WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение предоставляет модифицированные ферменты, обладающие более высокой ГТФ-циклогидролазной II ...»

-- [ Страница 1 ] --

011257

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение предоставляет модифицированные ферменты, обладающие более высокой

ГТФ-циклогидролазной II активностью по сравнению с соответствующими ферментами дикого типа.

Модифицированные ферменты и кодирующие их полинуклеотиды могут применяться для получения

рибофлавина, предшественников рибофлавина, флавинмононуклеотида (ФМН, FMN), флавинадениндинуклеотида (ФАД, FAD) и их производных.

Уровень техники Рибофлавин (витамин В2) синтезируется всеми растениями и многими микроорганизмами, но не вырабатывается высшими животными. Поскольку он является предшественником коферментов, таких как флавинадениндинуклеотид и флавинмононуклеотид, которые являются необходимыми для процессов ферментативного окисления углеводов, рибофлавин является важнейшим веществом, необходимым для базового метаболизма. У высших животных недостаток рибофлавина может вызвать облысение, кожное воспаление, ухудшение зрения и нарушение развития.

Создание штаммов, продуцирующих рибофлавин, с увеличенным содержанием и выходом рибофлавина было в прошлом достигнуто многими различными путями. Так, например, (1) для создания вариантов со случайными мутациями в геноме предпочтительного организма был использован классический мутагенез с последующей селекцией на наибольшую устойчивость к аналогам пурина и/или со скринингом на увеличенное производство рибофлавина. (2) В качестве альтернативы, конечные ферменты биосинтеза рибофлавина, то есть ферменты, катализирующие превращение гуанозинтрифосфата (ГТФ) и рибулозо-5-фосфата в рибофлавин, были суперэкспрессированны, что также привело к увеличению уровня образования целевого продукта. Тем не менее, во втором подходе, сильная суперэкспрессия белков, участвующих в биосинтезе рибофлавина, обусловила дополнительную метаболическую нагрузку на клетку-хозяина, которая могла, в свою очередь, вызывать реакции стрессового ответа, а также обуславливать другие нежелательные негативные эффекты для физиологии клеток.

Ферменты, необходимые для катализа биосинтеза рибофлавина из гуанозинтрифосфата (ГТФ) и рибулоза-5-фосфата, кодируются в В. subtilis четырьмя генами (ribG, ribB, ribA и ribH). Данные гены расположены в опероне, очередность генов в котором отличается от очередности ферментативных реакций, катализируемых данными ферментами. Например, ГТФ-циклогидролаза II, которая катализирует первую стадию биосинтеза рибофлавина, кодируется третьим геном в последовательности оперона, ribA.

Ген ribA также кодирует вторую ферментативную активность, а именно, 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4фосфатсинтазу (DHBPS), которая катализирует превращение рибулоза-5-фосфата в четырехуглеродное соединение 3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфат (DHBP). Дезаминаза и редуктаза кодируются первым геном оперона, ribG. Предпоследняя стадия биосинтеза рибофлавина катализируется люмазинсинтазой, продуктом последнего rib ген, ribH. Рибофлавинсинтаза, которая контролирует последнюю стадию синтетического пути, кодируется вторым геном оперона, ribB. Функция гена, расположенного на 3' конце rib оперона, на данный момент времени, неясна; хотя известно, что продукт данного гена не является необходимым для синтеза рибофлавина.

Транскрипция рибофлавинового оперона с ribP1 промотора контролируется посредством механизма аттенюации, с участием регуляторной лидерной области, расположенной между ribP1 и ribG. Мутации ribO внутри данной лидерной области приводят к прекращению регулирования экспрессии рибофлавинового оперона. Прекращение регулирования экспрессии также наблюдается у штаммов, несущих миссенс-мутации в гене ribC. Было показано, что ген ribC у В. subtilis кодирует флавинкиназу/ФАД-синтазу (Mack, M., et al., J. Bacteriol, 180:950-955, 1998). Прекращающие регулирование мутации уменьшают флавокиназную активность продукта гена ribC, что приводит к уменьшению внутриклеточной концентрации флавинмононуклеотида (ФМН), эффекторной молекулы рибофлавиновой регуляторной системы.

Недавно с применением методов генной инженерии был получен штамм Bacillus subtilis, который обеспечивает высокий выход рибофлавина в течение короткого ферментативного цикла (U.S. Patent № 5837528). Данный подход совмещал классическую селекцию генетических мутантов и улучшение ферментации с генноинженерным изменением генов биосинтеза рибофлавина посредством прекращения регулирования и увеличения уровня генной экспрессии. В данной системе экспрессия генов rib была увеличена посредством мутационного изменения кодирующего флавокиназу гена ribC, посредством сопряжения генов rib с сильными конститутивными промоторами, а также посредством увеличения числа копий генов rib.

Как уже обсуждалось выше, суперэкспрессия генов rib обуславливает дополнительную нагрузку на продуцирующие штаммы, которая, потенциально, может оказывать негативное влияние на продуцирование предшественников рибофлавина, рибофлавина, ФМН, ФАД, либо их производных. Имея целью обойти этот недостаток, настоящее изобретение описывает мутантные формы ГТФ-циклогидролазы II, имеющие увеличенную удельную активность. Использование таких мутантных форм ферментов в штаммах продуцентах, как самих по себе, так и совместно с улучшенными мутантными формами других Rib белков, сделает возможными более высокие уровни образования продукта с меньшей дополнительной нагрузкой, либо с полным отсутствием дополнительной нагрузки на метаболизм клеток.

-1Раскрытие изобретения Как это используется в настоящем изобретении, определение "ГТФ-циклогидролаза II" может включать в себя любой фермент, который способен катализировать превращение ГТФ в 2,5-диамино-6рибозиламино-4-(3Н)-пиримидинон-5'-фосфат (DRAPP). Не имеет значения, способен ли данный фермент катализировать последующие реакции, такие как, например, превращение рибулоза-5-фосфата в DHBP. "ГТФ-циклогидролаза II" может являться гомологичной одному или более ферментам, аминокислотные последовательности которых представлены на фиг. 1 либо в табл. 4. Определение "гомологичная" касается той ГТФ-циклогидролазы II, которая по меньшей мере приблизительно на 50% идентична, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 60% идентична, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 70% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 80% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 85% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90 или 95% идентична и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 98% идентична одной либо более аминокислотным последовательностям, как показано на фиг. 1 либо в табл. 4.

Определение "% идентичности", как это известно в данной области техники, соответствует степени соответствия между полипептидными либо полинуклеотидными последовательностями, в зависимости от обстоятельств, которая определяется соответствием между составами таких последовательностей.

"Идентичность" может быть быстро установлена с применением известных методов, например, с использованием программы BESTFIT (GCG Wisconsin Package, version 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) с применением следующих параметров: gap creation penalty 8, gap extension penalty 2 (значение параметров по умолчанию).

Определение "фермент дикого типа", либо "ГТФ-циклогидролаза II дикого типа" может включать в себя любую ГТФ-циклогидролазу II, гомологичную любому из ферментов, показанных на фиг. 1, либо в табл. 4, который используется как отправная точка для создания мутантов с повышенной активностью, в соответствии с настоящим изобретением. Определение "дикий тип" в контексте настоящего изобретения может включать в себя как встречающиеся в природе последовательности ГТФ-циклогидролазы II, так и варианты синтетических ферментов ГТФ-циклогидролаз II (до тех пор, пока они являются гомологичными любой из последовательностей, показанных на фиг. 1 или в табл. 4), если они могут стать более активными в результате использования любого из способов настоящего изобретения. Определения "ГТФ-циклогидролаза II дикого типа" и "немодифицированная ГТФ-циклогидролаза II" в настоящем изобретении используются взаимозаменяемо.

Определения "мутант", "мутантный фермент", или "мутантная ГТФ-циклогидролаза II'' могут включать в себя любой вариант, получаемый из данного фермента дикого типа/ГТФ-циклогидролазы II (в соответствии с приведенным выше определением) в соответствии со способами настоящего изобретения и являющийся более активным по сравнению с соответствующим ферментом дикого типа. В рамках настоящего изобретения не имеет значения, каким способом получен мутант(ы); такие мутанты могут быть получены, например, с использованием сайт-специфического мутагенеза, насыщающего мутагенеза, случайного мутагенеза/направленной эволюции, химического либо УФ-мутагенеза целых клеток/организмов, а также других способов, известных в данной области техники. Эти мутанты могут быть также получены, например, посредством создания синтетических генов и/или получены посредством in vitro (бесклеточной) трансляции. Для проверки удельной активности мутанты могут быть (супер-) экспрессированы с применением методов, известных специалистам в данной области техники. Определения "мутантная ГТФ-циклогидролаза II" и "модифицированная ГТФ-циклогидролаза II" в настоящем изобретении используются равнозначно. Это также касается определений "мутантный фермент" и "модифицированный фермент".

"Предшественник рибофлавина" и "производные рибофлавина, ФМН или ФАД" в контексте настоящей заявки на патент могут включать в себя любой и все метаболит(ы), нуждающиеся в ГТФциклогидролазе II, как в промежуточном ферменте их (био-) синтеза. В контексте настоящей заявки на патент не имеет значения, являются ли такие пути (био-) синтеза природными или неприродными (то есть путями, не встречающимися в природе, а созданными биотехнологически). Предпочтительно синтетические пути являются по своей природе биохимическими путями. Предшественники рибофлавина и производные рибофлавина, ФМН или ФАД включают в себя, но не ограничиваются такими соединениями, как DRAPP; 5-амино-6-рибозиламино-2,4-(1H,3Н)-пиримидиндион-5'-фосфат; 2,5-диамино-6рибитиламино-4-(3Н)-пиримидинон-5'-фосфат; 5-амино-6-рибитиламино-2,4-(1H,3Н)-пиримидиндион-5'фосфат; 5-амино-6-рибитиламино-2,4-(1Н,3Н)-пиримидиндион; 6,7-диметил-8-рибитиллюмазин (DMRL) и флавопротеины. Определение "рибофлавин" также включает в себя производные рибофлавина, такие как, например, рибофлавин-5-фосфат и его соли, такие как, например, натриевая соль рибофлавин-5фосфата.

Объектом настоящего изобретения, главным образом, является предоставить фермент, имеющий ГТФ-циклогидролазную II активность, указанный фермент модифицируется таким образом, что его каталитические свойства становятся более подходящими (то есть демонстрирует более высокую удельную активность) по сравнению со свойствами немодифицированного фермента ГТФ-циклогидролазы II.

-2Настоящее изобретение касается модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, которая демонстрирует более высокую (удельную) активность по сравнению с соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазой II, в которой:

(i) аминокислотная последовательность модифицированной ГТФ-циклогидролазы II содержит в себе по меньшей мере одну мутацию по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II и (ii) по меньшей мере одна мутация находится в одной либо более аминокислотной позиции, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных позиций, соответствующих позициям 261, 270, 276, 279, 308 и 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus suhtilis, как это показано в SEQ ID NO:2.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является предоставить модифицированную ГТФциклогидролазу II, в которой:

(i) удельная активность модифицированного фермента повышена в сравнении с соответствующим немодифицированным ферментом и (ii) аминокислотная последовательность модифицированного фермента включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3, 4, 5 или 6 мутацию(й) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2.

Определение "по меньшей мере одна мутация" соответствует одной либо более мутациям в позиции, определенной выше, ведущим к получению модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, имеющей повышенную удельную активность по сравнению немодифицированным ферментом. Модифицированный фермент, как это описано выше, может содержать только 1, 2, 3, 4, 5 или 6 мутации(й) в определенных выше позициях, ведущих к повышению удельной активности по сравнению с немодифицированным ферментом, но может также включать в себя другие аминокислотные мутации в других позициях до тех пор, пока получаемый в результате модифицированный фермент обладает повышенной удельной активностью. Таким образом, модифицированный фермент включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3, 4, 5, или 6 мутацию(й) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Примером таких мутаций в позициях отличных от тех, которые были определены выше, является аминокислотная мутация(ии) в позиции, соответствующей аминокислотной позиции 196, 282, и/или 325 в SEQ ID NO:2.

Как это используется в рамках настоящего изобретения, определение "удельная активность" означает скорость реакции ферментов ГТФ-циклогидролаз II дикого типа и мутантной ГТФ-циклогидролазы II в должным образом подобранных условиях реакции, как это описано, например, в Ritz et al. (J. Biol.

Chem. 276, 22273-22277, 2001), Koh et al. (Mol. Gen. Tent. 251, 591-598, 1996), или Schramek et al. (J. Biol.

Chem. 276, 44157-44162, 2001), либо как это детально описано в примере 2. "Удельная активность" характеризует количество потребленного субстрата и/или образованного продукта в течение определенного промежутка времени определенным количеством белка при определенной температуре. Как правило, "удельная активность" выражается в мкмоль потребленного субстрата или произведенного продукта в минуту на мг белка. Как правило, мкмоль/мин сокращенно обозначается как Eg (= единица). Поэтому единицы измерения удельной активности мкмоль/мин/(мг белка) или Eg/(мг белка) в настоящем документе используются равнозначно. Понятно, что в контексте настоящего изобретения удельная активность должна сравниваться на основе близкой или предпочтительно идентичной длины полипептидной цепи. Настоящее изобретение не должно быть несостоятельно при увеличении размера данного фермента дикого типа в результате, например, формирования слитого белка и уменьшения, вследствие этого, кажущейся удельной активности всего фермента.

В соответствии с настоящим изобретением модифицированная ГТФ-циклогидролаза II демонстрирует удельную активность, которая является более высокой, нежели активность соответствующего немодифицированного фермента. Предпочтительно, когда удельная активность модифицированной ГТФциклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения, повышена по меньшей мере на приблизительно 5, 10, 25, 40, 60, 70, 80, 85, 90%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 70% в сравнении с соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазой II (измерение удельной активности см. ниже). Предпочтительно, когда увеличение удельной активности соотносится с экспериментальными условиями, описанными в примере 1 настоящей заявки. Приблизительно 0,004-0, Eg/мл (соответствующая приблизительно 40 мкг/мл в случае ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis или 20 мкг/мл в случае лучших описанных здесь мутантов), предпочтительно приблизительно 0,004 Eg/мл ГТФ-циклогидролазной II активности, присутствовало в среде для количественного определения, и реакция проводилась при температуре 37°С.

Аминокислотная последовательность модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения, содержит в себе по меньшей мере одну мутацию, как это определено выше, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II. Такой мутацией может являться одна или более вставка, делеция и/или замена, предпочтительно одна либо более аминокислотная замена, где данная аминокислота, присутствующая в аминокислотой в аминокислотной последовательности модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения. Аминокислотная последовательность модифицированной ГТФ-циклогидролазы II может содержать в себе по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей немодифицированной ГТФциклогидролазы II, то есть может включать в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотную замену(замен) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2, предпочтительно 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен. Таким образом, модифицированный фермент содержит в себе предпочтительно по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 замен по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II.

В одном воплощении настоящего изобретения предоставляется модифицированная ГТФциклогидролаза II, получаемая из Bacillus, предпочтительно Bacillus subtilis, в которой:

(i) удельная активность модифицированного фермента повышена в сравнении с соответствующим немодифицированным ферментом и (ii) аминокислотная последовательность модифицированного фермента включает в себя одну, либо более, мутацию(й), включая 1, 2, 3, 4, 5, или 6 мутацию(й) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2.

В одном воплощении настоящего изобретения немодифицированный фермент соответствует ГТФциклогидролазе II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Таким образом, модифицированный фермент, имеющий повышенную удельную активность в сравнении с ферментом дикого типа, включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3, 4, 5, или 6 мутацию(й) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2. В следующем воплощении настоящего изобретения модифицированный фермент, имеющий повышенную удельную активность, как это определено выше, содержит в себе аминокислотную мутацию(и), отличную от мутации в аминокислотных позициях, приведенных выше, указанная дополнительная мутация(и) находится в позиции, выбранной из группы, состоящей из позиций 196, 282, 235 и любой их комбинации, предпочтительно аминокислотные замены, более предпочтительно замены представляют собой Y196C (замена тирозина на цистеин), А282Т (замена аланина на треонин) или F325Y (замена фенилаланина на тирозин).

Немодифицированная ГТФ-циклогидролаза II может представлять собой любую ГТФциклогидролазу II, для которой желательно увеличение удельной активности. Немодифицированные ферменты ГТФ-циклогидролазы II включают в себя, но не ограничиваются ферментами ГТФциклогидролазами II, получаемыми из природных источников, такими как ферменты эукариотического или прокариотического происхождения, предпочтительно грибкового либо бактериального происхождения. Более предпочтительно, когда немодифицированный фермент выбирается из ферментов, показанных на фиг. 1 или в табл. 4, или является гомологичным любой из аминокислотных последовательностей, как это показано на фиг. 1 или в табл. 4, в частности, выбирается из группы, состоящей из Ashbya, Saccharomyces, Eremothecium, Candida, Neurospora, Schizosaccharomyces, Archeoglobus, Streptomyces, Helicobacter, Escherichia, Corynebacterium, Thermotoga, Arabidopsis, Lycopersicum, Oryza, Alcaligenes, Pseudomonas, Dinococcus, Lactobacillus, Photobacterium и Bacillus, и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из Candida guilliermondii, Ashbya gossypii (Eremothecium ashbyii) (SEQ ID NO:33), Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Archeoglobus fulgidus, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Escherichia coli (SEQ ID NO:35), Coiynebacterium glutamicum (SEQ ID NO.37), Bacillus amyloliquefaciens (SEQ ID NO:39), Bacillus cereus (SEQ ID NO:41), Bacillus halodurans (SEQ ID NO:43), Thermotoga maritima, Arabidopsis thaliana, Lycopersicum exculentum, Oryza sativum, Alcaligenes eutrophus, Pseudomonas putida штамм KT2440, Corynebacterium efflciens, Deinococcus radiodurans, Lactobacillus plantarum, Photobacterium phosphoreum, Pseudomonas putida штамм KT2440 (второй ген) и Bacillus subtilis (SEQ ID NO:2). Наиболее предпочтительно, если немодифицированный фермент возможно получить из Bacillus subtilis.

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II, являющаяся предметом настоящего изобретения, может быть получена посредством мутирования соответствующей немодифицированной ГТФциклогидролазы II. В одном воплощении немодифицированный фермент соответствует ГТФциклогидролазе II В. subtilis, показанной в SEQ ID NO:2, и модифицированный фермент включает в себя одну либо более аминокислотную мутацию(и), включая 1, 2, 3, 4, 5, или 6 мутацию(й) в аминокислотной позиции(ях) 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2, где удельная активность указанного модифицированного фермента является повышенной по сравнению с немодифицированным ферментом.

Предпочтительно, когда по меньшей мере одна мутация находится в одной либо более аминокислотной позиции, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных позиций, соответствующих позициям 261, 279, 308 и 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO: 2. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения модифицированная ГТФ-циклогидролаза II включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3 или мутацию(и) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 261, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID фермент включает в себя измененные аминокислотные позиции 261, 279, 308 и/или 347, как это показано в SEQ ID NO:2, соответствующие аминокислотам V261, Q279, K308, и М374 соответственно.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения по меньшей мере одна мутация находится в одной либо более аминокислотной позиции, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных позиций, соответствующих позициям 270, 279, 308 и 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения модифицированная ГТФ-циклогидролаза II включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3 или 4 мутацию(и) в аминокислотной позиции(ям), соответствующей позициям 270, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2. Предпочтительно, когда модифицированный фермент возможно получить из В. subtilis и фермент включает в себя измененные аминокислотные позиции 270, 279, 308, и/или 347, как это показано в SEQ ID NO:2, соответствующие аминокислотам G270, Q279, K308, и М374 соответственно.

В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения по меньшей мере одна мутация находится в одной либо более аминокислотной позиции, выбранной из группы, состоящей из аминокислотных позиций, соответствующих позициям 276, 279, 308 и 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Таким образом, в следующем воплощении настоящего изобретения модифицированная ГТФ-циклогидролаза II включает в себя одну либо более мутацию(й), включая 1, 2, 3 или 4 мутацию(и) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позициям 276, 279, 308 и/или 347 в аминокислотной последовательности ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Предпочтительно, когда модифицированный фермент возможно получить из В. subtilis и фермент включает в себя измененные аминокислотные позиции 276, 279, 308 и/или 347, как это показано в SEQ ID NO:2, соответствующие аминокислотам А276, Q279, K308, и М374 соответственно.

Предпочтительно, когда одна либо более аминокислотная мутация(й) в модифицированной ГТФциклогидролазе II представляет собой одну либо более аминокислотную замену(ы).

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II может содержать в себе одну либо более мутацию(й), включая только одну мутацию в аминокислотной позиции, как это определено выше, такая мутация, в частности аминокислотная замена, может включать в себя одну мутацию в аминокислотной позиции, соответствующей позиции 261, 270, 276, 279, 308 или 347 в аминокислотной последовательности ГТФциклогидролазы II Bacillus subtilis, как это показано в SEQ ID NO:2. Аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 261, может представлять собой валин, аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 270, может представлять собой глицин, аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 276, может представлять собой аланин, аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 279, может представлять собой глутамин, аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 308, может представлять собой лизин, и аминокислота, присутствующая в немодифицированной ГТФ-циклогидролазе II и соответствующая позиции 347, может представлять собой метионин.

Аминокислота в последовательности немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II может быть изменена таким образом, что аминокислота, соответствующая позиции 261, может быть заменена на аланин (например, V261A), аминокислота, соответствующая позиции 270, может быть заменена на аланин либо аргинин (например, G270A и G270R), аминокислота, соответствующая позиции 276, может быть заменена на треонин (например, А276Т), аминокислота, соответствующая позиции 279, может быть заменена на аргинин (например, Q279A), аминокислота, соответствующая позиции 308, может быть заменена на аргинин (например, K308R), и аминокислота, соответствующая позиции 347, может быть заменена на изолейцин (например, M374I). В одном воплощении модифицированный фермент возможно получить из В. subtilis, включающим аминокислотную замену в позиции SEQ ID NO:2, которая выбрана из группы, состоящей из позиций 261, 270, 276, 279, 308 и 347. Предпочтительно, когда замена представляет собой V261A, G270A, G270R, А276Т, Q279R, K308R или M347I.

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II может включать в себя одну либо более мутацию(й), включая две мутации в аминокислотных позициях, как это определено выше, такие мутации, в частности аминокислотные замены, могут включать мутации в аминокислотных позициях, соответствующих двум из тех позиций, которые были определены выше, например, комбинации позиций, соответствующих позициям 261/270, 261/276, 261/279, 261/308, 261/347, 270/276, 270/279, 270/308, 270/347, 276/279, 276/308, 276/347, 279/308, 279/347 или 308/347, как это показано в SEQ ID NO:2. Предпочтительными являются аминокислотные замены, такие как V261A/A276T, V261A/Q279R, V261A/K308R, V261A/M347I, G270A/Q279R, G270A/K308R, G270A/M347I, A276T/Q279R, A276T/K308R или A276T/M347I, где позиции соответствуют аминокислотным позициям в SEQ ID NO:2. В одном воплощении настоящего изобретения такие предпочтительные замены присутствуют в модифицированной ГТФ-циклогидролазе II, которую возможно получить из В. subtilis, в которой немодифицированный фермент соответствует SEQ ID SEQ ID NO:2, включает в себя замены V261А/А276Т либо A276T/M347I.

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II может включать в себя одну либо более мутацию(й), включая три мутации в аминокислотных позициях, как это определено выше, такие мутации, в частности аминокислотные замены, могут включать мутации в аминокислотных позициях, соответствующих трем из тех позиций, которые были определены выше, в частности, комбинации позиций, соответствующих позициям 261/279/308, 261/279/347, 261/308/347, 270/279/308, 270/279/347, 270/308/347, 276/279/308, 276/308/347 или 276/279/347, как это показано в SEQ ID NO:2. Предпочтительными являются такие аминокислотные замены, как V261A/Q279R/K308R, V261A/K308R/M347I, V261A/Q279R/M347I, G270A/Q279R/K308R, G270A/K308R/M347I, G270A/Q279R/M347I, A276T/Q279R/K308R, A276T/K308R/M347I, или A276T/Q279R/M347I, где позиции соответствуют аминокислотным позициям в SEQ ID NO:2. В одном воплощении настоящего изобретения такие предпочтительные замены присутствуют в модифицированной ГТФ-циклогидролазе II, которую возможно получить из В. subtilis, в которой немодифицированный фермент соответствует SEQ ID NO:2. Предпочтительно, когда модифицированная ГТФ-циклогидролаза II В. subtilis, соответствующая SEQ ID NO:2, включает в себя замены A276T/Q279R/M347I.

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II может включать в себя одну либо более мутацию(й), включая четыре мутации в аминокислотных позициях, как это определено выше, такие мутации, в частности аминокислотные замены, могут включать мутации в аминокислотных позициях, соответствующих четырем из тех позиций, которые были определены выше, в частности, комбинации позиций, соответствующих позициям 261/279/308/347, 270/279/308/347 или 276/279/308/347, как это показано в SEQ ID NO:2. Предпочтительными являются такие аминокислотные замены, как V261A/Q279R/K308R/M347I, G270A/Q279R/K308R/M347I или A276T/Q279R/K308R7M347I, где позиции соответствуют аминокислотным позициям в SEQ ID NO:2. В одном воплощении настоящего изобретения, такие предпочтительные замены присутствуют в модифицированной ГТФ-циклогидролазе II, которую возможно получить из В.

subtilis, в которой немодифицированный фермент соответствует SEQ ID NO:2. Предпочтительно, когда модифицированная ГТФ-циклогидролаза II В. subtilis, соответствующая SEQ ID NO:2, включает в себя замены A276T/Q279R/K308R/M347I.

Наиболее предпочтительными являются комбинации мутаций, раскрытые в табл. 1 или 2 (см. ниже). Аминокислотные позиции, определенные в этих примерах, могут быть перенесены на ферменты ГТФ-циклогидролазы II различного происхождения, как показано, например, на фиг. 1 или в табл. 4.

Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II, являющаяся предметом настоящего изобретения, может содержать в своем составе инородные аминокислоты предпочтительно на ее N- или С-конце. Определение "инородные аминокислоты" соответствует аминокислотам, которые не присутствуют в природной (встречающейся в природе) ГТФ-циклогидролазе II предпочтительно последовательности, состоящей по меньшей мере приблизительно из 3, по меньшей мере приблизительно из 5 или по меньшей мере приблизительно из 7 следующих друг за другом аминокислот, которые не присутствуют в природной ГТФ-циклогидролазе II. Предпочтительные последовательности инородных аминокислот включают в себя, но не ограничиваются метками ("tags"), которые облегчают очистку рекомбинантно полученной модифицированной ГТФ-циклогидролазы II. Примеры таких меток включают в себя, но не ограничиваются "His6" метка, FLAG tag, myc tag и т.п. Для расчета удельной активности значения должны корректироваться с учетом данных дополнительных аминокислот (см. также выше).

В другом воплощении настоящего изобретения модифицированная ГТФ-циклогидролаза II может содержать в себе одну либо более, например две, делеции по сравнению с аминокислотной последовательностью, соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазой II. Предпочтительно, когда делеции затрагивают N- или С-концевые аминокислоты соответствующей немодифицированной ГТФциклогидролазы II и не уменьшают, в значительной степени, функциональные свойства, такие как, например, удельная активность фермента.

Полипептиды и полинуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, включающего модифицированные ферменты ГТФ-циклогидролазы II, могут быть предоставлены в изолированном виде и предпочтительно очищенными до гомогенности. Как это используется в рамках настоящего изобретения, определение "изолированный" соответствует тому факту, что материал отделен от его исходного окружения (например, от природного окружения, если материал встречается в природе). Например, встречающийся в природе полинуклеотид либо полипептид, присутствующий в живом микроорганизме, не является изолированным, но тот же полинуклеотид либо полипептид, отделенный от некоторых либо всех сосуществующих с ним в природной системе материалов, является изолированным. Такие полинуклеотиды могут представлять собой части вектора и/или такие полинуклеотиды либо полипептиды могут представлять собой части композиции и будут являться изолированными, когда такой вектор либо композиция не будут являться частями их природного окружения. Изолированный полипептид является предпочтительно более чем на 80% очищенным, более предпочтительно более чем на 90% очищенным, еще более предпочтительно более чем на 95% очищенным, наиболее предпочтительно более чем на 99% очищенным. Степень очистки может быть определена в соответствии с методами, известными в данной геле (SDS-PAGE) и последующей окраски белков. Полосы, соответствующие белкам, могут затем быть посчитаны с использованием денситометрии. Кроме того, методы определения степени очистки известны каждому среднему специалисту в данной области техники.

Настоящее изобретение также касается полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, которая кодирует модифицированную ГТФ-циклогидролазу II в соответствии с настоящим изобретением. Определение "полинуклеотид", как оно используется в рамках настоящего изобретения, соответствует полирибонуклеотиду либо полидезоксирибонуклеотиду, который может представлять собой немодифицированную РНК или ДНК либо модифицированную РНК или ДНК. Полинуклеотиды включают в себя, но не ограничиваются, одно- и двухцепочечную ДНК, ДНК, представляющую комбинацию одно- и двухцепочечных участков, одно- и двухцепочечную РНК и РНК, которая представляет собой комбинацию одно- и двухцепочечных участков, гибридные молекулы, содержащие в себе ДНК и РНК, которые могут представлять собой одноцепочечные либо, что является более типичным, двухцепочечные участки или комбинацию одно- и двухцепочечных участков. Определение "полинуклеотид" включает в себя ДНК или РНК, которая содержит в своем составе одно либо более редкое основание, например инозин, либо одно или более модифицированное основание, например трифенилметилированное основание.

Полинуклеотид настоящего изобретения может быть с легкостью получен посредством модификации полинуклеотидной последовательности, которая кодирует немодифицированную ГТФциклогидролазу II. Примеры таких полинуклеотидных последовательностей, кодирующих немодифицированные ферменты ГТФ-циклогидролазы II, включают в себя, но не ограничиваются аминокислотными последовательностями на фиг. 1 или в табл. 4, в частности SEQ ID NO:2, 33, 35, 37, 39, 41 и 43. Не ограничивающие примеры полинуклеотидов, кодирующих модифицированные ферменты ГТФциклогидролазы II, в соответствии с настоящим изобретением показаны в SEQ ID NO:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 и 26.

Способы введения мутаций, таких как, например, вставок, делеций и/или замен в нуклеотидную последовательность, кодирующую немодифицированную ГТФ-циклогидролазу II, включают в себя, но не ограничиваются сайт-направленным мутагенезом и способами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Последовательности ДНК, являющиеся предметами настоящего изобретения, могут быть сконструированы из геномных либо кДНК последовательностей, кодирующих ферменты ГТФ-циклогидролазы II, известных в данной области техники, которые являются доступными, например, в Genbank (Ihtelligenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) и Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA) или с использованием информации о последовательностях, раскрытой на фиг. 1 или в табл. 4, с применением методов in vitro мутагенеза (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). Другая возможность изменения данной последовательности ДНК посредством введения мутаций, которая также является предпочтительной при осуществлении настоящего изобретения, представляет собой мутагенез с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). ДНК в качестве начального материала может быть выделена с применением методов, известных в данной области техники и описанных, например, в Sambrook et al. (Molecular Cloning) из соответствующих штаммов/организмов. Тем не менее, является понятным, что ДНК, кодирующая ГТФ-циклогидролазу II, которую предполагается сконструировать/мутировать в соответствии с настоящим изобретением, может быть также получена на основе известной последовательности ДНК, например, посредством конструирования синтетического гена с применением методов, известных в данной области техники (как это описано, например, в ЕР 747483).

Полинуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, может представлять собой изолированный полинуклеотид, то есть полинуклеотид, в значительной степени очищенный от других последовательностей нуклеиновых кислот, таких как другие хромосомные и экстрахромосомные ДНК и РНК, но не ограничиваясь последними. Традиционные методы очистки нуклеиновых кислот, известные специалистам в данной области техники, могут применяться для получения изолированных полинуклеотидов. Это также относится к рекомбинантным полинуклеотидам и химически синтезированным полинуклеотидам.

В еще одном воплощении изобретение касается функционального полинуклеотида, в котором промотор, рибосома-связывающий сайт, если необходимо, как в случае бактериальных клеток, и терминатор функционально связаны с полинуклеотидом, соответствующим настоящему изобретению. В еще одном следующем воплощении изобретение относится к вектору либо плазмиде, содержащим в своем составе такой полинуклеотид. Вектор или плазмида предпочтительно включают в себя по меньшей мере один маркерный ген. Определение "функционально связанные", как это используется в рамках настоящего изобретения, соответствует объединению последовательностей нуклеиновой кислоты в одном фрагменте нуклеиновой кислоты таким образом, что функция одной из них изменяется под воздействием другой.

Так, например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью тогда, -7когда он способен влиять на экспрессию этой кодирующей последовательности, то есть, когда кодирующая последовательность находится под транскрипционным контролем данного промотора. Кодирующие последовательности могут быть функционально связанны с регуляторными последовательностями в смысловой либо антисмысловой ориентации. Определение "экспрессия" означает транскрипцию последовательности ДНК в иРНК и/или трансляцию иРНК в аминокислотную последовательность. Определение "суперэкспрессия" обозначает производство продукта гена в модифицированном организме (например, модифицированного посредством трансформации либо трансфекции), которое превышает уровни производства в соответствующем немодифицированном организме вследствие прекращения регулирования экспрессии гена и/или вследствие увеличения числа копий самого гена в данном организме.

Как только получены полные последовательности ДНК, являющиеся предметом настоящего изобретения, они могут быть интегрированы в векторы, либо напрямую внедрены в геном организмахозяина, с применением методов, известных в данной области техники и описанных, например, в Sambrook et al. (см. выше) для осуществления (супер-) экспрессии закодированного полипептида в подходящих системах клеток-хозяев. Однако специалист в данной области техники знает, что последовательности ДНК, сами по себе, также могут быть использованы для трансформации подходящих систем клетокхозяев, являющихся предметом настоящего изобретения, для достижения (супер-) экспрессии закодированного полипептида.

Подходящими клетками-хозяевами могут являться эукариотические либо прокариотические клетки.

Примеры подходящих клеток-хозяев включают в себя, но не ограничиваются бактериальными клетками, такими как клетки цианобактерий, стрептококков, стафилококков, энтерококков, например бацилл, таких как, например, Bacillus subtilis, или Streptomyces, таких как, например, Streptomyces lividans или Streptococcus pneumoniae, E. Coli, таких как, например, Е. coli K12 штаммы, например M15 или KB 101. Клеткихозяева могут представлять собой клетки грибов, включая клетки дрожжей, таких как грибов из рода Aspergillus, например Aspergillus niger или Aspergillus oryzae, Trichodenna, например Trichodenna reesei, Ashbya, например Ashbya gossypii, Eremothecium, например Eremoihecium ashbyii, Saccharomyces, например Saccharomyces cerevisiae, Candida, например Candida flareri, Pichia, например Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, например H. polymorpha (DSM 5215) и Kluyveromyces. Подходящие клетки-хозяева могут быть также выбраны из клеток животных, включая клетки млекопитающих, такие как, например, клетки СНО, COS, HeLa, 3Т3, ВНК, 293, CV-1, также из клеток насекомых, таких как Drosophila S2 и Spodoptera Sf9 клетки; а также из клеток растений, таких как клетки голосемянных или покрытосемянных.

Векторы, которые могут быть использованы для экспрессии в клетках грибов, известны в данной области техники и описаны, например, в ЕР 420358 или Cullen et al. (Bio/Technology 5, 369-376, 1987), Ward (в Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 1991), Upshall et al. (Bio/Technology 5,1301-1304, 1987), Gwynne et al. (Bio/Technology 5, 71-79, 1987) или Punt et al. (J. Biotechnol. 17, 19-34,1991), и для дрожжей Sreekrishna et al. (J. Basic Microbiol. 28, 265-278, 1988; Biochemistry 28, 4117-4125, 1989), Hitzemann et al. (Nature 293, 717-722, 1981) или в ЕР 183070, ЕР 183071, ЕР 248227 или ЕР 263311. Подходящие векторы, которые могут быть использованы для экспрессии в Е. coli, известны в данной области техники, как это описано Sambrook et al. (см. выше).

Векторы, которые могут быть использованы для экспрессии в Bacilli, известны в данной области техники и описаны, например, в ЕР 207459 или ЕР 405370, Yansura и Henner в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 439или Henner, Le Grice и Nagarajan в Meth. Enzymol. 185, 199-228, 1990. Векторы, которые могут быть использованы для экспрессии в Н. polymorpha, известны в данной области техники, как это описано, например, в Gellissen et al, Biotechnology 9, 291-295,1991.

Либо такие векторы уже имеют в своем составе регуляторные элементы, например промоторы, либо полинуклеотиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть сконструированы таким образом, что будут содержать в себе такие элементы. Подходящие промоторные элементы, которые могут быть использованы, известны в данной области техники и представляют собой, например, для Trichoderma reesei cbh1- или pki1-промотор, для Aspergillus oryzae amy-промотор, и для Aspergillus niger glaA-, alcA-, aphA-, tpiA-, gpdA- и pkiA-промотор. Подходящие промоторные элементы, которые могут быть использованы для экспрессии в дрожжах, известны в данной области техники и представляют собой, например, pho5- или gap-промотор для экспрессия в Saccharomyces cerevisiae, и, например, aoxlпромотор для Pichia pastoris или FMD- или МОХ промотор для Н. polymorpha.

Подходящие промоторы и векторы для бактериальной экспрессии включают, например, синтетический промотор, описанный Giacomini et al. (Gene 144, 17-24, 1994), vegI промотор из Bacillus subtilis или сильный промотор бактериофага Т5. Подходящие техники для экспрессии заявленных (мутантных) ферментов ГТФ-циклогидролаз II в бактериях как с использованием подходящих плазмид, так и посредством встраивания ГТФ-циклогидролаза II-кодирующей последовательности ДНК в хромосомную ДНК, могут быть найдены во многих источниках, например в US Patent № 6322995.

Соответственно векторы, содержащие в себе полинуклеотид, являющийся предметом настоящего изобретения, предпочтительные для экспрессии данного полинуклеотида в бактериях, грибах, животных или растениях-хозяевах, и сами такие трансформированные бактерии или грибы, животные или растения-хозяева, также являются объектами настоящего изобретения.

Изобретение также касается способа получения рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД и одного либо более его производных, включающий в себя:

(a) культивирование клетки-хозяина, являющейся предметом настоящего изобретения, в подходящей культуральной среде в условиях, позволяющих экспрессию модифицированной ГТФциклогидролазы II в указанной клетке-хозяине; и (b) при необходимости выделение продукта (рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД либо одного или более его производного) из культуральной среды.

Такой метод может быть использован для биотехнологического получения одного либо более из следующих продуктов: рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД либо одного или более их производного. Такие производные могут включать в себя флавопротеины.

Способы генной и метаболической инженерии подходящих клеток-хозяев в соответствии с настоящим изобретением известны специалистам в данной области техники. Также (потенциально) подходящие способы очистки рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД либо одного или более их производного хорошо известны в данной области биосинтеза и производства чистых химических веществ.

Представляется ясным, что способы биотехнологического получения рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД, либо одного или более их производного, в соответствии с настоящим изобретением, не ограничиваются процессами клеточной ферментации, как это описано выше, но также могут использоваться, например, клетки-хозяева с нарушенной проницаемостью мембраны, суммарные клеточные экстракты, клеточные экстракты, полученные при очистке остатков клеток, посредством, например, центрифугирования или фильтрации, или даже воспроизведенные реакционные пути с использованием изолированных ферментов. В рамки настоящего изобретения входят также комбинации таких процессов. В случае бесклеточного биосинтеза (такого как при воспроизведении реакционных путей), не имеет значения, были ли изолированные ферменты синтезированы клеткой-хозяином и изолированы из последней, или они были получены с применением in vitro транскрипции/трансляции, либо были получены любыми другими способами.

Настоящее изобретение также касается способа получения модифицированной ГТФциклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения, включающего в себя:

(a) культивирование клетки-хозяина, являющейся предметом настоящего изобретения, в условиях, позволяющих экспрессию модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения, в указанной клетке-хозяине; и (b) извлечение модифицированной ГТФ-циклогидролазы II из клеток либо из культуральной среды.

Модифицированные ферменты ГТФ-циклогидролазы II, являющиеся предметом настоящего изобретения, могут быть получены из генетически измененных клеток-хозяев, имеющих подходящие системы экспрессии.

Для рекомбинантного получения полипептидов настоящего изобретения клетки-хозяева могут быть генетически изменены таким образом, что будут содержать полинуклеотиды, или векторы, или плазмиды, являющиеся предметами настоящего изобретения. Введение полинуклеотида или вектора в клеткухозяина может быть достигнуто с применением стандартных методов, известных в данной области техники, таких как трансфекция с использованием фосфата кальция, DEAE-декстран опосредованная трансфекция, микроинъекция, трансфекция, опосредованная положительно заряженными липидами (cationic lipid-mediated transfection), электропорация, трансдукция, трансформация методом бомбардировки клеток (ballistic introduction) и инфицирование.

Большое количество систем экспрессии может быть использовано для получения модифицированных ферментов ГТФ-циклогидролаз II, являющихся предметом настоящего изобретения. Такие векторы включают, помимо других, те, которые были описаны выше. В этом смысле, в общем, любая система или вектор, подходящие для поддержания, распространения либо экспрессии полинуклеотидов и/или экспрессии полипептида в клетке-хозяине, может быть использована для экспрессии.

В рекомбинантных системах экспрессии эукариот для секреции транслированного белка в люменальное пространство эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточную среду, в экспрессируемый полипептид могут быть введены подходящие секреторные сигналы. Сигналы могут являться как эндогенными, так и гетерологичными для полипептида.

Полипептиды, являющиеся предметами настоящего изобретения, могут быть выделены из рекомбинантных культур клеток и очищены с применением хорошо известных методов, включающих преципитацию в присутствии сульфатом аммония либо этилового спирта, кислотную экстракцию, анион- или катионобменную хроматографию, хроматографию на фосфоцеллюлозе, хроматографию на основе гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите, а также высокоэффективную жидкостную хроматографию. Хорошо известные техники для рефолдинга белков могут применяться для восстановления активной конформации полипептида в том случае, если полипептид денатурировал в процессе выделения и/или очистки.

Ферменты ГТФ-циклогидролазы II, являющиеся предметами настоящего изобретения, могут быть Bio/Technology 11, 811-814, 1994 или в ЕР 449375, предпочтительно в семенах, как это описано, например, в ЕР 449376. Некоторые подходящие примеры промоторов и терминаторов включают в себя промоторы и терминаторы из генов нопалинсинтазы (nos), октопинсинтазы (ocs) и вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Одним типом эффективного растительного промотора, который может использоваться, является сильный растительный промотор высокого уровня (high-level plant promoter). Такие промоторы, будучи функционально связаны с генетической последовательностью, являющейся предметом настоящего изобретения, должны быть способны стимулировать экспрессию продукта гена, являющегося предметом настоящего изобретения. Сильные растительные промоторы, которые могут быть использованы в данном изобретении, включают промотор малой субъединицы (ss) рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы, например, из сои, а также промотор хлорофилл-а/b-связывающего белка.

Если желательно коммерческое производство данных белков, то в таком случае может быть применено множество способов культивирования. Например, масштабное производство специфического генного продукта, суперэкспрессированного в рекомбинантном микробе-хозяине, может быть достигнуто с применением методик как периодического, так и непрерывного культивирования. Периодическая и периодическая с подпитываемой культурой методологии культивирования являются общепринятыми и хорошо известными в данной области техники, и их примеры были описаны Thomas D. Brock в Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass. или Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227-234, 1992. Методы регулирования доставки питательных веществ и факторов роста для процессов непрерывного культивирования, равно как и способы максимизации уровня образования продукта, хорошо известны в области промышленной микробиологии, кроме того, большое число методов подробно описано Brock, см. выше.

Ферментационная среда может также содержать в себе подходящие углеродные субстраты. Подходящие субстраты могут включать, но не ограничиваются моносахаридами, такими как глюкоза и фруктоза, олигосахаридами, такими как лактоза или сахароза, полисахаридами, такими как крахмал или целлюлоза, либо их смесями и неочищенными смесями из возобновляемых источников. Предполагается, что источники углерода, используемые в настоящем изобретении, смогут включать в себя разнообразные углеродсодержащие субстраты и будут ограничиваться только выбором организма.

Настоящее изобретение также касается способа получения ГТФ-циклогидролазы II, имеющей повышенную удельную активность, включающего в себя следующие стадии:

(a) предоставление полинуклеотида, кодирующего первую ГТФ-циклогидролазу II, удельная активность которой, желательно, должна быть повышена;

(b) введение одной либо более мутации(й) в полинуклеотидную последовательность таким образом, чтобы мутированная полинуклеотидная последовательность кодировала модифицированную ГТФциклогидролазу II, имеющую одну либо более мутацию(й) по сравнению с первой ГТФ-циклогидролазой II, где одна либо более мутация(й) включает 1, 2, 3, 4, 5, или 6 мутаций(и) в аминокислотной позиции(ях), соответствующей позиции 261, 270, 276, 279, 308 и/или 347 в SEQ ID NO:2;

(c) при необходимости встраивание мутированного полинуклеотида в вектор или плазмиду;

(d) введение полинуклеотида, или вектора, или плазмиды в подходящую клетку-хозяин и (e) культивирование клетки-хозяин в условиях, которые позволяют экспрессию модифицированной ГТФ-циклогидролазы II.

Настоящее изобретение включает в себя также обеспечение способа получения ГТФциклогидролазы II, имеющей повышенную удельную активность, включающего в себя следующие стадии:

(a) предоставление полинуклеотида, кодирующего первую ГТФ-циклогидролазу II, удельная активность которой, желательно, должна быть повышена;

(b) предоставление позиций, которые оказывают влияние на удельную активность;

(c) определение оптимальной аминокислоты для замещения данной аминокислоты в ГТФциклогидролазе II дикого типа, как это определено в (b) и введения одной либо более мутации в полинуклеотидную последовательность (а) в позиции, определенные в (b) таким образом, чтобы мутированная полинуклеотидная последовательность кодировала новую ГТФ-циклогидролазу II;

(d) при необходимости встраивание мутированного полинуклеотида в вектор или плазмиду;

(d) введение полинуклеотида, или вектора, или плазмиды в подходящую клетку-хозяин; и (e) культивирование клетки-хозяин в условиях, которые позволяют экспрессию модифицированной ГТФ-циклогидролазы II.

В одном воплощении стадия (с) в описанном выше способе, реализуется с применением метода насыщающего мутагенеза. Тем не менее, представляется ясным, что это не единственный возможный путь определения аминокислоты, которая должна заместить аминокислоту в заданной позиции ГТФциклогидролазы II дикого типа с целью получения модифицированной ГТФ-циклогидролазы II с повышенной удельной активностью.

Получение модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, имеющей повышенную удельную активность, из немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II, как это описано выше, например, посредством ГТФ-циклогидролаз II из немодифицированных белков согласно фиг. 1 или табл. 4, в частности тех, которые соответствуют SEQ ID NO:2, 33, 35, 37, 39, 41 и 43, таких как, например, немодифицированные белки ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis или Ashbya gossypii. Праймеры, использованные для полимеразной цепной реакции (ПЦР), являются такими, что один праймер, например смысловой праймер, может содержать в себе мутированную нуклеотидную последовательность и другой праймер, например антисмысловой праймер, может содержать в себе нуклеотидную последовательность дикого типа. ПЦР с такими парами праймеров и геномной ДНК ribA дикого типа может привести к получению ПЦР продукта, несущего частичную мутацию в определенной позиции, зависящей от мутированной нуклеотидной последовательности используемого праймера. После очистки полученных в результате ПЦР продуктов с применением стандартных методик, таких как, например, QIAquick PCR purification kit (Qiagen), ДНК может быть расщеплена рестрикционными ферментами, такими как BamHI и ЕсоRI, залигирована в подходящий вектор, например, pQE60, и трансформирована в штамм, который является негативным по ГТФ-циклогидролазе II. Примером такого штамма является штамм Rib7 E. coli (Richter et al., J. Bacteriol.

175, 4045-4051, 1993), несущий плазмиду pREP4. После подтверждения правильности последовательности посредством секвенирования ДНК, мутированный RibA может быть очищен и охарактеризован, как это описано выше. Если для создания ГТФ-циклогидролазы II, имеющей повышенную удельную активность, используется Ashbya gossypii, насыщающий мутагенез должен быть применен в аминокислотных остатках/позициях Т126, G135, А141, L144, N182 и 1221, соответствующих остаткам V261, G270, А276, Q279, K308 и М347 ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis согласно SEQ ID NO:2, для которых было показано влияние на удельную активность фермента (см. табл. 4).

Предпочтительные воплощения данного способа соответствуют предпочтительным воплощениям модифицированной ГТФ-циклогидролазы II, кодирующих их полинуклеотидов, векторов и плазмид, клеток-хозяев, а также описанных здесь способов. Первая и вторая ГТФ-циклогидролазы II соответствуют немодифицированной и модифицированной ГТФ-циклогидролазе II соответственно (см. выше).

Целью настоящего изобретения является предоставить полинуклеотид, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированную ГТФ-циклогидролазу II, как это описано выше, вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, включающий такой полинуклеотид, клетку хозяина, которая была трансформирована таким полинуклеотидом или вектором, способ получения ГТФ-циклогидролазы II, являющейся предметом настоящего изобретения, в котором клетка-хозяин, как это было описано выше, культивируется в подходящих для культивирования условиях, и ГТФциклогидролаза II выделяется из такой клетки-хозяин или культуральной среды с применением известных в данной области техники способов, а также способ биотехнологического производства рибофлавина, предшественника рибофлавина, ФМН, ФАД, или одного либо более их производного, на основе клетки-хозяина, которая была трансформирована таким полинуклеотидом или вектором, и/или которая может нести такой полинуклеотид, устойчиво интегрированный в ее хромосому(ы).

Целью настоящего изобретения также является предоставить (i) последовательность ДНК, которая кодирует ГТФ-циклогидролазу II, несущую по меньшей мере одну специфическую мутацию, которая является предметом настоящего изобретения и которая гибридизуется в стандартных условиях с любой последовательностью ДНК специфически модифицированных ферментов ГТФ-циклогидролаз II, являющихся предметами настоящего изобретения, либо (ii) последовательность ДНК, которая кодирует ГТФ-циклогидролазу II, несущую по меньшей мере одну специфическую мутацию, являющуюся предметом настоящего изобретения, но по причине вырожденности генетического кода не гибридизуется, но которая кодирует полипептид с точно такой же аминокислотной последовательностью, как и последовательность ДНК, которая гибридизуется в стандартных условиях с любой последовательностью ДНК специфически модифицированных ферментов ГТФ-циклогидролаз II, являющихся предметами настоящего изобретения, либо (iii) последовательность ДНК, которая представляет собой фрагмент таких последовательностей ДНК, который сохраняет свойства активности полипептида, фрагментом которого он является.

Термин "стандартные условия" в случае гибридизации обозначает в контексте настоящего изобретения условия, которые используются специалистами в данной области техники, главным образом, для обнаружения специфических гибридизационных сигналов, и которые описаны, например, Sambrook et al., "Molecular Cloning", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York, или предпочтительно так называемую жесткую гибридизацию и нежесткие условия отмывки, или более предпочтительно так называемую жесткую гибридизацию и жесткие условия отмывки, которые являются обычными для специалиста в данной области техники и которые описаны, например, в Sambrook et al. (см. выше). Специфическим примером жестких условий гибридизации является инкубация в течение ночи (например, 15 ч) при температуре 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5SSC (150 мМ NaCl, мМ тринатрий цитрата), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5 раствор ДЭН Хардта, 10% декстран сульфат, и 20 мкг/мл денатурированной, фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующим отмыванием гибридизационного материала в 0,1SSC при температуре приблизительно 65°С.

- 11 Еще одной целью настоящего изобретения является предоставить последовательность ДНК, которая может быть получена с применением способа так называемой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием ПЦР праймеров, сконструированных на основе специфически описанных последовательностей ДНК, являющихся предметами настоящего изобретения. Представляется ясным, что полученные таким образом последовательности ДНК, кодирующие ферменты ГТФ-циклогидролазы II, несут, по меньшей мере, такую же мутацию, как и те, из которых они получены, и демонстрируют сравнимые свойства по активности.

Многие описанные здесь воплощения настоящего изобретения могут комбинироваться в разных сочетаниях.

Фиг. 1. Множественное выравнивание последовательностей, рассчитанное с использованием программы PILEUP из пакета программ GCG 92, ГТФ-циклогидролазы II, обнаруженных с применением программы BLASTN с использованием стандартных баз данных, таких как SWISS-PROT и TrEMBL (Candida guilliermondii, Ashbya gossypii, Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Archaeoglobus fulgidus, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Helicobacter pylori, Pyrococcus furiosus, Thermotoga maritima, Chlamydia muridarum, Chlamydia trachomatis, Chlamydia caviae GPIC, Arabidopsis thaliana, Lycopersicum esculentum, Oryza sativa, Alcaligenes eutrophus, Neisseria meningitidis (серологическая группа A), Neisseria meningitidis (серологическая группа В, два фермента ГТФциклогидролазы II), Pseudomonas putida (два фермента ГТФ-циклогидролазы II), Pseudomonas syringae (два фермента ГТФ-циклогидролазы II), Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans), Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Escherichia coli O6, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Buchnera aphidicola (подвид Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum бактерия-симбионт), Buchnera aphidicola (подвид Schizaphis graminum), Wigglesworthia glossinidia brevipalpis, Buchnera aphidicola (подвид Baizongia pistaciae), Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes), Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Lactococcus lactis (Streptococcus lactis), Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae, Clostridium acetobutylicum, Fusobacterium nucleatum, Anabaena spec, Synechocystis spec, Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus), Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus halodurans, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Chlorobium tepidum, Aquifex aeolicus, Leptospira interrogans, Deinococcus radiodurans, Bacteroides thetaiotaomicron, Caulobacter crescentus, Coxiella burnetii, Rhizobium etli, Lactobacillus plantarum, Pseudomonas glumae, Streptomyces avermitilis, Photobacterium phosphoreum, Azospirillum brasilense, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti), Brucella melitensis, Brucella suis, Rhizobium loti (Mesorhizobium loti), Nitrosomonas europaea, Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum), Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Vibrio fischeri, Shewanella oneidensis, Photobacterium phosphoreum, Photobacterium leiognathi, Pseudomonas aeruginosa, Dehalospirillum multivorans, Xylella fastidiosa). Нумерация соответствует проведенному выравниванию. Некоторые из аминокислотных последовательностей кодируют фермент, который обладает только ГТФ-циклогидролазной II активностью, это такие ферменты, как ферменты из Ashbya gossypii, Streptomyces coelicolor, Helicobacter pylori J99, Heliobacter pylori, Arabidopsis thaliana, Alcaligenes eutrophus, Neisseria meningitidis (серологическая группа A), Neisseria meningitidis (серологическая группа В), Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans), Haemophilus influenzae, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Escherichia coli O6, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, Buchnera aphidicola (подвид Acyrthosiphon pisum) (Acyrthosiphon pisum бактерия-симбионт), Buchnera aphidicola (подвид Schizaphis graminum), Wigglesworthia glossinidia brevipalpis, Buchnera aphidicola (подвид Baizongia pistaciae), Pseudomonas glumae, Streptomyces avermitilis, или Photobacterium phosphoreum. Другие ферменты, как фермент RibA из В. subtilis содержит в себе, дополнительно, домен, обладающий DHBP-синтазной активностью. Аминокислотная последовательность RibA из В. subtilis подчеркнута. Позиции, которые являются гомологичными/эквивалентными аминокислотным остаткам, для которых обнаружено, что они оказывают положительное влияние на удельную активность (аминокислотные остатки 261, 270, 276, 279, 308, 347) и на чувствительность к протеазам (196) в RibA из В. subtilis и те, которые обсуждаются в одном из нижеследующих примеров, обозначены выделенными жирным буквами. Нумерация, использованная для таких позиций, сделана в соответствии с аминокислотной последовательностью В. subtilis дикого типа.

Фигура начинается с названия использованной последовательности, инвентарного номера в базе данных, и в скобках приводится организм - источник данной последовательности.

Нижеследующие не ограничивающие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1. Измерение ГТФ-циклогидролазной II активности и определение удельной активности.

Анализ ферментативной активности, использовавшийся для измерения ГТФ-циклогидролазной II активности, был адаптирован из Ritz et al. (J. Biol. Chem. 276, 22273-22211, 2001). Конечный буфер, использованный при анализе, содержал 50 мМ Tris/HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 7,5 мМ меркаптоэтанола, 2, мМ ГТФ и 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После очистки (см. пример 5) фермент хранился в буфере, содержащем 50 мМ Tris/HCl, рН 8,5, 10 мМ MgCl2, 7,5 мМ меркаптоэтанола, и 10% глицерина.

Субстрат добавлялся к ферменту и поглощение при 310 нМ, где ГТФ поглощением не обладает, регистрировалось в течение 20-30 мин. Конечная реакционная смесь содержала от 0,02 до 0,04 мг/мл ГТФциклогидролазы II из В. subtili, либо одного из мутантов, как это показано в табл. 1 или 2. Для вычисления активности был использован коэффициент поглощения для DRAPP, равный 6,28 [мМ-1 см-1]. Определение количества белка было осуществлено с использованием способа определения белка фирмы BioRad (Cat. No. 500-0002, Bio-Rad Laboratories AG, Nenzlingerweg 2, CH-4153 Reinach, Switzerland).

В соответствии с определением "удельная активность", данным выше, одна единица соответствует количеству RibA, которое катализирует образование 1 мкмоль DRAPP в минуту в описанных выше условиях. Удельная активность соответствует количеству DRAPP, которое было образовано 1 мг RibA в минуту в описанных выше условиях. С учетом вышеупомянутых определений, специфическая ГТФциклогидролазная II активность RibA белка В. subtilis, несущего His6-метку, составила 0,115 Eg/мг.

Пример 2. Проверка качества анализа ферментативной активности.

Оптимальный анализ должен удовлетворять многим требованиям, таким как линейность по концентрации фермента и линейность по времени. Используя условия, описанные в примере 1, и 22 мкг фермента, увеличение поглощения при 310 нм наблюдалось на протяжении 25 мин. Для проверки того, в каком диапазоне анализ удовлетворяет условию линейности по концентрации фермента, была исследована зависимость результатов анализа от повышения концентрации фермента (0-40 мкг His6-метка RibA).

Было показано, что анализ удовлетворяет требованию линейности на протяжении 25 мин и в диапазоне от 0 до 40 мкг несущего His6-метку RibA из В. subtilis.

После этого была проверена зависимость ГТФ-циклогидролазной II активности несущего His6метку RibA из В. subtilis от концентрации ГТФ. Использовались условия, описанные в примере 1. Хотя концентрация ГТФ изменялась от 0,05 до 2,5 мМ финальной концентрации. Результаты показали значение Km для ГТФ, равное 0,07 мМ, и удельную активность, равную приблизительно 115 MEg/мг белка при 37°С для ГТФ-циклогидролазной II активности несущего His6-метку RibA фермента из В. subtilis. Эксперименты, приведенные в данном примере, показали, что анализ ГТФ-циклогидролазной II активности, фактически является линейным по времени и концентрации фермента (ГТФ-циклогидролазы II), и что при данных условиях для ГТФ-циклогидролазы II Bacillus subtilis концентрация ГТФ, составляющая 2, мМ, может являться оптимальной для осуществления точных измерений удельной активности фермента.

Пример 3. Выделение геномной ДНК из Bacillus subtilis.

В. subtilis были выращены в течение ночи при температуре 30°С в среде Veal Infusion Broth (Becton Dickinson, Sparks, MD 21152, USA). 1,5 мл культуры было перенесено в 1,5 мл пробирку и отцентрифугировано. Осадок клеток был перерастворен в 0,5 мл суспензионного буфера (50 мМ Tris/HCl, pH 7,5, мМ Na2-ЭДТА, 15% сахарозы и 1 мг/мл свежедобавленного лизоцима). После 10 мин инкубации при комнатной температуре к суспензии был добавлен 1 мкл диэтилоксидиформиата. Затем добавлялось мкл 10% раствора ДДС-Na, после чего пробирку несколько раз переворачивали. Пробирку инкубировали в течение 5 мин при 70°С для высвобождения бактериальной ДНК. Затем добавляли 50 мкл 5 М ацетата калия, пробирку охлаждали во льду и оставляли там на 45 мин. После этого образец центрифугировали в течение 30 мин при 4°С. Супернатант переносили в новую 1,5-мл пробирку, которая заполнялась (до достижения 1,5 мл) этиловым спиртом при комнатной температуре. После 5 мин центрифугирования супернатант удаляли и высушивали осадок ДНК. Затем ДНК промывали 70% и 96% этиловым спиртом и растворяли в 10 мМ Tris/HCl, pH 7,5, 1 мМ EDTA, и 10 мкг/мл РНКазы А.

Пример 4. Конструирование экспрессионных плазмид для экспрессии ribA, кодирующего ГТФциклогидролазу II и DHBP синтазу, из В. subtilis и их мутантов.

Клонирование гена ribA (SEQ ID NO:1) В. subtilis, который кодирует ГТФ-циклогидролазу II и DHBP синтазу, было осуществлено с применением ПЦР. Геномная ДНК В. subtilis была выделена в соответствии с примером 3. 100 нг этой ДНК либо матрицы, кодирующей мутантную форму гена ribA, было использовано для ПЦР с праймерами RibA IS (SEQ ID NO:27) и RibA IAS (SEQ ID NO:28). Использовались следующие условия ПЦР: 2 мкМ каждого из праймеров, 0,2 мМ каждого нуклеотида, 2,5 Eg ДНК полимеразы с редактирующей активностью (Stratagene, Gebouw California, 1101 СВ Amsterdam Zuidoost, The Netherlands) и 100 нг геномной ДНК в подходящем буфере, который поставляется вместе с ДНК полимеразой.

Температурные режимы были следующими:

Шаги со 2 по 4 были повторены 30 раз.

Продукт ПЦР длиной 1,3 т.п.н. использовался как матрица для ПЦР 2, в которой праймер RibA 1S был заменен на праймер RibA 2S (SEQ ID NO:29). Продукт данной ПЦР (SEQ ID NO:3), кодирующий агарозном геле, выделен из геля, расщеплен с использованием EcoRI и BamHI и лигирован в расщепленный EcoRI и BamHI вектор pQE60 (Qiagen AG, Hilden, Germany). Плазмида была названа pQE60ribANhis.

Пример 5. Характеризация ферментов дикого типа и мутантных ферментов.

Создание мутантных ферментов было осуществлено с применением описанных выше способов и способов, известных специалистам. Мутанты RibА из В. subtilis, которые исследовались в дальнейшем, приведены в табл. 1. Все мутантные гены были клонированы в pQE60 вектор, как это описано в примере 4. Все конечные конструкции содержали в себе His6-метку на N-конце.

Мутанты RibА, что характеризуется аминокислотными заменами в сравнении с белком RibA В. subtilis дикого типа (цифры характеризуют соответствующие аминокислотные позиции в SEQ ID NO:2) Мутантные ферменты RibA были экспрессированны с использованием плазмид из примера 4 и очищены, как это описано в "The QiaExpressionist", Qiagen, Hilden, Germany, March 2001, edition 5. Ферментативные свойства очищенных ферментов (мутантов RibA) были проанализированы, как это описано в примерах 1 и 2, табл. 2 сравнивает специфические ГТФ-циклогидролазные II активности мутантов RibA (см. табл. 1) с таковой ГТФ-циклогидролазы II RibA В. subtilis дикого типа. Активность была измерена с использованием версии белка RibA с His6-меткой на N-конце, как это описано в примере 4. Цифры характеризуют соответствующие аминокислотные позиции в SEQ ID NO:2.

Сравнение удельной ГТФ-циклогидролазной II активности мутантных RibA белков и RibA белков Аминокислотные замены, указанные в скобках, по всей вероятности не оказывают влияния на ГТФциклогидролазную II активность мутантов. Аминокислотная замена Y196C уменьшает чувствительность RibA к протеазам.

Пример 6. Конструирование рекомбинантных штаммов В. subtilis, суперэкспрессирующих мутантные RibA, которые демонстрируют повышенную удельную ГТФ-циклогидролазную II активность.

В нижеследующем примере мутантные полинуклеотидные последовательности ribA соответствующие RibA Y196C, A276T, A282T (ПЦР III), RibA Y196C, A276T, Q279R, A282T, K308R, M347I (конструкция С), и RibA Y196C, A276T, Q279R, A282T, K308R, F325Y, M347I (конструкция Е) были первоначально встроены в вектор, содержащий сильный конститутивный промотор PvegI, а затем введены в Е.

coli. Трансформация природных компетентных клеток В. subtilis полинуклеотидной последовательностью и фланкирующими векторными последовательностями привела к получению штамма В. subtilis, сеперэкспрессирующего мутантный ribA. Стандартные методики получения рекомбинантной ДНК были использованы для конструирования полинуклеотидной последовательности и штаммов В. subtilis. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) и Harwood and Cutting, Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley и Sons (1990).

Для амплификации мутантного ribA фрагмент ДНК размером 1,2 т.п.н., содержащий в себе полноразмерную кодирующую последовательность ribA, был амплифицирован с применением ПЦР, с использованием ДНК плазмиды, содержащей мутантный ПЦР III, конструкцию С или конструкцию Е, и RibANde+1 (SEQ ID NO:30) и RibA4AS (SEQ ID NO:31) в качестве праймеров.

Реакционные условия для ПЦР состояли из 30 циклов денатурации при 95°С в течение 1 мин, отжига при 52°С в течение 1 мин и удлинения при 72°С в течение 2 мин. Для минимизации ПЦРобусловленных ошибок использовалась Pfu Turbo ДНК полимераза (Stratagene, Gebouw California, СВ Amsterdam Zuidoost, The Netherlands). Продукты ПЦР были очищены с использованием QIAquick PCR purification kit (Qiagen) и расщеплены с применением NdeI и BamHI. Расщепленные продукты ПЦР были клонированы в вектор pXI16 (Huembelin et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 1-7, 1999), который содержит подходящие сайты рестрикции для клонирования полинуклеотидных последовательностей непосредственно ниже сильного конститутивного PvegI промотора из В. subtilis. Вектор pXI16 также содержит в себе терминатор транскрипции cryT из В. thuringiensis, фланкирующие последовательности sacB для гомологичной рекомбинации в геном В. subtilis посредством двойного перекрестного механизма и маркер устойчивости к эритромицину. То, что каждая плазмида содержала в себе мутантный ribA, было подтверждено секвенированием ДНК.

Каждая плазмида была расщеплена ApaI с целью удаления спейсерного участка от PvegI промотора, повторно лигирована и повторно расщеплена FspI, и трансформирована в природные компетентные клетки В. subtilis 1012. Трансформанты были отобраны на чашках с ТВАВ (Tryptose Blood Agar Base, Becton Dickinson, Sparks, MD 21152, USA), содержащих эритромицин в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Секвенирование ДНК подтвердило, что мутантные полинуклеотидные последовательности ribA в данных штаммах были корректными. Суперпродукция рибофлавина была проверена в соответствии с примером 7.

Мутантные полинуклеотидные последовательности ribA, управляемые PvegI промотором были введены в суперпродуцирующий рибофлавин штамм В. subtilis RB50::(pRF69)n::(pRF93)m, который был описан в Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22:8-18 (1999), посредством генерализованной трансдукции. Стандартные техники с использованием бактериофага PBS1 были применены в соответствии с Harwood and Cutting, Molecular Biology Methods for Bacillus, John Wiley и Sons (1990). Трансдуктанты были отобраны на чашках с ТВАВ, содержащих эритромицин в конечной концентрации 2 мкг/мл. Трансформанты были проверены посредством ПЦР анализа и секвенирования ДНК для подтверждения правильности вставки мутантной полинуклеотидной последовательности ribA.

Пример 7. Увеличенная продукция рибофлавина с использованием ГТФ-циклогидролазы II с повышенной удельной активностью.

Для проверки in vivo эффекта мутаций, изменяющих удельную активность ГТФ-циклогидролазы II, мутанты ПЦР III, конструкция С или конструкция Е ГТФ-циклогидролазы II (RibA) Bacillus subtilis были введены в суперпродуцирующие рибофлавин штаммы В. subtilis, такие как штамм RB50::(pRF69)n::(pRF93)m (Perkins et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 8-18, 1999), например, в локус sacB. Продукция рибофлавина сравнивалась непосредственно в двух рекомбинантных штаммах В. subtilis, которые различались только присутствием или отсутствием мутаций в гене ribA. Культивирование штаммов Bacillus осуществлялось как описано в примере 8.

Пример 8. Условия культивирования для оценки продукции рибофлавина.

Продукция рибофлавина была оценена при выращивании в подпитываемой культуре рибофлавинсуперпродуцирующего штамма B. subtilis RB50::(pRF69)n::(pRF93)m, в локус sacB которого были интегрированы мутанты по ГТФ-циклогидролазе II - ПЦР III, конструкция С, либо конструкция Е, управляемые промотором PvegI (см. пример 6). Ферментация данных штаммов осуществлялась как описано в ЕР 405370.

Пример 9. Аналитические способы определения рибофлавина.

Для определения рибофлавина может быть использован следующий аналитический способ (Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999).

В качестве хроматографической системы использовалась система Hewlett-Packard 1100 System, оборудованная двойным насосом, термостатируемой колонкой и охлаждаемой автоматической пипеткой.

Совместно использовались как двулучевой детектор, так и детектор флуоресценции. Производилась запись двух сигналов, UV при 280 нм и флуоресцентного свечения при возбуждении при 446 нм и эмиссии при 520 нм.

Использовалась колонка из нержавеющей стали Supelcosil LC-8-DB (1504,6 мм, размер частиц мкм) вместе с защитным картриджем. В качестве подвижной фазы применялись 100 мМ уксусная кислота (А) и метиловый спирт (В). Применялась градиентная элюция в соответствии со следующей схемой:

Образцы после ферментации были разбавлены, отфильтрованы и проанализированы без дальнейшей обработки. Рибофлавин количественно определен путем сравнения с внешним стандартом. Расчеты были основаны на UV сигнале при 280 нм. Рибофлавин, приобретенный в Fluka (9471 Buchs, Switzerland), был использован в качестве вещества стандарта (степень очистки 99,0%).

Пример 10. Установление соответствующих остатков в ферментах ГТФ-циклогидролазах II, которые гомологичны ГТФ-циклогидролазе II Bacillus subtilis.

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей 92 различных ферментов ГТФ-циклогидролаз II, обнаруженных с применением программы BLASTN с использованием стандартных баз данных, таких как SWISS-PROT и TrEMBL (см. фиг. 1), было рассчитано с использованием программы «PILEUP» (GCG Wisconsin Package, version 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) с применением следующих параметров: штраф за открытие бреши 8, штраф за продление бреши 2 и матрица blosum62.cmp (значение параметров по умолчанию).

Гомологичная ГТФ-циклогидролаза II в контексте настоящего изобретения может демонстрировать сходство последовательности с любой из аминокислотных последовательностей ГТФ-циклогидролаз II, показанных на фиг. 1. Фиг. 1 предоставляет пример множественного выравнивания последовательностей 92 аминокислотных последовательностей ГТФ-циклогидролаз II, с последовательностью ГТФциклогидролазы II из Bacillus subtilis, выделенной подчеркиванием. Фиг. 1 служит только примером и не является полной коллекцией всех известных ферментов ГТФ-циклогидролаз II. Ожидается, что гомологичные остатки, то есть остатки в различных ферментах ГТФ-циклогидролазах II, которые расположены в одинаковой позиции при выравнивании аминокислотных последовательностей (то есть расположены в одной колонке, например, на фиг. 1), будут одинаково позиционированы в трехмерной (3D) структуре каждого белка и играть в каждом белке сравнимую роль как структурную, так и функциональную. Аминокислотные остатки, гомологичные аминокислотным остаткам в ГТФ-циклогидролазе II из В. subtilis, которые обсуждаются в примерах, на фиг. 1 выделены жирным шрифтом, и соответствующая позиция в аминокислотной последовательности В. subtilis указана над соответствующим столбцом выравнивания.

Аминокислотные остатки 92 различных организмов соответствуют специфическим аминокислотным позициям, то есть позициям, которые являются гомологичными/эквивалентными аминокислотным остаткам, для которых обнаружено, что они оказывают положительное влияние на удельную активность (аминокислотные остатки 261, 270, 276, 279, 308, 347) в аминокислотной последовательности ГТФциклогидролазы II Bacillus subtilis (SEQ ID NO:2), приведены полностью в табл. 4, где цифра в левой колонке характеризует организм (в соответствии с фиг. 1), первым указано название использованной последовательности, затем инвентарный номер в базе данных, и организм-источник последовательности, указанный в скобках:

(1) gch2_bacsu: SWISS-PROT: gch2_bacsu (Bacillus subtilis) (2) gch2_cangu: geneseqp:aay69776 (Candida guilliermondii) (3) gch2_ashgo: TrEMBL: CAA02912: (Ashbya gossypii (Eremothecium gosypii)) (4) gch2_yeast: SWISS-PROT: gch2_yeast (Saccharomyces cerevisiae) (5) gch2_neucr: TrEMBL: Q871B3 (Neurospora crassa) (6) gch2_schpo: TrEMBL: Q9P7M9 (Schizosaccharomyces pombe) (7) gch2_arcfu: SWISS-PROT: gch2_arcfu (Archaeoglobus fulgidus) (8) gch2_strco: SWISS-PROT: gch2_strco (Streptomyces coelicolor) (9) gch2_helpj: SWISS-PROT: gch2_helpj (Helicobacter pylori J99) (10) gch2_helpy: SWISS-PROT: gch2_helpy (Heliobacter pylori) (11) gch2_pyrfu: TrEMBL: Q8U4L7 (Pyrococcus furiosus) (12) gch2_fhema: SWISS-PROT: gch2_thema (Thermotoga maritima) (13) gch2_chlmu: SWISS-PROT: gch2_chlmu (Chlamydia muridarum) (14) gch2_chltr: SWISS-PROT: gch2_chltr (Chlamydia trachomatis) (15) gcb2_chlca: TrEMBL: AAP05635 (Chlamydia caviae GPIC) (16) gch2_chlpn: SWISS-PROT: gch2_chlpn (Chlamydia pneumoniae) (17) gch2_arath: SWISS-PROT: gch2_arath (Arabidopsis thaliana) (18) gch2_lyces: TrEMBL: CAC09119 (Lycopersicum esculentum) (19) gch2_orysa: TrEMBL: AAO72560 (Oryza sativum) (20) gch2_alceu: TrEMBL: Q9F184 (Alcaligenes eutrophus) (21) gch2_neima: SWISS-PROT: gch2_neima (Neisseria meningitidis (серологическая группа А)) (23) gch2_psepk: SWISS-PROT: gch2_psepk (Pseudomonas putida (штамм КТ2440)) (24) gch2_psesm: SWISS-PROT: gch2_psesm (Pseudomonas syringae (pv. tomato)) (25) gch2_actac: TrEMBL: Q9JRR0 (Actinobacillus actinomycetemcomitans (Haemophilus actinomycetemcomitans)) (26) gch2_haein: SWISS-PROT: gch2_pasmu gch2_haein (Haemophilus iniluenzae) (27) gch2_pasmu: SWISS-PROT: (Pasteurella multocida) (28) gch2_ecO6: TrEMBL: Q8FHU5 (Escherichia coli 06) (29) gch2_ecoli: SWISS-PROT: gch2_ecoli (Escherichia coli) (30) gch2_salty: TrEMBL: Q8XFY7 (Salmonella typhimurium) (31) gch2_yerpe: TrEMBL: Q8ZEF0 (Yersmia pestis) (32) gch2_bucai: SWISS-PROT: gch2_bucai (Buchnera aphidicola (подвид. Acyrthosiphon pisum) (бактерия-симбионт Acyrthosiphon pisum)) (33) gch2_bucap: SWISS-PROT: gch2_bucap (Buchnera aphidicola (подвид Schizaphis graminum)) (34) gch2_wigbr: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Wigglesworthia glossinidia brevipalpis) (35) gch2_bucbp: SWISS-PROT: gch2_wigbr (Buchnera aphidicola (подвид Baizongia pistaciae)) (36) gch2_mycle: TrEMBL: Q9CCP4 (Mycobacterium leprae) (37) gch2_myctu: SWISS-PROT: gch2_myctu (Mycobacterium tuberculosis) (38) gch2_coref: TrEMBL: Q8FT57 (Corynebacterium efficiens) (39) gch2_corgl: GENESEQP: AAB79913 (Corynebacterium glutamicum) (40) gch2_coram: SWISS-PROT: gch2_coram (Corynebacterium ammoniagenes (Brevibacterium ammoniagenes)) (41) gch2_staau: TrEMBL: Q8NW14 (Staphylococcus aureus (strain MW2)) (42) gch2_staep: GENESEQP: ABP40248 (Staphylococcus epidermidis) (43) gch2_actpl: SWISS-PROT: gch2_actpl (Actinobacillus pleuropneumoniae) (44) gch2_lacla: TrEMBL: Q9CGU7 (Lactococcus lactis (подвид lactis) (Streptococcus lactis)) (45) gch2_stcag: TrEMBL: Q8E658 (Streptococcus agalactiae (серологическая группа HI)) (46) gch2_stcpn: TrEMBL: Q8DRF1 (Streptococcus pneumoniae (штамм АТСС ВАА-255 /R6)) (47) gch2_cloac: TrEMBL: Q97LG9 (Clostridium acetobutylicum) (48) gch2_fusnu: TrEMBL: Q8RIR1 (Fusobacterium nucleatum (подвид nucleatum)) (49) gch2_anasp: TrEMBL: QSRIR1 (Anabaena sp. (штамм РСС 7120)) (50) gch2_syny3: SWISS-PROT: gch2_syny3 (Synechocystis sp. (штамм РСС 6803)) (51) gch2_synel: TrEMBL: Q8DI64 Synechococcus elongatus (Thermosynechococcus elongatus) (52) gch2_bacam: SWISS-PROT: gch2_bacam (Bacillus amyloliquefaciens) (53) gch2_bacce: TrEMBL: AAP11030 (Bacillus cereus ATCC 14579) (54) gch2_bacha: TrEMBL: Q9KCL5 (Bacillus halodurans) (55) gch2_clope: TrEMBL: Q8XMX0 (Clostridium perfringens) (56) gch2_clote: TrEMBL: Q897Q8 (Clostridium tetani) (57) gch2_chlte: TrEMBL: Q8KC35 (Chlorobium tepidum) (58) gch2_aquae: SWISS-PROT: gch2_aquae (Aquifex aeolicus) (59) gch2_lepin: TrEMBL: Q8F701 (Leptospira interrogans) (60) gch2_deira: TrEMBL: Q9RXZ9 (Deinococcus radiodurans) (61) gch2_bacth: TrEMBL: Q8A528 (Bacteroides thetaiotaomicron) (62) gch2_caucr: TrEMBL: Q9A9S5 (Caulobacter crescentus) (63) gch2_coxbu: TrEMBL: AAO90191 (Coxiella burnetii RSA 493) (64) gch2_rhiet: TrEMBL: Q8KL38 (Rhizobium etli) (65) gch2_lacpl: TrEMBL: Q88X17 (Lactobacillus plantaram) (66) gch2_psegl: TrEMBL: Q8RS38 (Pseudomonas glumae) (67) gch2_strav: TrEMBL: BAC71833 (Streptomyces averrnitilis) (68) gch2_phopo: SWISS-PROT: gch2_phopo (Photobacterium phosphoreum) (69) gch2_azobr: SWISS-PROT: gcb2_azobr (Azospirillum brasilense) (70) gch2_agrtu: TrEMBL: Q8UHC9 (Agrobacterium tumefaciens (штамм С58 / ATCC 33970)) (71) gch2_rhime: TrEMBL: Q92RH2 (Rhizobium meliloti (Sinorhizobium meliloti)) (72) gch2_brume: TrEMBL: Q8YFL5 (Bracella melitensis) (73) gch2_brusu: TrEMBL: Q8G298 (Brucella suis) (74) gch2_rhilo: TrEMBL: Q985Z3 (Rhizobium loti (Mesorhizobium loti)) (75) gch2_braja: TrEMBL: Q89RZ7 (Bradyrhizobium japonicum) (76) gch2_niteu: TrEMBL: CAD86468 (Nitrosomonas europaea ATCC 19718) (77) gch2_ralso: TrEMBL: Q8Y1H7 (Ralstonia solanacearum (Pseudomonas solanacearum)) (78) gch2_neime: TrEMBL: Q9JZ77 (Neisseria meningitidis (серологическая группа В, обнаружен второй фермент)) (79) gch2_xanax: TrEMBL: Q8PPD7 (Xanthomonas axonopodis (pv. citri)) (81) gch2_vibpa: TrEMBL: Q87RU5 (Vibrio parahaemoryticus) (82) gch2_vibvu: TrEMBL: Q8DF98 (Vibrio vulnificus) (83) gch2_vibch: TrEMBL: Q9KPU3 (Vibrio cholerae) (84) gch2_vibfi: TrEMBL: Q8G9G5 (Vibrio flscheri) (85) gch2_sheon: TrEMBL: Q8EBP2 (Shewanella oneidensis) (86) gcli2_phoph: TrEMBL: Q8G9H7 (Photobacterium phosphoreum) (87) ribb_phole: TrEMBL: Q93E93 (Photobacterium leiognathi) (88) gch2_psepu: TrEMBL: Q88GB1 (Pseudomonas putida (штамм КТ2440, обнаружен второй фермент)) (89) gch2_psesy: TrEMBL: Q882G0 (Pseudomonas syringae (pv. Tomato, обнаружен второй фермент)) (90) gch2_pseae: TrEMBL: Q9HWX4 (Pseudomonas aeraginosa) (91) ribb_dehmu: SWISS-PROT: ribb_dehmu (Dehalospirillum multivorans) (92) gch2_xylfa: TrEMBL: Q87D69 (Xylella fastidiosa (штамм Temeculal/ATCC 700964)) Позиции/аминокислотные остатки, соответствующие позициям V261, G270, А276, Q279, K308 и М347 RibA В. subtilis согласно SEQ ID NO:2. Цифры в левой колонке соответствуют различным организмам (см. выше).

- 18 Примеры, показанные в табл. 4, служат иллюстрацией принципа используемого подхода. Соответствующие остатки могут быть определены для всех других аминокислотных последовательностей ГТФциклогидролазы II, которые являются гомологичными любой из последовательностей, показанных на фиг. 1 или в табл. 4.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II, в которой (i) удельная активность модифицированного фермента повышена в сравнении с таковой немодифицированного фермента, и (ii) аминокислотная последовательность модифицированного фермента включает по меньшей мере одну мутацию в позиции, соответствующей аминокислотной позиции в SEQ ID NO:2, причем указанная 2. Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II по п.1, которая демонстрирует удельную активность, которая по меньшей мере приблизительно на 10% выше по сравнению с таковой соответствующей немодифицированной ГТФ-циклогидролазы II.

3. Модифицированная ГТФ-циклогидролаза II по п.1 или 2, где одна либо более мутация(й) представляют собой одну либо более замену(ы).



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«02.08.2006 2/1248 6 РАЗДЕЛ ВТОРОЙ ЗАКОНЫ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ЗАКОН Р ЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ 19 июля 2006 г. 151 З 2/1248 О присоединении Республики Беларусь к Конвенции о регистрации судов внутреннего плавания (20.07.2006) Принят Палатой представителей 14 июня 2006 года Одобрен Советом Республики 30 июня 2006 года Статья 1. Присоединиться к Конвенции о регистрации судов внутреннего плавания, под писанной в г. Женеве 25 января 1965 года (далее – Конвенция), со следующими оговорками: Республика...»

«Библиографическое описание. Общие положения Библиографические ссылки и список использованной литературы составляют библиографический аппарат научных работ. Эта часть научного труда основывается на библиографическом описании документов. Библиографическое описание состоит из элементов, которые объединены в области в соответствии с их функциональным назначением. Элементы и области описания приводят в строго установленной последовательности. Сведения, относящиеся к разным элементам, но...»

«РОССИЯ Координация & подведение итогов ВЫХОДНЫЕ ДАННЫЕ © Издано Фондом имени Генриха Бёлля, 2012 г. Отпечатано, апрель 2012 Координаторы: Кристиане Пютц, Райндер Штенблок Редакция: Кристиане Пютц, Бастиан Хермиссон Редактор российского издания: Ирина Деттманн Перевод с немецкого: Вадим Шубин Верстка и Печать: типография ИПФ Гарт, Москва, ул. М. Почтовая, 12 Оригинал издан на немецком языке. Фонд имени Генриха Бёлля, Шуманнштрассе 8, 10117 Берлин Tел.: +49 30 28534-0 Факс: +49 30 28534-109 Эл....»

«МСФО в кармане 2010 Вступительное слово Представляем вам очередной выпуск брошюры МСФО в кармане, в который вошли все изменения международных cтандартов финансовой отчетности по состоянию на конец первого квартала 2010 года. Наша публикация охватывает материал, сделавший данное издание популярным во всем мире: общие сведения о структуре и проектах Комитета по МСФО (КМСФО); анализ применения МСФО в мире; краткое описание всех действующих стандартов и интерпретаций; последнюю информацию о...»

«Полковник Старчак Иван Георгиевич С неба — в бой Проект Военная литература: militera.lib.ru Издание: Старчак И. Г. С неба — в бой. — М.: Воениздат, 1965. OCR, правка: Андрей Мятишкин (amyatishkin@mail.ru) [1] Так обозначены страницы. Номер страницы предшествует странице. Старчак И. Г. С неба — в бой. — М.: Воениздат, 1965. — 184 с. — (Военные мемуары). / Литературная запись И. М. Лемберика. // Тираж 75 000 экз. Цена 43 коп. Аннотация издательства: В годы Великой Отечественной войны в печати...»

«Новости 4 Новости 10 События Выставки 12 ProMediaTech – международный фестиваль технологий и продвижения рекламы 33 Календарь специализированных выставок 2009 года Музыкальный салон 14 Сабвуферы X-Treme 16 Stagetec. Пульты Aurus, Auratus и видеороутер Nexus в России 19 Wharfidale. Акустические системы серии Titan 20 Wharfidale. Звукоусилительные приборы 22 Yamaha. Микшерные пульты серии IM8 24 Electro-Voice. Новая серия микрофонов PL 26 EM Acoustics HALO: шаг в будущее 28 Ускорение при подъеме....»

«Содержание 1 Описание системы 1.1 Введение 1.2 Обзор системы Geberit Mapress 1.2.1 Система пресс-соединений Mapress 1.2.2 Сертификаты Mapress Руководство по Монтажу 1.3 Элементы системы 1.3.1 Трубы системы Mapress 1.3.2 Пресс-фитинги Mapress 1.3.3 Уплотнительные кольца системы Mapress. 20 1.3.4 Прессовые инструменты для системы Mapress. 1.4 Методы прокладки трубопроводов 1.4.1 Прокладка трубопровода 1.4.2 Компенсация расширения 1.4.3 Крепежные элементы для труб 1.4.4 Теплоотдача 1.4.5 Таблицы...»

«книга рецептов для индУкционноЙ МУлЬтиварки U700 www.bork.ru книга рецептов для индУкционноЙ МУлЬтиварки U700 Содержание Примечания Среднее время приготовления в режиме Мультиповар режим поджаривание можно заменить обжариванием Птица. цельная птица — до 1 часа, кусочками — до 20–25 минут 4 автопрограммы: рис 29 ежики на сковороде на плите. (например, ножки — 10–12 минут). 5 автопрограммы: гречка 30 голубцы результаты приготовления могут незначительно отличаться Рыба. цельная рыба — 20–30 минут,...»

«А.М.Самозванцев О РИТУАЛЕ ПОМАЗАНИЯ ЦАРЯ НА ЦАРСТВО В ЯДЖНАВАЛКЬЯ-СМРИТИ Дхармашастры, этические сочинения древней и средневековой Индии, описывают не просто правила поведения (дхармы) благочестивого индуиста и прежде всего дваждырожденного, но правила поведения, определенным образом организованные. Первоначальным способом организации их текста и материала был ашрамно-временной, т.е. представленный в виде ашрам, или стадий жизни: брахманского ученика, домохозяина, лесного отшельника и...»

«Виктор Калина ГЕНЕРАЛЫ ГЕНЕРАЛЫ ДВОРОВ Виктор Калина ГЕНЕРАЛЫ ДВОРОВ Зебра Е МОСКВА 2007 СОДЕРЖАНИЕ УДК 821.161.1 31 ББК 84(2Рос=Рус)6 44 К17 Художественное оформление Александр Щукин Предисловие 6 СЛЕЗА ДЕВЧОНКИ Подписано в печать 04.09.2006. Формат 84х108/ Гарнитура Ньютон. Печать офсетная. Усл. печ. л. 15,96. Тираж 5 000 экз. Заказ № 9998. СТАРЫЕ ДРУЗЬЯ Калина, Виктор. ЦЫГАНКА АЛИСА К17 Генералы дворов / Виктор Калина. — М : Зебра Е, 2007. — 304 с. ЗА ПА ЦАНОВ!...»

«Издательство Вакифа Ихласа №: 1 ВСЕM НУЖНАЯ ВЕРА С Багдадским Mевляна Xалидом 10. издание Вопросительный Адрес: HAKKAТ KТBЕV Darefeka Cad. No: 57 P. K. 35 34262 Tel: 90.212.523 45 56 – 532 58 43 Fax: 90.212.525 59 79 http://www.hakikatkitabevi.com e-mail: bilgi@hakikatkitabevi.com Fatih-STANBUL/TURKEY 2000 Bask: hls Gazetecilik A.. STANBUL Tel: 90.212.454 30 00 Припоминание: Миссионери трудятся расширять христианство, книгоиздальство “Хакикат” - правда – в Стамбуле – стремтся распростанять...»

«СОДЕРЖАНИЕ 1. Общие положения 4 1.1 Основная образовательная программа (ООП) бакалавриата, реализуемая вузом по направлению подготовки Наземные транспортно-технологические комплексы 4 1.2 Нормативные документы для разработки ООП бакалавриата по направлению подготовки Наземные транспортно-технологические комплексы 4 1.3 Общая характеристика вузовской основной образовательной программы высшего профессионального образования (ВПО) (бакалавриат) 5 1.4 Требования к абитуриенту 5 2. Характеристика...»

«Л. М. ГРОХОВСКИЙ, М. А. ГРОХОВСКАЯ ПОИСКИ И РАЗВЕДКА МЕСТОРОЖДЕНИЙ МИНЕРАЛЬНЫХ СОЛЕЙ МОСКВА НЕДРА 1980 УДК 553.63 : 550.8 Гроховский Л. М., Гроховская М. А. Поиски и разведка месторождений минеральных солей. М., Недра, 1980. 163 с. В предлагаемой книге рассматриваются: формирование месторождений солей, диагенетические изменения их, условия питания солеродных бассейнов, современный и древний, морской и континентальный галогенез. Основная часть книги посвящена методам поисков и разведки соляных...»

«ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ФОЛЬКЛОРУ И МИФОЛОГИИ ВОСТОКА РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ И. С. Брагинский Г.А.Зограф Е.М.Мелетинстшй (председатель) С./0. Неклюдов (секретарь) Я. С. Новик Б.Л.Рифтин С.С.Целъникер ГЛАВНАЯ РЕДАКЦИЯ ВОСТОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ V АРХАИЧЕСКИЙ РИТУАЛ В ФОЛЬКЛОРНЫХ И РАННЕЛИТЕРАТУРНЫХ ПАМЯТНИКАХ М О С К В А А Составитель Л.Ш.Розканский Ответственный редактор Е. С. Новик Рецензенты Г.Г.Бандипенко, В.И.Брагинский Основная часть публикуемых материалов...»

«Молочно-медовые скидки Каталог №13 2011 (19.09 – 08.10) Крем-мыло Молоко и мед – Золотая Крем для рук и тела Молоко и мед – серия Золотая серия 75 г. 250 мл. 80 pyб. 260 pyб. 15571 15570 Идея и разработка – ЙОНАС ВРАМЕЛЬ косметический бренд Станьте своим личным визажистом! Декоративная в странах СНГ Нежное мыло Смягчающий крем косметика Студио-Арт поможет вам выглядеть В НАШЕЙ 39 руб. 129 руб. великолепно при любом освещении. Профессиональная серия, которой вы можете доверять всегда и везде –...»

«ООО “Аукционный Дом “Империя” Аукцион №35 Антикварные книги и автографы 21 июня 2014 года Начало в 12.00 Регистрация начинается в 11.30 Отель “Националь” Москва, ул. Тверская, д.1 / Моховая, д. 15/1 Зал “Псков” Предаукционный просмотр лотов с 9 по 20 июня 2014 года ежедневно кроме воскресенья в офисе Аукционного Дома “Империя”, расположенного по адресу: Москва, ул. Остоженка, 3/14 (вход с 1-го Обыденского переулка) с 11.00 до 20.00. Заявки на участие в аукционе, телефоны и заочные биды, заказ...»

«СОДЕРЖАНИЕ Стр. 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ 4 Нормативные документы для разработки ОПОП по направлению подготовки Общая характеристика ОПОП 1.2. 5 Цели и задачи ОПОП СПО 1.3. 6 Требования к абитуриенту 1.4. 6 ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ 2. 6 ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ВЫПУСКНИКА 2.1. Область профессиональной деятельности выпускника 6 Объекты профессиональной деятельности выпускника 2.2. Виды профессиональной деятельности выпускника 2.3. Задачи профессиональной деятельности выпускника 2.4. КОМПЕТЕНЦИИ ВЫПУСКНИКА...»

«ЗАКЛЮЧЕНИЕ по организации и состоянию учебно-методической и воспитательной работы в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Поморский государственный университет имени М.В.Ломоносова В соответствии с распоряжением Федеральной службы по надзору в сфере образования и науки Министерства образования и науки Российской Федерации от 01.06.2005 г. №874-05 осуществлена аттестационная экспертиза учебнометодической и воспитательной работы государственного...»

«МАЙ– 04 ИЮНЬ 2014 Для тех, кто строит для себя и для других Верю! Двухдневная отсрочка платежа – сервис-выручалочка для владельцев карт. читайте на стр. 2 Не отключайся! Почему Петрович решил снять Петр Свищев, Стройпитер рекламу, отличную от других. Два кило информации читайте на стр. В апреле вышел в свет каталог товаров СТД Петрович. Благодаря многочисленным отзывам и предложениям наших покупателей мы внесли в издание существенные изменения. В этом году мы ушли от деления на от- чтобы помочь...»

«РЕЙТИНГОВАЯ СИСТЕМА ОЦЕНКИ И УЧЕТА УСПЕВАЕМОСТИ Рекомендации для студентов 2 ВВЕДЕНИЕ 2 ЧТО ТАКОЕ РЕЙТИНГОВАЯ СИСТЕМА 3 ЗАЧЕМ НУЖНА РЕЙТИНГОВАЯ СИСТЕМА 4 СТРУКТУРА РЕЙТИНГА И ОЦЕНКА ПИСЬМЕННЫЕ ДОМАШНИЕ РАБОТЫ 6 8 РУБЕЖНЫЕ КОНТРОЛИ, ЗАЧЕТЫ И ЭКЗАМЕНЫ ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ОБ УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЕ Положение о проведении промежуточной аттестации в письменной форме (выдержки)_ Введение С 2006-2007 учебного года в нашем институте введена рейтинговая система оценки и учета успеваемости, которая немного меняет...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.