим из 19 аминокислот. Его получают в виде ацетатной соли. Определена растворимость пептида в воде, составляющая менее 0,5 мг/мл. На фиг. 1 показано соединение 1 в виде ацетатной соли.

Чтобы разработать композицию с концентрацией пептида, превышающей 2 мг/мл, предпочтительно до 10 мг/мл, проводили эксперименты с несколькими усилителями растворимости. Предварительные эксперименты показали, что концентрации 2 мг/мл нелегко достигнуть. Чтобы разработать композицию для подкожной инъекции, также желательно, чтобы значение рН было в пределах от 4 до 9 и чтобы раствор был изоосмотическим.

На основании всестороннего обзора литературы было принято несколько основных подходов, чтобы получить композицию с максимальной растворимостью. Рассматривались следующие факторы:

установление рН и буферы;

растворители;

солюбилизирующие агенты.

Соединение 1 растворяли в выбранном растворе усилителя растворимости либо отдельно, либо в комбинации с другими эксципиентами и растворы перемешивали по меньшей мере в течение часа. При необходимости корректировали рН. Растворы исследовали визуально, чтобы оценить растворимость, и отправляли для аналитического определения. В случае нескольких выбранных композиций также тестировали биологическую активность.

В табл. 1 представлен тип усилителей растворимости, используемых для разработки композиции. В табл. 2 и 3 суммированы эксперименты, которые осуществляли с разными усилителями растворимости.

В табл. 2 суммирован исходный скрининг, осуществляемый с концентрациями пептида в диапазоне от до 10 мг/мл. Эксперимент, который проводили с более высокой концентрацией пептида, затем повторяли с более низкими дозами (см. табл. 3).

Исходные тесты показали, что соединение 1 лучше растворимо в пределах требуемых уровней рН, как кислых, так и основных, но менее стабильно в диапазоне основных значений рН. Соответственно, тестировали несколько буферов и агентов для корректировки рН, включая ацетатный буфер, цитратный буфер и карбонат натрия. Ни один из исходно тестированных буферов не достигал требуемого уровня растворимости пептида. Только выше рН 9,2 и ниже рН 3,0 наблюдались уровни растворимости 2 мг/мл.

Однако на начальной стадии были выбраны композиции с ацетатным буфером и цитратным буфером (с маннитом в качестве агента тоничности) для начальных токсикологических исследований. Указанные композиции тестировали в отношении биологической активности, и было доказано, что они активны.

Тестировали неводные растворители (см. табл. 1), такие как этанол, глицерин, пропиленгликоль, кремофор и их комбинации, но они не увеличивали растворимость соединения 1. Раствор 30% DMA (диметилацетамида) давал растворимость в требуемых пределах (5-9 мг/мл), но не подходил для фармацевтической композиции из-за своего профиля токсичности. Улучшенную растворимость также наблюдали при использовании 30% (мас./мас.) ПЭГ 400 (5-9 мг/мл). Указанную последнюю композицию выбрали для токсикологических исследований, но показано, что она является неактивной в биологическом анализе и может быть причиной некоторых неблагоприятных эффектов при исследовании токсичности на мышах. Таким образом, было решено больше не заниматься данной композицией. Учитывая предварительные эксперименты, неводные растворители не использовали в данных композициях.

Тестировали несколько аминокислот (см. табл. 1), включая L-аргинин, L-глутаминовую кислоту, Lглицин и L-лизин, чтобы повысить растворимость белка. Растворимость пептида в L-аргинине была на требуемом уровне, но конечное значение рН было выше 9. Попытка снизить рН или использовать HClсоль аргинина приводила к выпадению пептида в осадок. Также тестировали сывороточный альбумин человека, и он повышал растворимость пептида при низких концентрациях пептида (1 мг/мл) (см. табл. 3).

Однако вследствие его потенциальной иммуногенности и низкой растворимости пептида его не использовали в дальнейших экспериментах.

Наполнители (см. табл. 1), включая маннит, сорбит и декстран, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами, но они не повышали растворимость пептида в растворе.

Сорастворители (см. табл. 1), включая полисорбат 20 и полисорбат 80, тестировали отдельно и в комбинации с другими эксципиентами. Хотя более низкие концентрации полисорбатов (вплоть до 6%) не увеличивали растворимость пептида, более высокие концентрации (до 10% - см. табл. 2) повышали растворимость пептида до 2 мг/мл. Однако считали, что такие высокие концентрации полисорбатов являются неподходящими для фармацевтических композиций.

Также тестировали два типа циклодекстринов, которые оба одобрены для применения в продаваемых парентеральных продуктах: гидроксипропил--циклодекстрин и сульфобутиловый эфир--циклодекстрин (каптизол). Оба заметно увеличивали растворимость пептида (концентрации на уровне 10 мг/мл для гидроксипропил--циклодекстрина и 2,5 для каптизола). Тестировали биологическую активность двух композиций циклодекстрина и обнаружили, что они равны по активности пептиду, взятому отдельно.

Captisol® (каптизол) является коммерчески доступным полианионным производным -циклодекстрина, в котором соль сульфоната натрия отделена от гидрофобной полости спейсерной группой простого бутилового эфира или простого сульфобутилового эфира (SBE). Каптизол является торговой маркой препарата, гептазамещенного простым сульфобутиловым эфиром -циклодекстрина (SBE7--CD) CyDex Inc. (www.captisol.com). Структура каптизола позволяет молекулам лекарственного средства войти в гидрофобную полость, таким образом изолируя молекулу лекарственного средства от водного растворителя.

Так как наружная поверхность каптизола является гидрофильной, то растворимость готовой молекулы лекарственного средства при этом повышается. Применение циклодекстринов для повышения растворимости молекул лекарственных средств описано в патентах США №№ 5134127 и 5376645, полное содержание которых включено, таким образом, в виде ссылки.

Согласно литературным данным каптизол CyDex Inc. является безопасным при парентеральном - 15 введении и не проявляет нефротоксичности, связанной с бета-циклодекстрином. По сравнению с бетациклодекстрином каптизол проявляет сравнимые или более высокие свойства комплексообразования и более высокую растворимость в воде выше 90 г/100 мл - 50-кратное повышение.

Обнаружено, что несколько усилителей растворимости подходят для требуемого диапазона растворимости: DMA, ПЭГ-400, диметилацетамид, полиэтиленгликоль, полиоксилированное касторовое масло, N-метил-2-пирролидинон, 1-этенил-2-пирролидинон, полисорбат 20, полисорбат 80, гидроксипропил-циклодекстрин и сульфобутиловый эфир--циклодекстрин (каптизол). Подтверждено, что из указанных усилителей растворимости оба циклодекстрина являются лучшими в отношении растворимости, биологической активности и стабильности. Соответственно, было решено выбрать каптизол в качестве усилителя растворимости для применения в композициях согласно примеру 5 и исследовать обе композиции на основе циклодекстрина далее. Конечная композиция для клинических исследований согласно примеру 5 состоит из 120 мг/мл каптизола в воде с требуемым количеством пептида (0,5, 1,0 или 2,5 мг/мл), и НСl, и NaOH для корректировки рН.

Усилители растворимости, используемые для разработки композиции соединения Список сорастворителей и стабилизаторов, оцениваемых в композициях пептидного соединения Композиции соединения 1 при низких концентрациях пептида Пример 2. Протокол приготовления раствора соединения 1 в каптизоле.

Стандартные способы растворения, такие как смешивание сухого соединения 1 и сухого каптизола в воде или добавление соединения 1 к приготовленному раствору каптизола и воды, не приводили к полному растворению в требуемых концентрациях. Тестировали несколько разных концентраций как соединения 1, так и каптизола при разных уровнях рН. Однако следующий способ приготовления раствора соединения 1 в каптизоле приводил к полному растворению в требуемых концентрациях.

Каптизол, соединение 1 и вода.

1. Взвешивают соответствующее количество каптизола, чтобы получить конечную концентрацию 120 мг/мл.

2. Добавляют 80% конечного количества воды и перемешивают в течение 10 мин с использованием магнитной мешалки.

3. Взвешивают соединение 1, чтобы получить конечную концентрацию 2,5, 2,0, 1,0, 0,5 или 0,1 мг/мл.

4. Добавляют пептид к раствору каптизола. Перемешивают в течение 1 ч.

5. Повышают рН, чтобы получить прозрачный раствор (в композиции 2,0 мг/мл может быть необходимо повысить рН немного выше 9). рН необходимо корректировать, используя 1,0н. НСl и 1,0н.

NaOH. Перемешивают в течение 10 мин.

6. При необходимости корректируют рН до диапазона от 7,5 до 8,5 (используя либо НСl, либо NaOH, 1,0н.).

7. Добавляют воду до конечного объема.

8. Фильтруют раствор через фильтр из ацетата целлюлозы с порами 0,2 мкм.

9. Регистрируют конечное значение рН.

10. Делят на аликвоты и хранят при подходящей температуре.

Пример 3. Лиофилизация раствора соединения 1 и каптизола.

Данный способ лиофилизации отличается от других способов лиофилизации тем, что процентное содержание сухого остатка в композиции выше (12%), тогда как лиофилизованные продукты обычно содержат от 5 до 10% сухого остатка.

В качестве лиофильной сушилки использовали лиофилизатор Edwards Lyoflex 0.6. Осуществляли IQ/OQ Готовили растворы соединения 1 и каптизола с концентрациями соединения 1 0,5, 1,0 и 2,5 мг/мл.

Загружаемый объем доводили до 1 мл (1,05 г).

1. Замораживание.

2. Выдерживание (при низкой температуре).

3. Сушка в вакууме в две стадии:

3.1. первичная сушка - нагревание стеллажа для сушки до верхней поддерживаемой температуры, контроль температуры стеллажа на верхнем поддерживаемом уровне, 3.2. вторичная сушка - снижение давления до минимального значения при верхней поддерживаемой температуре стеллажа.

Замораживание - замораживание проводили от комнатной температуры до -40°С в течение 2 ч.

Стеллажи поддерживали при -40°С в течение 3 ч.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар. Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч.

Общее время процесса составляло 31 ч.

Результаты по содержанию воды:

партия 1: 3,8%, партия 3: 4,9%.

Так как результаты по содержанию воды при использовании способов, приводящих к получению партий 1, 2 и 3, были выше, чем требуемое значение, было решено добавить стадию вторичной сушки при той же самой температуре и при низком давлении.

Сушка - сушку осуществляли при давлении 110 мкбар. Температуру стеллажа увеличивали до 20°С в течение 13 ч и поддерживали при данной температуре еще в течение 13 ч (партия 4) или 8 ч (партия 5).

Давление понижали до 10 мкбар дополнительно в течение 5 ч.

Общее время процесса составляло 36 ч.

Результаты по содержанию воды:

партия 4: плацебо - 3,0%, партия 5: плацебо - 4,1%.

Как показано, разработан удовлетворительный способ лиофилизации соединения 1 с каптизолом.

Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы разработанный способ является более длительным, чем имеющиеся современные циклы лиофилизации пептидов, и имеет дополнительную стадию вторичной сушки.

В табл. 4 суммирован разработанный способ.

Пример 4. Исследование биологической активности in vivo лиофилизованного раствора соединения (DP, 1 мг/флакон, 12% каптизол).

Биологическую активность проверяли по ингибированию секреции IL-2 из специфичных по отношению к стандартному образцу (RS) соединения 1 Т-клеток после подкожной (п/к) обработки лиофилизованным раствором соединения, т.е. лекарственным продуктом (DP) при двух концентрациях. Результаты обработки сравнивают с результатами обработки мышей соединением 1 (RS) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Результаты показаны в таблице ниже и на фиг. 2.

1. Иммунизация (соединение 1 RS, эмульгированное с CFA, во все четыре подушечки лап) 0 день a) соединением 1 RS в концентрациях 0; 0,5; 1; 2,5; 5; 10; 25; 50 и 100 мкг/мл;

b) пептидом с обратным порядком аминокислот относительно соединения 1 (негативный контроль);

c) Con А (позитивный контроль).

4. Инкубация культуры в течение 20 ч при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере с 5% СО2.

5. Измерение IL-2 с помощью ELISA.

НПКО = Ниже предела количественного определения.

Строки 1-4 не включали в кривую.

НП = Не применимо.

Пример 5. Оценка оптимальной дозы для обработки.

В дальнейшем описании использовали следующие сокращения.

ЕМ-3 Обогащенная среда RPMI-1640 + фетальная сыворотка теленка TGF- Трансформирующий фактор роста-бета Группу из 20 мышей иммунизировали 50 мкг/мышь соединения 1 RS. Иммунизированных мышей распределяли на пять групп обработки, которые указаны далее: плацебо, 25, 50, 100 и 200 мкг/мышь соединения 1 DP (подкожное введение). Через 10 дней после иммунизации и обработки извлекали LN и готовили суспензию отдельных клеток. Затем измеряли секрецию in vitro IFN- и TGF- культивируемыми клетками в ответ на активацию несколькими концентрациями соединения 1 RS.

3. Активация in vitro клеток LN от обработанных мышей 10 день 4. Сбор культуральной среды (для определения IFN-) 12 день 5. Сбор культуральной среды (для определения IGF-) 13 день 6. ELISA в отношении IFNELISA в отношении TGFТаблица Животные.

Мыши: 20 самок мышей BALB/c, поставляемых центром разведения животных Harlan, Rehovot.

Возраст во время иммунизации (неделя+дни): 10.

Средняя масса мышей, включенных в эксперимент: 19,01 г.

Вещества.

Общие реагенты: 70% этанол получали из 96% этанола разбавлением очищенной Н2O.

Эмульсию CFA-соединение 1 RS (500 мкг/мл, 50 мкг/мышь) готовили следующим образом.

1. 1,874 мг соединения 1 растворяли в 1,87 мл WFI, получая раствор 1 мг/мл.

2. Раствор проверяли с помощью рН-индикаторной полоски и обнаружили, что он имеет рН 5.

3. 1,5 мл раствора эмульгировали с 1,5 мл CFA, получая конечную концентрацию 500 мкг/мл.

Обработку проводили п/к-инъекцией 200 мкл раствора.

1,2 г каптизола растворяли в 10 мл WFI, получая 12% раствор каптизола.

Последовательность операций при проведении эксперимента Взвешивание мышей.

Мышей взвешивали перед иммунизацией. Средняя масса мышей: 19,01±0,97 г.

Иммунизацию проводили инъекцией 100 мкл эмульсии для иммунизации (50 мкл в каждую подушечку задних лап).

Обработка.

После стадии иммунизации мышей обрабатывали п/к-инъекцией по 200 мкл из указанных растворов для обработки, содержащих соединение 1 DP или 12% каптизол, в заднюю часть шеи.

Культивирование in vitro.

Мышей забивали смещением шейных позвонков. LN извлекали из задних конечностей и переносили в стерильную чашку Петри, содержащую примерно 5 мл RPMI. Клетки выделяли осторожным продавливанием ткани через стальную сетку с ячейками 200 мкм. Клетки собирали и центрифугировали при 300 g в течение 10 мин при комнатной температуре.

Суспензии отдельных клеток готовили из объединенных LN из каждой экспериментальной группы.

Суспензии 2,5 и 5,0 млн клеток/мл/лунку культивировали с соединением 1 RS (0-100 мкг/мл) в ЕМ-1.

Секрецию IFN- и TGF- в качестве показателя клеточного ответа определяли посредством ELISA культуральной среды (48 ч для IFN- и 72 ч для TGF-).

Результаты подсчета клеток и приготовление клеточных суспензий (10106/мл) Суспензию 1010 клеток/мл разбавляли 1:2 добавлением 5 мл ЕМ-1 к 5 мл клеточной суспензии.

Готовили 3 планшета для культуры ткани. В каждый планшет добавляли следующее.

Контроль фона (клетки, инкубированные с культуральной средой) 0,5 мл суспензии клеток 0,5 мл культуральной среды (ЕМ-1) Позитивный контроль системы (клетки, стимулированные Con A) 0,5 мл суспензии клеток 0,5 мл Con A 5 мкг/мл в ЕМ-1 (конечная концентрация 2,5 мкг/лунку) Клетки, инкубированные с активирующими растворами соединения 1 (образцы) 0,5 мл суспензии клеток 0,5 мл соединения 1 RS 6,25-200 мкг/мл (конечная концентрация 3,125-100 мкг/мл/лунку) После приготовления 48-луночных планшетов готовили 96-луночные планшеты, используя 100 мкл из суспензии клеток и 100 мкл из активирующих растворов.

Планшеты для культивирования инкубировали при 37°С в инкубаторе с увлажнением и 5% СO2 в течение 48 или 72 ч.

Культивируемые планшеты центрифугировали при 300 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадки (850 мкл из каждой лунки) переносили либо в зеркальные планшеты, либо в пробирки.

Затем надосадок делили на аликвоты для работы (две аликвоты по 200 и одна аликвота объемом 450 мкл), чтобы избежать повторного замораживания/оттаивания образцов. Каждую пробирку помечали соответствующей подробной информацией.

1. Код эксперимента и время после инкубации.

2. Номер группы и образца.

3. Активатор и концентрация.

4. Дата сбора надосадка.

Надосадки хранили при -20°С вплоть до использования в ELISA.

Конечная концентрация цитокина, пг/мл (2,5 млн клеток/лунку) Конечная концентрация цитокина, пг/мл (5 млн клеток/лунку) Результаты также представлены на фиг. 3, 4.

Секреция IFN-.

1. В группе плацебо показана линейная дозовая зависимость при активации соединением 1 in vitro.

Данный график сходен с графиком, полученным для модели ex vivo при такой же дозе иммунизации (50 мкг/мышь) и культуральной среде (ЕМ-1).

2. Дозовая зависимость при активации соединением 1 in vitro имела место во всех тестированных группах.

3. Значимое ингибирование секреции IFN- наблюдали при всех дозах, используемых для обработки (среднее 95% ингибирование при дозе обработки 25 мкг/мышь). Может быть выявлена обратная корреляция между дозой, которая служит для обработки, и % ингибирования, в основном, при использовании 5106 клеток/лунку. При использовании 2,5106 клеток/лунку обработка животных 50 мкг/мышь давала большее ингибирование, чем 100 или 200 мкг. Точка 25 мкг пропущена (недостаток клеток).

4. Большее ингибирование наблюдали при использовании 5106 клеток/лунку вместо 2,5106 клеток/лунку.

5. На линейном диапазоне кривой SD ингибирования в % было низким.

6. Техническая проблема, связанная с Con А, выражена при использовании 2,5106 клеток/лунку.

Секреция TGF-.

1. В группе плацебо не наблюдали дозовой зависимости при активации in vitro соединением 1. Секретируемый уровень TGF- был ниже предела определения в ELISA во всех других группах обработки.

Пример 6. Оптимизации цикла сублимационной сушки в случае соединения 1 и каптизола для инъекции (0, 0,5, 1,0 и 2,5 мг/флакон).

Целью данного исследования была оптимизация цикла сублимационной сушки соединения 1 с каптизолом для инъекции, чтобы улучшить форму лиофилизуемой массы и избежать смятия и растрескивания. Соответственно, было решено улучшить и оптимизировать цикл лиофилизации. Данный цикл перенесен в промышленные лиофилизаторы для производства партий для испытаний фазы I.

Готовили партии пептида с концентрациями 0,5, 1,0, 2,5 мг/мл и плацебо и осуществляли несколько циклов сублимационной сушки. В качестве сублимационной сушилки использовали лиофилизатор Edwards Lyoflex 0.6.

Тестировали растворимость, содержание воды и внешний вид лиофилизованного материала.

Согласно полученным результатам выбран новый цикл лиофилизации соединения 1. Вследствие высокого процентного содержания сухого остатка (12%) и поэтому конденсированной лиофилизуемой массы новый способ является более длительным, чем цикл лиофилизации в примере 3, и имеет дополнительную стадию первичной сушки. В табл. 12 суммированы различия между способами.

Пример 7. Действие соединения 1 (введенного в каптизоле) на симптомы волчанки у склонных к СКВ самок мышей (NZBxNZW)F1.

Пациентов, принимающих участие в клинических испытаниях, будут лечить соединением 1, используя в качестве эксципиента каптизол (натриевую соль сульфобутиловый эфир-бета-циклодекстрина).

По этой причине важно определить, будет ли обработка мышей (NZBxNZW)F1 композицией соединения 1, вводимого в каптизоле, оказывать такое же лечебное действие на симптомы волчанки, которое наблюдается при обработке мышей такой же линии соединением 1 в PBS.

С этой целью самок мышей (NZBxNZW)F1 (примерно 8-месячного возраста) делили на 3 группы, которые обрабатывали подкожно 1 раз в неделю в течение 10 недель либо отдельно каптизолом (n=8), либо 25 или 50 мкг/мышь соединения 1 в каптизоле (n=9 и 10, соответственно). Указанные дозы были выбраны потому, что предшествующие исследования показали, что дозы в данном диапазоне более эффективны в ослаблении симптомов СКВ, чем более высокие тестированные дозы (100 и 200 мкг/мышь).

Одну и ту же партию лекарственного вещества использовали в данном исследовании и в первом клиническом испытании фазы I соединения 1.

У мышей проводили наблюдения в отношении анти-днДНК-антител и протеинурии. После забивания мышей определяли интенсивность ICD в почках.

Как можно видеть на фиг. 5, не наблюдалось значимых различий между группами по уровням днДНК-специфичных антител после 10 инъекционных обработок.

В табл. 13 также показано, что целебное действие обработки соединением 1 может наблюдаться, начиная с 5-й инъекции, и поддерживается до 10-й инъекции. Средние уровни протеинурии в контрольной группе, обработанной каптизолом, были, соответственно, выше, чем в группах, обработанных соединением 1. В табл. 13 также показано, что наблюдалось уменьшение интенсивности ICD в почках в обеих группах, обработанных разными дозами соединения 1. Имела место общая тенденция, свидетельствующая, что более низкая доза (25 мкг/мышь) была более эффективна, чем более высокая доза (50 мкг/мышь) в снижении клинических симптомов СКВ у данных мышей.

Клинические симптомы СКВ у мышей (NZBxNZW)F1, обработанных 25 или 50 мкг/мышь соединения ICD = отложения иммунных комплексов. Шкала интенсивности ICD: 0 = нет; 1 = умеренное; 2 = тяжелое; 3 = тяжелое/очень интенсивное.

Гибель одного животного с высоким уровнем протеинурии привела к более низкому среднему значению в группе.

р0,05 (по сравнению с контрольными мышами, обработанными каптизолом; Манн-Уитни).

На фиг. 6 показаны типичные срезы одной почки из каждой группы обработки. Срезы верхнего ряда получены от мыши, обработанной каптизолом, срезы среднего ряда от мыши, обработанной 50 мкг/мышь соединения 1, и срезы нижнего ряда получены от мыши, обработанной 25 мкг/мышь соединения 1. Можно видеть, что интенсивность отложений иммунных комплексов, наблюдаемая в срезах почек мышей, обработанных соединением 1 (растворенным в каптизоле) при обоих уровнях доз, была намного ниже, чем интенсивность, наблюдаемая в контрольной группе.

Пример 8. Клиническое исследование фазы I.



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Отчет о деятельности в 2000 году Красноярск 2000 РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ УТВЕЖДАЮ Директор ИВМ СО РАН член-корреспондент РАН В.В.Шайдуров “” _ 2000 г. ОТЧЕТ о результатах научно-исследовательских работ, основных результатах практического использования законченных разработок и научно-организационной деятельности в 2000 году...»

«Мужской гид по развлечениям в Самаре 16+ рекламно информационное издание №13 (2579) 27 марта 2013 г. ДОРОГАЯ ДОРОГА Неужели, в самом деле, нам построят магистрали стр. 2 КАК В КИНО Если у вас уже восьмой ас блин комом, мом, к черту блины, лепите, лепите комочки! и! стр. ПИПЛ www.dosugsamara.ru 27 марта - 2 апреля 2013 г. ГОВОРЯТ, ЧТО. Говорят, что после последней оценки состояния городских дорог, инспекторы дорожного движения приняли решение начать штрафовать автомобилистов за отсутствие в...»

«ГОДОВОЙ ОТЧЕТ АО АЛЬЯНС БАНК ЗА 2005 ГОД Алматы, 2006 г. Приложение 1 Ежегодная отчетность АО Альянс Банк Раздел 1. ОПИСАНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛИСТИНГОВОЙ КОМПАНИИ ЗА ОТЧЕТНЫЙ ПЕРИОД В 2002 году, в момент выхода нашего банка на рынок Казахстана под новым именем и с новой стратегией бизнеса, мы поставили перед собой цель – в кратчайшие сроки войти в пятерку лидеров банковского сектора страны. Для реализации наших смелых планов была проделана большая работа, и полученные результаты очень скоро...»

«БЮЛЛЕТЕНЬ. ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ КАПИТАЛ ПРОГРЕСС ТЕМА ВЫПУСКА ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ГРАМОТНОСТИ ШКОЛЬНИКОВ КВАРТАЛЬНОЕ ИЗДАНИЕ ВЫПУСК № 1 (1), МАЙ 2014 ГОДА Бюллетень. Человеческий капитал Выпуск № 1, май 2014 года Уважаемые читатели! Национальный аналитический центр с 2007 года реализует системные аналитические исследования для государственных органов Республики Казахстан. С 2014 года Национальный аналитический центр начинает выпуск серии ежеквартальных бюллетеней, освещающих актуальные вопросы развития...»

«ЕВРЕЙСКАЯ УЛИЦА ГАЗЕТА ЕВРЕЙСКОЙ ОБЩИНЫ ЗАПОРОЖЬЯ Выпуск №7 Ияр (апрель-май) 2013 г. Свет Торы Существует еврейский обычай зажигать свечи в годовщину смерти. Это символизирует, что его свет ещё сияет, его влияние на нас продолжается и после смерти. Рабби Шимон написал книгу Зоар, которая была первой комплексной работой Каббалы, когдалибо совершённой в письменной форме. До тех пор мистическое учение в иудаизме передавалось из уст в уста, от учителя к ученику в тайных обществах. Рабби Шимон...»

«год вежих с ешений! р СИСТЕМЫ ВИдЕонАБЛЮдЕнИЯ CИСТЕМЫ КонТРоЛЯ доСТупА группа компаний охРАнно-поЖАРнЫЕ CИСТЕМЫ опоВЕщЕнИЕ И ТРАнСЛЯцИЯ ИСТоЧнИКИ пИТАнИЯ МонТАЖнЫЕ МАТЕРИАЛЫ 2014 лето/осень КАТАЛОГ СИСТЕМ БЕЗОПАСНОСТИ www.dean.ru dean.ru КАТАЛОГ 2014 издание ГИБРИДИЗАЦИЯ СОДЕРЖАНИЕ ПРОДОЛЖАЕТСЯ. 4 - 25 СИСТЕМЫ ВИДЕОНАБЛЮДЕНИЯ HD-SDI видеонаблюдение IP видеонаблюдение Аналоговое видеонаблюдение Аксессуары 26 - 31 СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ ДОСТУПА Видеодомофоны Вызывные панели 013 календарный год был...»

«tv-программа совет чудесная сюрпризы стр. 7-8, 17-18 дает ответ механотерапия осени афиша стр. 3 стр. 22 стр. 12 стр. 16 ОЛГИЕ Издается с августа 2000 года РУДЫ № 38 (127) пятница, 25 сентября 2009 года Еженедельная городская газета http://ia-dolpr.mosoblonline.ru Картинки с выставки С 23 по 26 сентября в Международном выставочном центре Крокус Экспо проходит шестая межотраслевая Международная выставкапрезентация Московской области ПодмосковьеНынешний год для Московской области особенный –...»

«APPAREL Q1 2013 1 СОДЕРЖАНИЕ MOTORSPORT MINI Male+Unisex.. Female. DUCATI Male+Unisex.. BMW Male+Unisex.. Female. MERCEDES Male+Unisex.. FERRARI Male+Unisex.. Female. Infant+Youth LIFESTYLE Male.. Female. FUNDAMENTALS Male+Unisex.. Female. Infant+Youth SWIMWEAR Male.. ECOSPHERE Male.. RUNNING Male....»

«ISSN 0002 3272 ТРУДЫ ГЕОЛОГИЧЕСКОГО ИНСТИТУТА С.Ю. Колодяжный СТРУКТУРНО КИНЕМАТИЧЕСКАЯ ЭВОЛЮЦИЯ ЮГО ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ БАЛТИЙСКОГО ЩИТА В ПАЛЕОПРОТЕРОЗОЕ ГЕОС Российская академия наук Геологический институт Российский фонд фундаментальных исследований Russian Academy of Sciences Geological Institute The Russian Foundation for Basic Research Transactions of the Geological Institute Founded in 1 Vol. S.Yu. Kolodiazhnyi Paleoproterozoic structural kinematic evolution of the South East Baltic Shield...»

«Когда сочувственно на наше слово Одна душа отозвалась – Не нужно нам возмездия иного, Довольно с нас, довольно с нас. Ф. Тютчев 1 А.Г. Гребнев Замечательно, что будет книга об Анатолии Гребневе. Мы его очень любим. Он прекрасный человек, надёжный, настоящий друг, лёгкий, с ним всегда хорошо, он поддержит и утешит, не оставит с бедой наедине, а радость усилит своей светлой энергией, гармошкой, стихами, песнями. Он и поэт прекрасный. Стихи его такие русские, такие наши. Они от родной земли, от...»

«Российский государственный гуманитарный университет 26.01.2010 ПрООП по направлению 034000 ДОКУМЕНТОВЕДЕНИЕ и АРХИВОВЕДЕНИЕ (бакалавр) ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГУМАНИТАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Утверждено И.о. ректора Российского государственного гуманитарного университета В.В. Минаев 25_января 2010 г. Примерная основная образовательная программа высшего профессионального образования...»

«©WienTourismus/Lukas Beck Венский гид 2009 www.vienna.info/ru Венский гид Издание 2009 Издание Венского совета по туризму Венский гид можно также найти на странице Интернета http://b2b.vienna.info Издатель: Венский совет по туризму / Wien Tourismus, A-1020 Wien Несмотря на тщательную проверку всех данных, мы не можем взять на себя ответственность за их абсолютную достоверность. Возможны изменения. Данные по состоянию на Октябрь 2008 г. Содержание Радость жизни & креативная сцена 2009: год...»

«Современные проблемы дистанционного зондирования Земли из космоса. 2013. Т. 10. № 4. С. 262–273 Метод комплексного мониторинга лесов на основе оптических и радиолокационных данных ДЗЗ М.В. Черемисин, В.Д. Бурков Московский государственный университет леса Мытищи, Московская обл., Россия E-mail: ch_maksimus@mail.ru В настоящей статье анализируются текущие подходы глобального и регионального мониторинга лесов. Обсуждаются их положительные и отрицательные особенности. Предлагается метод...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра медико-социальной работы УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Особенности социальной работы с пожилыми людьми Основной образовательной программы по специальности – 040101.65 Социальная работа Благовещенск 2012 УМКД разработан д.с-х. наук профессором Симоновой Надеждой Павловной Рассмотрен и...»

«Николай Непомнящий 100 великих загадок природы 100 великих – Scan, OCR, SpellCheck: Miger, 2007 Непомнящий Н. Н. 100 великих загадок природы: Вече; М.; 2006 ISBN 5-9433-1124-9 Аннотация Книга из популярной серии 100 великих рассказывает о самых удивительных, захватывающих загадках и тайнах неживой природы, растительного мира и царства животных, а также о невероятных, но вполне реальных существах, больше похожих на персонажи мифов и легенд. Тунгусский зал саркофагов и балтийские гейзеры, поющие...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И. ЛОБАЧЕВСКОГО НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт аспирантуры и докторантуры УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС РАЗВИТИЕ ЛИЧНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ Уровень образования: Высшее образование – подготовка кадров высшей квалификации Нижний Новгород 2013 Разработчики представленной программы:...»

«Государственный комитет по науке и технологиям Республики Беларусь КАТАЛОГ ОРГАНИЗАЦИЙ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ, ВЫПОЛНЯЮЩИХ НАУЧНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И РАЗРАБОТКИ МИНСК 2009 УДК 061.61 (035) (476) ББК 72.4 (2) (4Беи) K 29 Составители: А.Н. Коршунов, Н.Н. Скриган, И.А. Хартоник, А.Е. Черныш Под редакцией: д-ра техн. наук И.В. Войтова Каталог организаций Республики Беларусь, выполняющих научные исследования и разработки. — К Минск: ГУ БелИСА, 2009. — 348 с. ISBN 978-985-6874-01- УДК 061.61 (035) (476) ББК...»

«Борис Евсеевич Чертой Книга 2. Ракеты и люди. Фили-Подлипки-Тюратам Предисловие к первому изданию В конце 1994 года вышла из печати первая книга моих воспоминаний Ракеты и люди. Незамедлительно последовали письма и устны е отзывы, телеф онны е звонки, содерж ащ ие как хвалу, так и справедливые замечания. Интерес, с которым была встречена книга, превзошел мои ожидания. У многих читателей возникал в о п р о с: ко гд а б у д е т п р о д о л ж е н и е ? Не о б л а д а я л и те р а ту р н ы м о п ы...»

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского В. И. Швецов, Е. В. Малкина, Е. И. Маркова Использование программной системы Moodle для создания электронных учебно-методических материалов Методическая разработка для преподавателей Нижний Новгород 2011 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ 1. ОСНОВНОЙ ИНСТРУМЕНТАРИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В СИСТЕМЕ ДИСТАНЦИОННОГО ОБУЧЕНИЯ ННГУ 2. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ 2.1....»

«Владимир Авдеев & Михаил Диунов Карлтон Стивенс Кун – классик американской антропологии Предисловие к русскому изданию Расы Европы Антрополог – труженик естествознания Прасковья Николаевна Тарновская, русский антрополог У истоков каждой научной дисциплины стоят личности, которые налагают отпечаток на всю национальную школу развития, становясь символами нации, в концентрированной форме отражающими суть научного мировоззрения. Если говорить о такой важной области естествознания, как физическая...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.