WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |

«Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего профессионального образования направления подготовки Нанотехнология с профилем подготовки ...»

-- [ Страница 1 ] --

Учебно-методическое обеспечение для подготовки кадров по программам высшего

профессионального образования для тематического направления ННС «Нанобиотехнологии»

Учебно-методическое обеспечение для подготовки магистров по программам высшего

профессионального образования направления подготовки «Нанотехнология» с

профилем подготовки «Нанобиотехнологии»

ПРИМЕРНАЯ ПРОГРАММА ВЫПОЛНЕНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТОВ НА УНИКАЛЬНОМ

ОБОРУДОВАНИИ ДЛЯ МАГИСТРОВ

НОУДПО «Институт «АйТи»

2009 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. Введение

II. Цель и задачи

III. Перечень дисциплин, использующих уникальное оборудование

IV. Перечень уникального оборудования и базы проведения экспериментов (включая работу со специализированным программным обеспечением)

V. Структура и содержание экспериментов, проводимых на уникальном оборудовании.... 1. Дисциплина «Биосовместимые наноматериалы»

2. Дисциплина «Молекулярное моделирование нано- и биоструктур»

3. Дисциплина «Конфокальная микроскопия и микроспектроскопия»

4. Дисциплина «Атомно-силовая микроскопия биообъектов»

5. Дисциплина «Основы метаболической инженерии»

6. Дисциплина «Применение ИКТ в молекулярной инженерии»

7. Дисциплина «Электронная микроскопия биообъектов»

8. Дисциплина «Белковая инженерия»

VI. Техника безопасности при проведении студентами экспериментов на уникальном учебно-научном оборудовании

I. ВВЕДЕНИЕ Выработка прочных экспериментально-практических навыков реальной научноисследовательской работы в области нанобиоматериалов, компонентов наносистемной техники, нанобиодиагностики является важным компонентом магистерской программы по профилю «Нанобиотехнологии», который реализуется через выполнение студентами широкого набора лабораторных и практических работ с использованием уникального современного учебно-исследовательского оборудования.

Программа экспериментов разработана таким образом, чтобы сформировать у студентов навыки работы по трем основным направлениям, используемым в современных нанобиотехнологиях:

(1) разработка нанобиообъектов методами компьютерного моделирования, предсказание и направленная модификация их свойств с использованием современных вычислительных технологий;

(2) способы создания молекулярных и супрамолекулярных наноструктур с заданными свойствами с применением методов молекулярной биоинженерии, и, в частности, генной и белковой инженерии;

(3) специализированные методы изучения структуры нанобиообъектов и их биологических свойств.

Программа экспериментов готовит студентов к решению следующих типовых задач:

выбор оптимального метода и программы исследований, модификация существующих – и разработка новых методик, исходя из задач конкретного исследования;

проведение самостоятельных научно-исследовательских работ в области – нанобиотехнологий, требующих владения навыками современных экспериментальных методов;

квалифицированная эксплуатация современного лабораторного оборудования и – приборов;

участие в экспериментальной оптимизации существующих наукоемких методик в – области нанобиотехнологий.

научная организация эксперимента, проектирование научно-исследовательских – работ в области нанобиотехнологий;

Практическая экспериментальная работа и анализ ее результатов призваны развить в студентах следующие универсальные, инструментальные и профессиональные компетенции:

расширенные представления о категориях, законах, приемах и формах научного познания, теории и методологии исследований при изучении различных уровней организации материи;

широкая эрудиция в области нанобиотехнологий, включая методы синтеза и анализа структуры и свойств нанобиоматериалов, фундаментальные навыки научноисследовательской работы;

способность глубоко понимать и творчески использовать в научной и производственно-технологической деятельности знания прикладных разделов специальных дисциплин магистерской программы;

свободное владение профессиональными знаниями в области информационных технологий, использование современные компьютерных сетей, баз данных, программных продуктов и ресурсов Интернет для решения задач профессиональной деятельности и за ее пределами, связанных с моделированием; анализом результатов математической обработки научных данных;

способность представлять итоги выполненной работы в виде отчетов, докладов, научных публикаций;

способность к разработке новых, оригинальных и высокоэффективных, технологий получения современных нанобиоматериалов;

способность к комплексному анализу и аналитическому обобщению результатов научно-исследовательских работ с использованием современных достижений науки и техники, передового отечественного и зарубежного опыта в области нанобиотехнологий и смежных дисциплин для научной, патентной и маркетинговой поддержки проводимых фундаментальных исследований и технологических разработок в области нанобиотехнологий;

готовность к самостоятельной высококвалифицированной эксплуатации современного лабораторного, аналитического и исследовательского оборудования и приборов, применяемых в нанобиотехнологиях;

способность к участию в экспериментальной и технико-проектной оптимизации существующих наукоемких методик получения нанобиоматериалов для успешной конкуренции на рынке идей и технологий;

II. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ

Цель программы - закрепить и дополнить теоретические знания, получаемые студентами по профилю подготовки «Нанобиотехнологии», практическими навыками и опытом проведения экспериментов и анализов на сложном высокотехнологическом лабораторном и аналитическом оборудовании, которое является обязательным компонентом экспериментальных и промышленных нанобиотехнологий.

Задачами программы выполнения экспериментов на уникальном оборудовании являются:

существенное когнитивное расширение студентами ключевых понятий и концепций и тем самым формирование глубокого прогностического понимания фундаментальных проблем и практических методов их решения в области нанобиотехнологий;

формирование у студентов профессиональной способности планировать и самостоятельно проводить эффективную научную работу, критически оценивать ее результаты, адаптировать и применять общие методы к решению нестандартных типов развитие у студентов критического мышления и осведомленности о достижениях и передовых исследованиях в области нанобиотехнологий и в смежных областях;

подготовка студентов к профессиональной деятельности или обучению в аспирантуре.

III. ПЕРЕЧЕНЬ ДИСЦИПЛИН, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ УНИКАЛЬНОЕ

ОБОРУДОВАНИЕ

Выполнение студентами, обучающимися по программе магистров, экспериментов на уникальном оборудовании предусмотрено в курсах следующих дисциплин:

«Применение ИКТ в молекулярной инженерии», «Молекулярное моделирование нано-и биоструктур», «Основы метаболической инженерии», «Биосовместимые наноматериалы», «Конфокальная микроскопия и микроспектрометрия», «Белковая инженерия», «Электронная микроскопия нанобиообъектов», «Атомно-силовая микроскопия биообъектов»

Работы по дисциплинам «Применение ИКТ в молекулярной инженерии» и «Молекулярное моделирование нано-и биоструктур» формируют готовность к использованию современных методов молекулярного моделирования биологических макромолекул (на примере белков, биомембран и белок-мембранных систем, наночастиц и их взаимодействия с биополимерами);

Работы по дисциплине «Основы метаболической инженерии» закрепляют понимание роли и места метаболической инженерии в современных нанобиотехнологиях, формируют представление о единстве теоретических и экспериментальных методов исследования метаболизма, необходимости использования новейших результатов фундаментальной молекулярной биологии, генетики и биоинформатики для создания новых продуцентов с метаболически регулируемой экспрессией биосинтетических генов.

Работы по дисциплине «Белковая инженерия» дают представление о современной молекулярной биоинженерии, методах получения и исследования природных рекомбинантных и искусственных белков в различных экспрессирующих системах.

Работы по дисциплине «Биосовместимые наноматериалы» формируют умения и навыки самостоятельной работы с биологическими объектами, в изучении клеточных механизмов тканевой совместимости и отторжения трансплантатов. Эти работы позволяют овладеть способами выделения клеток из ткани, их очистки, фракционирования, культивирования, а также современными тестами на биосовместимость для оценки физиологического и репаративного морфогенеза конструируемой ткани. Работы знакомят со способами изучения влияния наночастиц на аппарат наследственности.

Работы по дисциплине «Конфокальная микроскопия и микроспектрометрия»

формируют навыки использования проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и микроспектроскопии для изучения особенностей взаимодействия биологически-активных соединений с клетками, их внутриклеточной локализации, для выполнения количественного статистически достоверного анализа на ограниченной выборке клеток. Эти работы дают опыт, необходимый для изучения эффективности лекарственных препаратов, доставляемых транспортерами на основе адресной доставки лекарств в заданные субклеточные структуры клеток-мишеней с применением макромолекулярных нанотранспортеров.

Работы по дисциплине «Атомно-силовая микроскопия биообъектов» дают понимание возможностей применения атомно-силовой и сканирующей зондовой микроскопии в области нанобиотехнологий.

Работы по дисциплине «Электронная микроскопия нанобиообъектов» формируют навыки использования электронной микроскопии, как одного из основных инструментов исследования и визуализации наночастич и нанобиообъектов в нанобиотехнологиях.

Следует отметить, что проведение лабораторных и практических работ с применением учебно-научного уникального оборудования по целому ряду дисциплин требует наличия компьютерного класса, в котором обеспечена возможность индивидуальной работы каждого студента на персональном компьютере. Компьютерный класс используется непосредственно в процессе проведения лабораторных и практических работ в курсах таких дисциплин, как «Применение ИКТ в молекулярной инженерии», «Молекулярное моделирование нано-и биоструктур», «Основы метаболической инженерии», «Атомносиловая микроскопия биообъектов», «Электронная микроскопия нанобиообъектов». Кроме того, по программе этих же дисциплин, а также в курсах «Конфокальная микроскопия и микроспектрометрия» и «Белковая инженерия» компьютерный класс необходим для обработки результатов экспериментов, полученных студентами в процессе выполнения лабораторных и практических работ, их анализа и подготовки отчетов.

IV. ПЕРЕЧЕНЬ УНИКАЛЬНОГО ОБОРУДОВАНИЯ И БАЗЫ ПРОВЕДЕНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТОВ (ВКЛЮЧАЯ РАБОТУ СО СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫМ

ПРОГРАММНЫМ ОБЕСПЕЧЕНИЕМ)

микроскоп с тринокуляром освещения по методу анализа препаратов методами 1. микрофотографии и матрицей адаптированная для фотографий биологических анализа изображений крепления на тринокуляре препаратов под микроскопом 1. Система обозначений: Д-демонстрационный экземпляр, К-полная комплектация (на каждого студента), Ф-фронтальная работа (единица на группу из нескольких студентов) компьютер, совместимый специальных требований к с системой для цифровой мощности процессора и размеру микрофотографии и оперативной памяти. Должен анализа изображений иметь дополнительный слот на 1. горизонтального аналогичная. В состав миниэлектрофореза в агарозном камеры должны входить: литая геле в комплекте со ячейка из прозрачного пластика, 1. тока, предназначенный для Выходное напряжение не менее для электрофорезной минипроведения электрофореза 300В; Выходной ток не менее 300 камеры при проведения 1. 1. 1. По дисциплине «Конфокальная микроскопия и микроспектрометрия»

2. 2. настольная центрифуга Центрифуге MiniSpin фирмы Подготовка образцов для Д 2. 2.4.

2.5.

2. Комплект реактивов для Включая: родамин 123 или Для приготовления образцов, окрашивания клеточных оранжевый; нильский красный; лабораторных и практических 2. 2. обработки и анализа распространяемый свободно на микроскопических изображений, полученных сайте http://rsb.info.nih.gov/ij/ или изображений, полученных в методом конфокальной аналогичный по возможностям лабораторных и практических По дисциплине «Электронная микроскопия нанобиообъектов»

3. Электронный микроскоп Просвечивающий электронный Для проведения 3. Расходные материалы для Сетки, слюда, углеродные Для использования в практикума стержни, уранил ацетат, пинцеты лабораторных и практических 3. 3. Серверный компьютер (в С клавиатурой, мышью, составе компьютерного монитором, UPS и набором 3. Комплект локальной сети с выходом в интернет (в составе компьютерного 3. компьютер (в составе монитором и набором базового 3. По дисциплине «Молекулярное моделирование нано-и биоструктур»

симуляции процессов свободном доступе в сети молекулярной динамики развитыми средствами комплексный программный структур с целью их визуализации для сборки продукт, предназначенный для дальнейшего анализа и редактирования структур задач молекулярного методами молекулярного подготовке входной включать в себя средствами информации (структуры визуализации для сборки и дальнейших расчетов сложных молекул, а также Пакет программ для PUMA или аналогичный должен для осуществления расчтов расчета молекулярной обеспечивать: возможность молекулярной динамики динамики сложных преобразования файлов PDB к моделируемых молекулярных 4. Мультимедийная «Молекулярное моделирование и 4. По дисциплине «Применение ИКТ в молекулярной инженерии»

симуляции процессов Пакет программ Modyp или лабораторных работ по 5. 6. преобразований моделировать преобразования дисциплине последовательности последовательности, проверять 6. По дисциплине «Атомно-силовая микроскопия биообъектов»

7. АСМ и инструменты Графит, слюда, СТМ проволока, используемых в 7. Пакет программ для программное обеспечение Для обработки результатов (изображений), полученных методом сканирующей зондовой 7. 7. Система очистки воды Система для получения особо Для приготовления растворов, Д Лабораторный рН-метр Стандартный лабораторный рН- Дли измерения рН буферных Д горизонтального ячейка из прозрачного пластика, электрофореза ДНК в ходе электрофореза в агарозном защитная крышка с проводами. лаобраторных работ по Термостат электрический Режим работы – автоматический. Для поддержания постоянной Ф 8. для пробирок Диапазон рабочих температур от температуры при проведении 8. 8. 8. Весы прецизионные Весы прецизионные с точностью Для взвешивания агарозы, Д 8. 8. Магнитная мешалка Стандартная магнитная мешалка Для приготовления растворов Ф 8. 8. 8. 8.

V. СТРУКТУРА И СОДЕРЖАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ, ПРОВОДИМЫХ НА

УНИКАЛЬНОМ ОБОРУДОВАНИИ

1. ДИСЦИПЛИНА «БИОСОВМЕСТИМЫЕ НАНОМАТЕРИАЛЫ»

Эксперименты, проводимые на специализированном учебно-научном оборудовании, по дисциплине «Биосовместимые наноматериалы» выполняются в рамках двух лабораторных работ «Биологические тесты совместимости биокомпозитных имплантатов in vitro» и «Проведение теста на генотоксичность наноматериала с использованием метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод "ДНК-комет")».

Комплект специализированного оборудования для этих лабораторных работ включает в себя:

(1) устройства для микроскопического анализа препаратов методами проходящего света и флуоресценции, получения цифровых фотографий препаратов под микроскопом и автоматического анализа изображений (флуоресцентный микроскоп с тринокуляром, система для цифровой микрофотографии и анализа изображений, управляющий устройствами компьютер, совместимый с системой для цифровой микрофотографии и анализа изображений);

(2) устройства (мини-камера для горизонтального электрофореза в агарозном геле и источник постоянного тока), реактивы и расходные материалы для проведения исследований клеток методом электрофореза.

Лабораторная работа № 1. Биологические тесты совместимости биокомпозитных имплантатов in vitro Цель экспериментов Закрепить у студентов теоретические знания по тестированию свойств новых материалов на биосовместимость через получение практических навыков определения цитотоксичности биокомпозитных материалов.

Задачи экспериментов 1. изучить теоретические основы тестов на биосовместимость в медикобиологических исследованиях.

2. изучить технику культивирования эритробластических островков, выделенных из бедренной кости лабораторного животного.

3. определить цитотоксичность биокомпозитного материала in vitro.

Характер экспериментов: репродуктивный.

Форма организации студентов: групповая.

Время, отводимое на выполнение экспериментальной работы: 4 часа Краткие теоретические основы эксперимента Биосовместимость определяется, как способность материала функционировать при определенном применении в присутствии соответствующего ответа организма хозяина. В соответствии с EN 1441 (European Committee for Standardization 1996) биосовместимые материалы не должны вызывать какой-либо риск. Биосовместимость эндодонтических материалов характеризуется многими параметрами, такими как генотоксичность, мутагенность, карциногенность, цитотоксичность, гистосовместимость и микробиологические эффекты.

В 1984 г ISO бала принята следующая последовательность тестирования биокомпозитных материалов:

1. тестирование на цитотоксичность и мутагенность;

2. тесты на сенсибилизацию, тесты имплантации, раздражение слизистой.

Для тестирования материала биокомпозитных имплантов на цитотоксичность можно использовать метод культивирования клеток красного косного мозга на поверхности субстратов, приготовленных из анализируемого материала.

Костная ткань находится в динамическом взаимодействии в клетками сосудов, крови, костного мозга – эндотелиоцитами, лейкоцитами, фибробластами, ретикулоцитами, адипоцитами, клетками гемопоэза, а так же с элементами хрящевых тканей – хондробластами и хондроцитами. При этом стволовые стромальные клетки – предшественники остеобластов входят в состав кроветворного микроокружения и локализуются в строме красного костного мозга, поэтому при исследовании гистосовместимости имплантатов с биологическими системами необходимо определить уровень цитотоксичности исследуемого материала. Для этого можно проводить культивирование in vitro красного костного мозга, полученного из проксимальной участка бедренной кости животного, после эвтаназии. Культивирование возможно проводить на различных подложках, в том числе и на поверхности субстратов, изготовленных из материала биокомпозитных имплантов. Путем сравнения жизнеспособности клеток, растущих на контрольных и на тестируемых субстратах, можно сделать вывод о цитотоксичности биокомпозитов или ее отсутствии.

Получение и культивирование клеток костного мозга проводится по методу Ю.М.

Захарова (2002). Уровень цитотоксичности определяется по процентному соотношению живых и погибших клеток, окрашенных 0,1% раствором трипанового синего. Для количественного определения эритробластических островков костного мозга применяется прижизненная окраска клеток красителем – нейтральным красным с последующим подсчетом их в камере Горяева.

Ход экспериментов При подготовке к работе студенты знакомятся с теоретическими основами техники выделения костного мозга и культивирования эритробластических островков, выделенных из бедренной кости лабораторного животного по методу Ю.М. Захарова (2002).

На первом этапе лабораторной работы студенты проводят выделение и количественный анализ эритробластических островков костного мозга лабораторного животного. На втором этапе студенты осваивают методику культивирования выделенных эритробластических островков. На третьем этапе студенты исследуют цитотоксические свойства биоматериала «НС титан ВТ1-0 – Са-Р покрытие», полученного группой ученых СО РАН (Ю.Р. Колобов с соавт., 2005). Студенты проводят сравнительный анализ жизнеспособности клеток, растущих на титановой подложке без покрытия, на титановой подложке с Ca-P покрытием и контрольных клеток, растущих на чашке Петри.

По освоенным методикам и результатам измерений студенты готовят письменный отчет о выполненных экспериментах и их результатах.

Методические указания по выполнению эксперимента 1. Выделение и количественный анализ эритробластических островков костного мозга лабораторного животного Методы выделения и культивирования эритробластических островков вне организма были разработаны Ю.М. Захаровым и М. Прена в 1982 г (Ю.М. Захаров, А.Г. Рассохин, 2002).

У животных после эфтаназии извлекают бедренную кость. Мягкие ткани убирают сухой марлевой салфеткой, после чего осторожно отсекают проксимальный конец кости, обнажая костный мозг и вскрывая костномозговой канал. На проксимальный конец кости надевают плотную резиновую трубку, один конец которой соединен с канюлей шприца, содержащего 1 мл среды выделения. Надавливанием на поршень шприца вымывают костный мозг из канала бедренной кости в пробирку.

Состав среды выделения: 100 мл среды содержат 60 мл питательной среды Игла или 199,33 мл 10% раствора альбумина человека, 1мл неразбавленного гепарина с активностью 5000 Ед/мл, 10 000 Ед пенициллина и 10 мг стрептомицина.

Для приготовления суспензии клеток костного мозга выполняют механическую диссоциацию столбиков костномозговой ткани с помощью пипетки Пастера и небольшой резиновой груши. Производят быстрое перемешивание (10-15 раз) через кончик пипетки клеточной взвеси. После пипетирования клеточную взвесь фильтруют через ячейки 0,1 Х 0, мм металлической сетки, освобождаясь при этом от стромальных элементов.

Для выявления эритробластических островков применяют их прижизненную окраску красителем – нейтральным красным. С помощью пипеточного дозатора на часовом стекле смешивают 0,1 мл взвеси клеток костного мозга с равным объемом 0,1% раствора нейтрального красного, приготовленного на физиологическом растворе.

Для подсчета эритробластических островков камеру Горяева заполняют взвесью окрашенных клеток и помещают ее во влажную чашку Петри на 10-20 мин для осаждения эритробластических островков по дну камеры. Эритробластические островки подсчитывают во всех квадратах (225 больших квадратов) при увеличении 200 и полузакрытой шторке конденсора микроскопа. В камере Горяева эритробластические островки выглядят как скопления клеток правильной округлой формы с красным окрашиванием в центре за счет включения нейтрального красного в лизосомы центрального макрофага эритробластического островка.

Расчет абсолютного количества эритробластических островков в костном мозге одной бедренной кости производят по формуле:

где А – число эритробластических островков костного мозга бедренной кости крысы, тыс./бедро;

n – число эритробластических островков в 225 больших квадратах камеры Горяева;

3 – разведение исходной взвеси;

2000 – общий объем полученной взвеси клеток костного мозга, мм3;

0,9 – объем камеры Горяева, мм3;

2. Культивирование эритробластических островков и оценка цитотоксичности биокомпозитного материала Для культивирования эритробластических островков используют «среду № 1» и «среду № 2».

1. сыворотка эмбриона теленка 1. кальципарин 4. среда -МЕМ 5. меркаптоэтанол 10 М (на 1 мл 50 мкл среды № 1) Для выделения эритробластических островков из бедренной кости и дальнейшего их культивирования используют «среду № 1».

С помощью 1 мл «среды № 1» выталкивают костномозговой цилиндр из бедренной кости и готовят взвесь эритробластических островков. Расчет 1мл «среды № 1» на бедренную кость.

Наносят 2 мл «среды № 1» на стеклянную пластинку ( диаметром 12 мм), лежащую на дне чашки Петри (35 мм в диаметре). По поверхности «среды № 1», покрывающей пластинку, наносят по каплям 0,25 мл взвести с эритробластическими островками (содержимое 2 бедренных костей распределяют на 8 чашек Петри).

Чашки Петри инкубируют 30 мин в культивационном шкафу при 370С и содержании 4,5% углекислого газа в атмосфере культиватора.

«Средой № 2» отмывают пластинку с эритробластическими островками от не прилипших к стеклу клеток костного мозга. Для этого стерильным глазным пинцетом удерживают стеклянную пластинку под прямым углом и трехкратно отмывают «средой № 2». Количество всех эритробластических островков на единице площади поверхности пластинки принимают за исходное количество.

Затем вносят пластинки с эритробластическими островками в новую чашку Петри, заполненную 3 мл «среды №1».

Помещают две чашки Петри с культурой эритробластических островков в большую чашку Петри – 3-ю чашку Петри, заполненную бидистиллированной водой, помещают рядом с первыми, не накрывая е крышкой, чтобы поддерживать нужную влажность. Затем закрывают большую чашку Петри крышкой и помещают ее в культиватор.

На различные сроки инкубации пластинки с культурой извлекают, производят фиксацию и окраску препарата, подсчитывают эритробластические островки, относя их к единице площади.

Определение цитотоксичности био композитов «НС титан-Са-Р покрытие» in vitro.

Основополагающим фактором успешного применения любого материала в медицине является предварительное тестирование в условиях in vitro. Как правило, испытания in vivo продолжаются длительный период времени - до нескольких месяцев.

Поэтому проводят предварительное тестирование in vitro, которое определяет примерный уровень биосовместимости и токсичности исследуемого материала. При этом основная цель тестирования in vitro самих образцов – определение токсичности их поверхности, основная цель тестирования экстрактов – определение токсического отклика на продукты растворения материалов в обычных условиях использования.

Биологическое тестирование in vitro образцов биосовместимых материалов и их экстрактов выполняется по аналогичному алгоритму. В качестве отрицательного контроля используется титановая подложка ВТ1-0, с которой было предварительно удалено Са-Р покрытие. В качестве положительного контроля используется интактная клеточная взвесь.

Образцы и экстракты из них культивируются с клетками костного мозга в жидкой «среде №1» 60 минут при температуре среды 37С. Уровень цитотоксичности определяется как процентное соотношение живых клеток к погибшим.

Пример. Предположим, что в результате проведенных исследований установлено, что для биокомпозита «НС титан–Са-Р покрытие» количество выживших клеток в интактной клеточной взвеси (негативный контроль токсичности) составило 95%. В случае титановой подложки (позитивный контроль токсичности) количество выживших клеток находилось на уровне 90 %. Количество выживших клеток при тестировании исследуемых биокомпозитов составило 92,5%. Известно, что показатель выживаемости клеток на уровне 90% для титана является очень высоким по сравнению с другими металлами. Цитотоксичность титана никогда не превышает 20%, в то время как у алюминия и стали показатель цитотоксичности выше 20%.

Таким образом, проведенный тест на цитотоксичность показывает, что исследуемые Са-Р покрытия проявляют удовлетворительные токсикологические свойства. Отсюда мы приходим к выводу, что токсические свойства исследуемого биоматериала «НС титан ВТ1- – Са-Р покрытие» ниже, чем свойства титана, а по сравнению с другими материалами, такими как стальные, алюминиевые и кобальт-хром-молибденовые сплавы, применяемыми в ортопедии, являются наилучшими. Биокомпозит «НС титан с Са-Р покрытиями» не снижают выживаемость клеток костного мозга, не оказывает отрицательного воздействия на биологические процессы, что определяет их высокую биологическую совместимость.

Примерный план отчета о выполнении эксперимента Название, цель и задачи эксперимента Животные: вид, линия, пол, масса, питомник, дата получения.

Исследуемый материал и контроли: название, физико-химические свойства, откуда получен, условия подготовки материала в качестве субстрата.

Анализ литературных данных по исследуемому материалу.

Схема проведения эксперимента.

Условия проведения, методики подготовки и анализа клеток.

Полученные результаты.

В конце отчета делается заключение по цитотоксичности исследуемого материала.

Список цитированной литературы.

Лабораторная работа № 2. Проведение теста на генотоксичность наноматериала с использованием метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод "ДНК-комет") Цель экспериментов Закрепить у студентов теоретические знания по методам изучения свойств наноматериалов через получение практических навыков в использовании методики оценки генотоксичности Задача экспериментов Освоить методику проведения теста на генотоксичность наноматериалов с использованием метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток.

Характер эксперимента: репродуктивный.

Форма организации студентов: групповая.

Время, отводимое на выполнение экспериментальной работы: 4 часа.

Краткие теоретические основы эксперимента Метод гель-электрофореза изолированных клеток или метод «ДНК-комет» основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ. Для получения гель-слайдов используют стандартные предметные стекла, которые покрывают агарозным гелем (0.5-1%). Исследуемые клетки заключают в агарозный гель и наносят на подготовленные гель-слайды. После затвердевания геля клетки подвергают лизису, в процессе которого происходит диссоциация клеточных структур и выпетливание хроматина в поры агарозы. Далее препараты подвергаются щелочной денатурации (рН13), в результате которой щелочно-лабильные сайты в ДНК реализуются в однонитевые разрывы. При электрофорезе, под влиянием электрического поля ДНК в виде фрагментов и петель сверхполимерных молекул мигрирует к аноду, формируя хвост кометы; ядром ее является полость, заполненная ДНК. После завершения щелочного электрофореза слайды нейтрализуют/фиксируют, окрашивают и микроскопируют под флуоресцентным микроскопом. В простейшем варианте с помощью микрометрической линейки измеряют длину кометы, диаметр головы и длину хвоста кометы. Измерения могут быть выполнены непосредственно под микроскопом, с микрофотографий или с сохраненных цифровых изображений. Использование компьютерного анализа цифровых изображений расширяет исследовательские возможности метода. В этом случае могут быть измерены также такие показатели, как общее содержание ДНК в комете, доля материала в голове кометы, доля материала в хвосте кометы. Высокая чувствительность, небольшое количество материала, требуемого для исследования и также применимость практически к любым клеткам, содержащим ДНК, обуславливает широту использования метода «ДНК-комет» для решения разнообразных задач в области генетической токсикологии.

Описанные подходы могут быть использованы при оценке генотоксических свойств не только отдельных химических соединений, но и различных комбинаций соединений, а также физических и биологических факторов, включая наноматериалы при соответствующей модификации схемы проведения экспериментов.

Ход экспериментов Готовят растворы исследуемых и контрольных соединений (наноматериалов).

Составляют схему эксперимента, в которой подбирают и обосновывают способ введения, доза, однократность/многократность введений, временной промежуток от введения до забора биопроб у животных, органы и ткани для анализа. По схеме эксперимента осуществляют введение исследуемых и контрольных соединений в животных, умерщвление их, забор материала для анализа. Из забранного материала выделяют клетки и готовят суспензии клеток. Клетки вводят в агарозу и наносят на предметные стекла. Лизируют клетки на стеклах в агарозе. Проводят электрофорез. Выполняют фиксацию препаратов и их окрашивание. Проводят микроскопический анализ и фотографирование препаратов.

Проводят анализ изображений «ДНК-комет». Обрабатывают результаты анализа. Делают выводы по полученным результатам. Готовят отчет о проделанных экспериментах.

Методические указания по выполнению экспериментов Используемые химические реактивы и соединения Растворители. Исследуемые соединения растворяют в дистиллированной воде или физиологическом растворе. Водонерастворимые соединения вводят с Твином-80 или используют в качестве растворителя 1% раствор этилового спирта или диметилсульфоксида.

Для перорального введения водонерастворимых соединений предпочтительно использовать 1% водную суспензию крахмала или растительное масло (оливковое). Применение иных растворителей допускается только при надлежащем обосновании и при условии отсутствия у них в применяемых концентрациях токсических эффектов и химического взаимодействия с исследуемым соединением. Все растворы и суспензии необходимо готовить непосредственно перед применением.

Контроли. В качестве негативного контроля используют животных, которым вводят растворитель в эквивалентных количествах. Животным позитивного контроля вводят соединение, заведомо обладающее выраженным генотоксическим действием, проявляющимся в большинстве органов и тканей и выявляемым с использованием метода «ДНК-комет». Рекомендуемые соединения: метилметансульфонат (40-80 мг/кг) [CAS №66Л^-нитрозодиметиламин (80-140 мг/кг) [CAS №62-75-9], N-этил-тУ-нитрозомочевина (15-50 мг/кг) [CAS №759-73-9]. По возможности желательно использовать в качестве позитивного контроля генотоксикант, относящийся к тому же классу соединений, что и исследуемое. Количество животных в группе позитивного контроля может быть сокращено до 2-3 при условии наработки в лаборатории экспериментальных данных с используемым генотоксикантом. В виду высокой чувствительности метода все манипуляции (способ введения, время экспозиции, условия содержания до момента забоя и.т.д.) с животными негативного контроля и подопытной группы должны быть идентичными.

Лабораторные животные Эксперименты предпочтительно проводить на мелких лабораторных грызунах мышах или крысах, половозрелых самцах или самках. Не исключено применение других видов животных. Во избежание большого разброса в оцениваемых показателях необходимо использовать генетически однородных животных, отклонение по массе тела и возрасту которых на момент эксперимента не превышает ±10 %. Ни одна из инбредных линий не выделяется как предпочтительная.

Каждая контрольная и подопытная группа должна содержать не менее 5 особей.

Допускается использование 4 животных на группу при увеличении количества анализируемых клеток до 150 на препарат. При наличии на момент исследования данных об отсутствии существенных межполовых различий в токсических эффектах исследуемого соединения эксперименты проводят на животных одного пола. В противном случае исследование следует проводить на животных обоих полов.

Условия эксперимента Способ введения. Способ введения исследуемого соединения должен соответствовать планируемому пути поступления вещества в организм человека. В большинстве случаев используется пероральный способ введения. Оценка генотоксичности может быть проведена при внутрибрюшинном, внутримышечном, подкожном, ингаляционном и накожном способах введения, а также при введении с кормом или питьевой водой. Максимальный одновременный объем вводимого раствора или соответствующего растворителя зависит от массы тела животного и определяется из расчета не более 20 мл/кг при пероральном и внутрибрюшинном введениях, не более 10 мл/кг при внутримышечном и подкожном. За исключением соединений, обладающих раздражающим действием или едких при высоких концентрациях, разница во вводимых объемах растворов для всех используемых доз соединения должна быть минимальна.

Дозы. Адекватный выбор доз исследуемого вещества зависит от многих составляющих и не может быть однозначно алгоритмизирован. Наиболее типичны две ситуации.

Первая предполагает отсутствие каких либо сведений, характеризующих токсические эффекты изучаемого соединения и количественные характеристики его потребления человеком. В этом случае, исследование начинают с определения острой токсичности. После определения LD50 соединение испытывается в трех дозах при однократном введении: в наивысшей дозе, соответствующей 1/10 - 1/5 LD50, и более низких дозах с десятикратным интервалом между ними. В том случае, если токсичность исследуемого соединения настолько мала, что дозу LD50 невозможно определить по техническим причинам, в качестве максимальной дозы определяется 2000 мг/кг.

Вторая ситуация типична для соединений с установленной суточной дозой или величиной суточного потребления человеком. Они исследуются в трех дозах: первая определяется исходя из расчета суточной дозы для человека, пересчитанной на поверхность тела экспериментального животного, вторая составляет 10х, третья 0,1х от первой. Для фармакологических средств рекомендуется использовать дозы, соответствующие ED50, 10 и 100ED50, но не выше 1/2 LD50; для пищевых соединений дозы, соответствующие ДСП (допустимое суточное потребление), 0,1 и 10 ДСП, но не выше 1/ Повторность введения. Приемлемыми признаны схемы экспериментов с однократным и многократным введением исследуемого соединения. Эксперименты проводят при однократном введении исследуемого соединения с забоем животных через 3-6 часов и 20-24 часов после введения. Более короткая экспозиция (3 ч.) оправдана для нестабильных, быстро абсорбируемых и метаболизируемых соединений, более длительная экспозиция ( ч.) - для соединений, требующих большего времени для биотрансформации. При получении позитивного результата при одном из сроков экспозиции эксперименты далее не проводятся.

Целью многократного введения может явиться оценка генотоксического действия соединений, обладающих кумулятивным эффектом. В этом случае исследуемое соединение вводится ежедневно в течение 7-14 дней с забоем животных через 3-6 часов после последнего введения.

Выбор органов и тканей для анализа. При выборе органов/тканей для анализа в первую очередь необходимо ориентироваться на данные о токсикокинетических и токсикодинамических свойствах исследуемого соединения, а также структурное сходство соединения с известными генотоксикантами. При отсутствии таких данных анализ рекомендуется проводить в следующих органах/тканях: а) в печени, являющейся основным органом биотрансформации ксенобиотиков и высокочувствительной к действию генотоксикантов; б) в костном мозге, являющемся активно пролиферирующей тканью, клетки которой находятся на разных стадиях клеточного цикла; в) в толстой кишке - органемишени для веществ и/или их метаболитов, выводимых из организма через желудочнокишечный тракт; г) в мочевом пузыре — органе, в котором ксенобиотики и/или их метаболиты задерживаются перед выведением из организма и могут подвергаться биотрансформации. По литературным данным, из изученных на сегодняшний день методом «ДНК-комет» генотоксикантов, около 73% проявляют генотоксическое действие в печени, 96% - в печени и/или толстой кишке, и во всех случаях ДНК-повреждения выявились в одном из четырех перечисленных выше органов.

Выделение клеток Выделение клеток является одним из ключевых моментов при методе «ДНК-комет»

в экспериментах in vivo. На сегодняшний день разработано множество методик получения изолированных клеток органов и тканей млекопитающих, ряд из которых нашли применение в методе «ДНК-комет», такие как, метод ферментативной обработки протеазами (трипсин и/или коллагеназа), механической дезагрегации тканей, сепарации на мембранах или гомогенизации. По литературным данным, метод выделения клеток не оказывает значимого влияния на показатели при оценке спонтанного уровня ДНК-повреждений. Вместе с тем, следует принимать во внимание, что длительные манипуляции с изолированными клетками могут приводить к искажению результатов вследствие продолжающихся в клетках процессов, в частности, ДНК-репарации. Исходя из этого, рекомендуется использовать методы выделения клеток, требующие минимального времени, но вместе с тем позволяющие получать приемлемой чистоты клеточные суспензии. Ниже приведено описание методики для различных органов/тканей, апробированной и длительно применяющейся в нашей лаборатории:

Методом цервикальной дислокации умерщвляют животное, вскрывают и по возможности быстро выделяют анализируемые органы/ткани.

Печень, почки, легкие и головной мозг (150-200 мг ткани) измельчают на льду, переносят в стеклянные пробирки с 3 мл охлажденного до 4°С фосфатно-солевого буфера [рН 7.5], содержащего 20 mM EDTA-Na2 и 10% ДМСО (ФСБ+), дважды отмывают от клеток крови и раздавливают стеклянной палочкой в свежем буфере. Пробирки выдерживают 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов ткани, после чего 1.5 мл верхнего слоя переносят в микроцентрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут. Супернатант удаляют, осадок клеток разводят в 1 мл охлажденного буфера.

Бедренные кости очищают от мышц, срезают эпифизы и вымывают клетки костного мозга 3 мл (по 1.5 мл на кость) того же буфера. 1.5 мл суспензии клеток переносят в 1000 g в течение 10 мин. Супернатант удаляют, осадок клеток разводят в 1 мл охлажденного ФСБ+.

Органы желудочно-кишечного тракта (пищевод, преджелудок, желудок, тонкая и толстая кишка) выворачивают слизистой оболочкой наружу и тщательно промывают в охлажденном ФСБ+. Образцы помещают на лед, аккуратно разрезают вдоль, соскабливают скальпелем слизистую, переносят в пробирку с 1.5 мл буфера и гомогенизируют. Гомогенат центрифугируют при 1000 g 10 минут, супернатант удаляют и осадок ресуспендируют в 1. мл ФСБ+. Центрифугирование повторяют, после удаления супернатанта осадок ресуспендируют в 500 мкл буфера.

Мочевой пузырь вскрывают, промывают в ФСБ+, гомогенизируют в 0.5 мл того же буфера, центрифугируют при 1000 g 10 минут, супернатант удаляют и осадок ресуспендируют в 250 мкл буфера.

С семенников удаляют оболочку, выделяют семенные канальцы и промывают их в 5 мл 50 мМ цитратного буфера [рН 5.0]. Буфер удаляют, семенные канальцы измельчают изогнутой препаровальной иглой в 3 мл свежего буфера и интенсивно встряхивают. Пробирки выдерживают 5 мин при комнатной температуре для осаждения крупных фрагментов семенных канальцев, после чего верхний слой жидкости переносят в микроцентрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут.

Супернатант удаляют, осадок клеток разводят в 1 мл охлажденного ФСБ+.

Клеточные суспензии доводят до конечной концентрации клеток 1-5x10 /мл и до получения микропрепаратов помещают на холод.

Гель-электрофорез изолированных клеток Лизирующий раствор. Готовится основной лизирующий раствор - 10 тМ TrisHCl[pH 10], 2.5 М Nad, 100 тМ EDTA-Na2. Раствор храниться при комнатной температуре в течение 1 месяца. Непосредственно в день эксперимента (забоя животных) готовится рабочий лизирующий раствор путем добавления к основному лизирующему раствору Triton X-100 и ДМСО до конечных концентраций 1 и 0%, соответственно. Готовый раствор перед использованием охлаждают в холодильнике до 4 С.

Раствор для электрофореза. Готовятся основные 10 М раствор NaOH (раствор А) и 200 тМ раствор EDTA-Na2 (раствор Б). Растворы хранятся при комнатной температуре в течение 2 месяцев. Непосредственно в день эксперимента готовится рабочий раствор для электрофореза - 300 mM NaOH, 1 тМ EDTA-Na2, (pH13). Для этого, в 2-х литровую бутылку с узкимгорлышком налить 500 мл бидистиллированной воды, добавить 100 мл раствора для электрофореза А и 10 мл раствора для электрофореза Б. Добавить бидистиллированной воды до конечного объема 2 литра (необходимый объем зависит от используемого аппарата для электрофореза). Готовый раствор перед применением охлаждают до 4 С.

Раствор для фиксации. Непосредственно перед применением готовится 70% раствора этилового спирта.

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

Используются традиционно применяемые в световой микроскопии предметные стекла с шероховатой на Ул поверхностью. Во избежание искажений фона флуоресценции не рекомендуется использование полностью шероховатых стекол.

В стеклянный флакон с 10 мл бидистиллированной воды вносят 100 мг универсальной агарозы (Тпп65 С). Флакон с агарозой ставят в химический стакан на 50 мл, в который наливают дистиллированную воду так, чтобы она наполовину закрывала агарозный раствор.

Взвесь помещают в микроволновую печь и нагревают при мощности 150 W, в течение 2 минут 30 секунд. При этом раствор не должен кипеть. Прозрачность полученного агарозного геля контролируют на свету - гель должен быть полностью прозрачным. Если видны мутные полосы, то растворение проводят еще раз в течение 20 секунд при 150 W. При необходимости 20 секундное растворение повторяют. При отсутствии микроволновой печи растворение агарозы проводят в водяной бане, аналогично контролируя процесс растворения агарозы.

На поверхность плитки, нагретой до 65 С, кладут предметные стекла так, чтобы вся не шероховатая поверхность находилась на поверхности плитки. На плитку также ставят флакон с агарозным гелем.

150 мкл агарозного геля дозатором наносят на край стекла противоположный шероховатому. Наконечником дозатора плашмя растягивают гель по всей не шероховатой поверхности и на 3-5 мм по шероховатой. Обязательно контролируют полное заполнение всей поверхности агарозой. Не допускается образование пузырей. На каждое стекло используется новый наконечник для дозатора.

Предметные стекла с агарозой кладут плашмя на плоский планшет с выступами.

После затвердевания агарозы (1-2 часа) на шероховатой поверхности делается пометка (только грифельным карандашом) для запоминания локализации слоя агарозы. Предметные стекла могут храниться до использования в течение 1 месяца при комнатной температуре.

Готовится 1% раствор легкоплавкой агарозы (Т1Ш42 С) в ФСБ аналогично Полученный гель разливают на аликвоты по 240 мкл в микроцентрифужные пробирки, помещенные в микротермостат при 42 С.

На подготовленные предметные стекла с агарозой грифельным карандашом по шероховатой поверхности наносится шифр. Стекла раскладывают на плитке с нагретой до С поверхностью.

В микроцентрифужные пробирки с агарозным гелем вносят 60 мкл клеточной суспензии и два раза прокачивают дозатором.

В центральную часть нагретого на плитке предметного стекла наносят 60 мкл полученного агарозного геля с клетками и накрывают покровным стеклом под углом, так, чтобы не было пузырей.

Предметные стекла кладут на поверхность емкости со льдом и оставляют на 10 мин для затвердевания геля.

Аккуратно снимают покровные стекла (тянут за край) и предметные стекла помещают в стеклянную кювету (тип Шиффендеккер).

Далее все манипуляции проводят только в затемненном помещении при свете желтой или зеленой лампы.

В кювету с предметными стеклами заливают предварительно охлажденный до 4°С лизирующий раствор, накрывают кювету фольгой и помещают в холодильник. Проводят лизис не менее 1 часа. Допускается нахождение препаратов в лизирующем растворе до часов.

По окончанию лизиса стекла вынимают из раствора, дают стечь жидкости под углом. Бумажной салфеткой вытирают нерабочую поверхность (без агарозы).

Предметные стекла раскладывают на поверхности камеры для горизонтального электрофореза. Стекла должны лежать точно перпендикулярно краю емкости шероховатым краем в сторону минуса, не шероховатым - плюса.

В камеру заливают раствор для электрофореза. Сначала в углубление емкости около минуса, потом около плюса и далее медленно оставшуюся, пока раствор не покроет предметные стекла на 2-3 мм. Стекла не должны изменить положение при внесении жидкости для электрофореза, в случае поворота их поправляют пинцетом.

Микропрепараты оставляют на 20 мин без включенного аппарата для электрофореза.

Проводят электрофорез в течение 20 мин при напряженности поля 1 V/cm и -300 тА.

Параметры электрофореза регулируются добавлением или удалением электрофорезного раствора при включенном аппарате.

По окончанию электрофореза химическим стаканом удаляют из углублений камеры большую часть раствора для электрофореза, так, чтобы показались стекла. Пинцетом вытаскивают стекла, дают стечь жидкости под углом. Протирают бумажной салфеткой нерабочую поверхность.

Стекла помещают в стеклянную кювету и заливают раствором для фиксации.

Проводят фиксацию в течение 15 минут.

Микропрепараты высушивают при комнатной температуре (1-2 часа) и хранят до анализа в сухом темном месте в течение не более 2-4 месяцев.

г. Окрашивание и микроскопический анализ Окрашивание микропрепаратов. Традиционно, для окраски микропрепаратов «ДНКкомет» используют флуоресцирующие красители, применяемые при визуализации ДНК этидиум бромид или пропидиум иодид, реже - 4,6-диамидино-2-дифенилиндол (ДАФИ), SYBR Creen I, YOYO-1 или акридиновый оранжевый. Использование последнего предпочтительнее, поскольку акридиновый оранжевый, в отличие от остальных красителей, имеет одинаковое сродство как к двухцепочечнои (желто-зеленая флуоресценция), так и к одноцепочечной ДНК (красная флуоресценция), представленной главным образом в хвосте «ДНК-комет», что увеличивает точность и воспроизводимость анализа. Рутинно, мы окрашиваем микропрепараты с использованием акридинового оранжевого по следующей методике:

Готовят стоковый раствор акридинового оранжевого концентрацией 200 мкг/мл на бидистиллированной воде. Раствор стабилен в течение 2 месяцев при хранении в темном прохладном месте.

Непосредственно перед окрашиванием готовят рабочий раствор красителя. Для этого 100 мкл стокового раствора красителя смешивают с 900 мкл 50 тМ ацетатного буфера, [рН 4.5]. Рабочий раствор красителя хранится в защищенном от света месте.

Микропрепараты погружают в стеклянный стакан с ацетатным буфером приблизительно на 20 секунд. Дают стечь жидкости под углом, промокают края микропрепарата о бумажные салфетки и протирают нерабочую поверхность.

60 мкл рабочего раствора красителя наносят на микропрепарат и покрывают покровным стеклом и содержат в горизонтальном положении в затемненном месте в течение 30 минут.

Покровные стекла удаляют, микропрепараты промывают в дистиллированной воде и микроскопируют в течение не более 24 часов.

Микроскопический анализ. Микропрепараты анализируют на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами (для акридинового оранжевого: возбуждающий фильтр 490 нм, дихроичное зеркало 510, отсекающий фильтр 530 нм). Рекомендуемое увеличение 200х-400х. Перед проведением анализа микропрепараты шифруют двойным слепым методом. На каждый микропрепарат рандомизированно анализируют не менее 100 «ДНК-комет» без наложений хвостов. В анализ не включают апоптотические клетки, выявляемые на микропрепаратах в виде слабо флуоресцирующих «ДНК-комет» с широким диффузным «хвостом» и практически отсутствующей «головой», так называемые «ежики».

В зависимости от технических возможностей экспериментатора анализ «ДНКкомет» может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.

При визуальном анализе «ДНК-кометы» ранжируются на пять условных типов (рис.1) с соответствующим для каждого числовым значением от 0 до 4. Степень поврежденности ДНК при этом выражается как индекс «ДНК-комет» (Идк), определяемый по формуле:

где n0 – n4 - число «ДНК-комет» каждого типа, S - сумма подсчитанных «ДНК-комет».

Программно-аппаратный комплекс включает совмещенную с микроскопом высокочувствительную CCD-камеру и специализированное программное обеспечение, что позволяет проводить цифровую регистрацию и обработку параметров «ДНК-комет», характеризующих целостность структуры ДНК - длину «кометы», длину хвоста, диаметр головы, процентное содержание ДНК в голове или хвосте (%ДНК) и.т.д. (рис.2). На сегодняшний день разработано около десятка программ для анализа «ДНК-комет», несколько из которых находятся в свободном доступе. В зависимости от имеющегося программного обеспечения анализ параметров «ДНК-комет» проводится в режиме «реального времени» либо с сохраненных цифровых изображений. В качестве показателя поврежденности ДНК чаще всего используют длину «хвоста», «%ДНК в хвосте» или их произведение - так называемый «момент хвоста» (tail moment). Принимая во внимание, что показатель длины хвоста «ДНК-комет» в значительной степени может зависеть от экспериментальных условий (плотность агарозы, напряженность электрического поля, температура форезного буфера и.т.д.), для повышения воспроизводимости результатов, а также возможности сопоставления данных между экспериментаторами и лабораториями, мы рекомендуем использовать при оценке ДНК-повреждений показатель «%ДНК в хвосте».

Оценка результатов Статистическую оценку результатов проводят по каждому органу путем сравнения среднегрупповых показателей поврежденности ДНК в опытной и контрольной группах с использованием непараметрических критерия Даннета («% ДНК в хвосте», «момент хвоста», «длина хвоста») или критерия Краскела-Уоллиса (индекс «ДНК-комет»). Критериями положительного результата являются статистически достоверное, дозозависимое увеличение показателя поврежденности ДНК при одном из сроков экспозиции или статистически достоверный, воспроизводимый эффект по-крайней мере для одной экспериментальной точки. Полученный положительный результат свидетельствует о том, что исследуемое соединение проявляет in vivo генотокеичеекое действие в данном органе-мишени.

По литературным данным метод «ДНК-комет» дает, как правило, четкие положительные или отрицательные результаты. При получении неоднозначно трактуемых результатов следует обратить внимание на возможный цитотоксический эффект соединения, свидетельством которого является бимодальное распределение «ДНК-комет» с низкой и высокой степенью поврежденности ДНК. Кроме того, результаты исследования могут считаться неоднозначными при выявлении генотоксического эффекта соединения в низкой дозе при отсутствии такового в более высоких дозах. В этих случаях исследование необходимо повторить, с параллельной оценкой цитотоксичности соединения.

При получении положительных результатов рекомендуется оценить также органо- и тканеспецифичность ДНК-повреждающего действия соединения, сопоставляя следующие параметры по каждому органу:

наличие или отсутствие ДНК-повреждающего эффекта минимальная действующая доза наличие и характер дозозависимого эффекта степень превышения эффекта в опытной группе над контрольной Примерный план отчета о выполнении эксперимента Название, цель и задачи эксперимента Животные: вид, линия, пол, масса, питомник, дата получения, количество Вещество: название, формула, № по CAS, физико-химические свойства, откуда получено, чистота, растворитель, позитивный контроль.

Анализ литературных данных по исследуемому веществу Схема проведения эксперимента: путь введения дозы, обоснование выбора доз, длительность, кратность введения, группы.

Условия проведения методики и анализа микропрепаратов.

Полученные результаты Результаты исследований документируются согласно таблице 1.

Результаты оценки ДНК-повреждающей активности соединения методом гельэлектрофореза изолированных клеток на млекопитающих in vivo эксперимента животног но клеток (%ДНК, индекс показатель значимост При обнаружении генотоксичности в отчете представлются также выводы по органо- и тканеспецифичности ДНК-повреждающего действия соединения с сопоставлением следующих параметров по каждому органу:

наличие или отсутствие ДНК-повреждающего эффекта;

минимальная действующая доза;

наличие и характер дозозависимого эффекта;

степень превышения эффекта в опытной группе над контрольной.

В конце отчета делается заключение по соединению.

Список цитированной литературы.

2. ДИСЦИПЛИНА «МОЛЕКУЛЯРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ НАНО- И

БИОСТРУКТУР»

Эксперименты, проводимые на специализированном учебно-научном оборудовании, по дисциплине «Молекулярное моделирование нано- и биоструктур» выполняются в рамках двух лабораторных работ «Молекулярная динамика наноструктур» и «Молекулярная динамика пептида (RRWRRWWRRWWRRWRR) в явно заданном растворителе (воде) в присутствии отрицательно заряженных противоионов (Cl-)» и одного практикума «Моделирование взаимодействия сигнальных пептидов с мембранами».

Комплект специализированного оборудования для этих лабораторных работ и практикума включает в себя:

(1) рабочие места на основе персональных компьютеров, объединенных в сеть, и набор специального программного обеспечения в составе пакет программ GROMACS, пакет программ HyperChem и пакет программ PUMA.

(2) При выполнении практикума помимо компьютера-рабочего места необходимы компьютера для проведения расчетов по управляемой молекулярной динамике (в расчете на одного студента).

Лабораторная работа № 1. Молекулярная динамика наноструктур Цель экспериментов Практическое освоение студентами современных методов молекулярного моделирования на примере нового направления - исследования взаимодействий наноструктур с биологическими объектами.

Задачи экспериментов 1. Сборка исследуемых структур с помощью программы HyperChem.

2. Сборка молекулярных систем, состоящих из пептида и нанотрубки.

3. Перевод молекулярных систем в формат программы PUMA и запуск расчта молекулярной динамики.

4. Визуализация результатов численного эксперимента и их обработка.

Характер экспериментов: репродуктивный.

Форма организации студентов: индивидуальная.

Время, отводимое на выполнение экспериментальной работы: 6 часов.

Ход экспериментов При подготовке к лабораторной работе студенты повторяют теоретический материал по следующим разделам: основы метода молекулярной динамики; классические уравнения движения Ньютона; приближение межатомных взаимодействий в методе молекулярной динамики; численное интегрирование уравнений движения; статистический характер молекулярной подвижности. Студенты самостоятельно знакомятся с литературой (научные журналы, интернет) по темам: нанотрубки и другие нанообъекты; их разновидности, физико-химические свойства, способы синтеза; применение нанотрубок в биологии, перспективы использования нанотрубок для направленной доставки лекарств.

В ходе экспериментов студенты осуществляют сборку компьютерной модели нанотрубок с помощью программного пакета HyperChem. Затем осуществляется сборка молекулярных систем, включающих нанотрубки и биологические молекулы. Собранные системы переводят в формат программы молекулярной динамики PUMA и запускают расчт молекулярной динамики. Проводят обработку и визуализацию результатов этого расчта.

Запускают второй расчт молекулярной динамики. Проводят обработку и визуализацию результатов этого расчта. Обрабатывают результаты численного эксперимента.

Методические указания по выполнению экспериментов Сборка исследуемых структур с помощью программы HyperChem.

Собрать нанотрубку из 630 атомов углерода, обладающую хиральностью (10, 10) и закрытую с одного конца. В файле ntb.ent содержится нанотрубка, открытая с обеих концов.

Этот файл следует открыть в программе HyperChem и с помощью инструмента Draw дорисовать наконечник в форме половинки футбольного мяча (все иллюстрации, поясняющие выполнение задачи приведены в полном тексте лабораторной работы). После сборки необходимо отрелаксировать структуру. Для этого следует выбрать пункт меню ComputeGeometry Optimization и нажать OK, после чего произойдт автоматическая минимизация энергии. После релаксации структуры нанотрубка должна иметь диаметр около 13,5 ангстрем и длину около 38 ангстрем. Эту и последующие молекулярные системы сохранить в виде файлов PDB (расширение *.ent).

Собрать в отдельном файле полипептид из 15 остатков аланина в форме альфаспирали. Для этого следует выбрать пункт меню DatabasesAmino Acids и в появившемся окне задать соответствующую последовательность. Далее, в численном эксперименте будет исследоваться взаимодействие собранного пептида с нанотрубкой.

Сборка молекулярных систем, состоящих из пептида и нанотрубки Собрать системы, содержащие пептид и нанотрубку в различном положении:

пептид внутри нанотрубки, пептид сбоку нанотрубки, пептид на большом расстоянии ( ангстрем) от нанотрубки, пептид вблизи открытого конца нанотрубки. Последняя система будет исследоваться на возможность самопроизвольного встраивания пептида в нанотрубку.

Расчты распределяются между студентами так, чтобы каждый студент проводил два расчта. Чтобы объединить нанотрубку и пептид в одну систему, следует открыть файл с нанотрубкой, выбрать пункт меню FileMerge и в появившемся окне открыть файл с пептидом. В получившейся системе выделить нанотрубку с помощью инструмента Select и переместить е в требуемое положение относительно пептида с помощью инструментов перемещения (Translate, Rotate in-plane, Rotate out-of-plane).

Перевод молекулярных систем в формат программы PUMA Для осуществления расчта молекулярной динамики применяется программа PUMA. Эта программа работает в консольном режиме, она реализует численное интегрирование классических уравнений движения методом Верле с использованием силового поля AMBER. На е вход податся файл молекулярной системы в е собственном формате с расширением *.fi. Для перевода файлов PDB в файлы FI используется программа predmd.exe, входящая в пакет PUMA. Используя эту программу, перевести все собранные молекулярные системы в формат FI. Имена входного и выходного файлов задаются в текстовом файле predmd.nam. При необходимости внести описания новых остатков в файл с расширением *.ste.

Запуск расчта молекулярной динамики В зависимости от версии исполняемый файл пакета молекулярной динамики PUMA может называться по-разному, например, e303bt10.exe. Файл параметров молекулярной динамики называется 100e3.nam. В нм следует указать следующие параметры:

Шаг интегирования – 0.001 пс.

Длина траектории – 1000000 шагов.

Термостат – столкновительный, масса виртуальных частиц 1 а. е. м., частота столкновений – 10/пс/атом.

Баростат отсутствует, размер периодической ячейки 100*100*100 ангстрем.

Радиус обрезания взаимодействий – 16 ангстрем.

При запуске программа PUMA требует, чтобы пользователь ввл число, следует ввести 0. В ходе работы на экране отображаются значения текущих характеристик системы, таких, как температура, давление, энергия. Выход из программы осуществляется клавишей Q. При нажатии клавиши H на экране отображается молекулярная система. В результате работы программы генерируются два текстовых файла: файл траектории 100trj.fi и файл статистики 100ww.txt.

Визуализация результатов численного эксперимента Перевести полученный в расчте файл траектории (100trj.fi) в формат DCD, для чего в командной строке ввести:

fi2dcd.exe 100trj.fi 100trj.dcd При выполнении этой команды программа fi2dcd.exe переводит траекторию в файл 100trj.dcd. В программе VMD выбрать FileLoad и в появившемся окне загрузить PDB-файл и соответствующий DCD-файл, после чего на экране должна отобразиться молекулярная система и последовательность е состояний во времени. Установить, произошло ли заметное изменение конформации, в частности, встраивание в пептида нанотрубку, в различных системах.

Обработка результатов численного эксперимента На основании данных из файла траектории вычислить разность энергий, соответствующую различным взаимным положениям нанотрубки и пептида.

С помощью программы trj_angle.exe получить из файла траектории значения торсионных углов в полипептиде, находящемся в вакууме и внутри нанотрубки. Для этого ввести следующую команду:

trj_angle.exe 100trj.fi phi.txt phi.dat, где phi.txt – файл с номерами атомов, составляющими торсионные углы, phi.dat – выходной файл с последовательностью значений торсионных углов во времени. Файл phi.txt должен представлять собой список номеров атомов, составляющих торсионный угол:

, соответственно получить два файла с последовательностью углов.

В программе Matlab построить карты Рамачандрана для полученных углов и графики автокорреляционных функций для каждого угла. Для этого ввести в командную строку программы Matlab следующие команды:

phi=load(phi.dat‘);

psi=load(psi.dat‘);

plot_autocorfs(phi, 100);

plot_autocorfs(psi, 100);

plot_ramachandran(phi, psi, 90);

Для функции plot_autocorfs необходимо указать количество шагов, по которым будет рассчитываться автокорреляционная функция (100), для функции plot_ramachandran необходимо указать разрешение вычисляемой карты (90).

На основании полученных результатов сделать вывод о влиянии нанотрубки на конформационные и динамические свойства полипептида.

Примерный план отчета о выполнении экспериментов Название, цель и задачи эксперимента.

Краткий обзор литературы (реферат) по теме: нанотрубки и другие нанообъекты; их разновидности, физико-химические свойства, способы синтеза; применение нанотрубок в биологии, перспективы использования нанотрубок для направленной доставки лекарств.

Представить рисунки с изображениями собранных молекулярных систем (нанотрубка, пептид).

Представить результаты визуализации численного эксперимента по взаимодействию нанотрубки с пептидом, проанализировать произошло ли заметное изменение конформации, в частности, встраивание в пептида нанотрубку, в различных системах.

Представить результаты вычисления разности энергий, соответствующих различным взаимным положениям нанотрубки и пептида. Сделать выводы по этим результатам.

Представить построенные карты Рамачандрана для полученных углов и графики автокорреляционных функций для каждого угла пептида. На основании полученных результатов сделать вывод о влиянии нанотрубки на конформационные и динамические свойства полипептида.

В конце отчета делается общее заключение по проделанным экспериментам.

Список цитированной литературы.

Лабораторная работа № 2. Молекулярная динамика (МД) пептида (RRWRRWWRRWWRRWRR) в явно заданном растворителе (воде) в присутствии отрицательно заряженных противоионов (Cl-) Цель экспериментов Практическое освоение студентами основ современных компьютерных методов расчета молекулярной динамики (МД) биологических молекул.

Задачи экспериментов Изучение методами МД структурно-динамических свойств (подвижность аминокислотных остатков, стабильность пространственной структуры) модельного пептида в явно заданном растворителе (вода).

Характер экспериментов: репродуктивный.

Форма организации студентов: групповая.

Время, отводимое на выполнение экспериментальной работы: 6 часов.

Краткие теоретические основы экспериментов Пространственная структура и механизмы функционирования белков существенно зависят от влияния среды. Во многих случаях именно эффекты окружения определяют нативную конформацию и биологическую активность белков. В то же время современные экспериментальные методы структурного анализа дают лишь статическую (рентгеноструктурный анализ, электронная микроскопия) или усредненную по ансамблю (спектроскопия ЯМР) картину конформационных состояний белков. Это затрудняет исследование деталей структурных изменений, происходящих в процессе осуществления белками их биологических функций.

Решение многих из указанных проблем может быть достигнуто с помощью методов компьютерного моделирования – молекулярной динамики (МД), Монте-Карло (МК) и др. В компьютерных экспериментах можно моделировать поведение систем белок-среда на достаточно протяженной временной шкале, причем некоторые из получаемых в расчетах важнейших структурно-функциональных параметров (например, термодинамика конформационных переходов и ионного транспорта, структура промежуточных состояний в процессе функционирования и т.д.) не могут быть получены экспериментально. Результаты моделирования эффективно используют как для интерпретации экспериментальных данных, так и для уточнения параметров моделей. Основными трудностями при этом являются корректный учет взаимодействий внутри белковой молекулы и эффектов среды, ограничения в размере молекулярных систем и временной шкалы моделирования (в случае МД), значительные вычислительные затраты.

Ход экспериментов При подготовке к лабораторной работе студенты повторяют теоретический материал по следующим разделам: основы метода МД, классические уравнения движения Ньютона, использование методов эмпирических силовых полей для расчета потенциальной энергии молекулярной системы, численное интегрирование уравнений движения, термодинамические ансамбли, алгоритмы поддержания постоянной температуры (термостаты) и давления (баростаты), применение периодических граничных условий, ограничения метода МД, принципы структурной организации белковой молекулы, основные элементы вторичной структуры белков, конформационные переходы в белковой молекуле, влияние растворителя на структурно-динамические свойства полипептидной цепи и их исследование с помощью экспериментальных методик, характер получаемой информации, ограничения.

В ходе экспериментов студенты осуществляют конструирование модельного пептида в -спиральной конформации, совершенствуя свои навыки работы в молекулярном редакторе (например, MOLMOL, HyperChem). Затем выполняют отнесение параметров силового поля для молекулы пептида. Помещают пептид в ячейку, заполненную явно заданными молекулами воды. Добавляют необходимое число ионов для нейтрализации заряда молекулярной системы. Выполняют подготовительный этап молекулярной динамики.

Минимизируют энергию молекулярной системы, «нагревают» систему до заданной температуры. Запускают длительный расчет молекулярной динамики. Обрабатывают траектории молекулярной динамики. Получают данные о подвижности аминокислотных остатков, эволюции конформации пептида в ходе молекулярной динамики, проводят оценку взаимодействия пептида с растворителем. Оформляют полученные результаты и готовят отчет о выполненной работе.

Методические указания по выполнению экспериментов Конструирование модельного пептида в -спиральной конформации в молекулярном редакторе (например, HyperChem).

Необходимо сконструировать модель пространственной структуры короткого пептида, имеюшего заданную аминокислотную последовательность. Для нескольких групп, выполняющих данную лабораторную работу, необходимо выбрать одну из предложенных:

RQIKIWFQNRRMKWKK, RQIKIFFQNRRMKFKK и впоследствии сравнить результаты моделирования. Ход работы зависит от молекулярного редактора, установленного на персональном компьютере (например, MOLMOL, HyperChem и др.). Открыть молекулярный редактор. В меню выбрать инструмент добавления аминокислотных остатков из базы данных структурных фрагментов. Аминокислотная последовательность: RRWRRWWRRWWRRWRR.

Для добавляемых остатков задать конформацию -спирали (значения двугранных углов и :

-57° и -47°, соответственно). Обратить внимание на зарядовое состояние остатков, включая концевые. Поскольку планируется исследовать поведение пептида при рН 7, указанные остатки и концевые группы должны иметь соответствующее состояние ионизации. Сохранить полученную структуру в файле формата PDB (pep.pdb).

Отнесение параметров силового поля для молекулы пептида Этот этап, как и все последующие этапы работы, связанные с пакетом GROMACS, выполняют в терминале Linux. Открыть Linux-терминал. В рабочую папку поместить PDBфайл со структурой исследуемого пептида (pep.pdb), а также файлы параметров расчетов (em.mdp – параметры минимизации, heat.mdp – параметры «нагревания», md.mdp – параметры расчета МД). Для отнесения параметров силового поля молекуле пептида и для перевода структурного файла в формат пакета GROMACS (*.gro) используется утилита pdb2gmx (для получения справки по любой утилите GROMACS необходимо ввести в строке терминала команду: имя утилиты -h). В командной строке терминала необходимо ввести команду:

pdb2gmx -f pep.pdb -o pep.gro -p sys.top –ignh -missing При запуске утилиты пользователю из предложенного списка следует выбрать силовое поле, параметры которого будут отнесены молекуле, – GROMOS87 («gmx Gromacs Forcefield (a modified GROMOS87, see manual)»). После выполнения утилиты в рабочей папке появятся файлы sys.top, pep.gro, которые будут использованы в дальнейшей работе.

Помещение пептида в ячейку, заполненную явно заданными молекулами воды. Добавление необходимого количества ионов для нейтрализации заряда молекулярной системы.

Для помещения молекулярной системы в ячейку заданного размера (4x4x4 нм3) используют утилиту editconf. В командной строке необходимо ввести:

Ячейку с пептидом заполняют молекулами воды (SPC модель). Для этого используют утилиту genbox:

После выполнения команды в окне терминала появится информация о добавленных молекулах воды. Необходимо зафиксировать число добавленных молекул (Nsol). С помощью редактора молекулярной графики – VMD (бесплатная программа, доступная через сеть Интернет), можно визуализовать моделируемую ячейку. Для этого необходимо набрать:

В файл «топологии» системы (*.top), содержащий параметры силового поля для всех моделируемых молекул системы, необходимо внести информацию о добавленных в ячейку молекулах воды. С помощью текстового редактора (vi, gedit) необходимо открыть файл sys.top. В секцию «[ system ]» добавить строку «SOL Nsol» (после строки «Protein 1»), где Nsol – число молекул воды, добавленных с помощью genbox. Сохранить измененный файл.

Нейтрализация системы (добавление необходимого числа ионов противоположного заряду системы знака) выполняется с помощью утилиты genion. Предварительно необходимо подготовить файл addions.tpr, используя утилиту grompp:

grompp –f em.mdp –p sys.top -c box2.gro –o addions.tpr Молекулы предложенных пептидов содержат 7 положительно заряженных остатков, поэтому для нейтрализации заряда системы необходимо добавить 7 отрицательных зарядов – 7 ионов Cl-.

При запуске утилиты пользователю из предложенного списка необходимо выбрать молекулы, которые будут замещены на ионы Cl- (вода, SOL). После выполнения процедуры необходимо изменить в файле «топологии» число молекул воды и внести информацию о добавленных ионах («CL- 7»).

Подготовительный этап МД. Минимизация энергии молекулярной системы, «нагревание» до заданной температуры.

Минимизацию энергии молекул и расчет их МД проводят с помощью утилиты mdrun.

Минимизация энергии (методом наискорейшего спуска). Подготовить файл em.tpr:

grompp –f em.mdp –p sys.top -c box3.gro –o em.tpr Запуск минимизации энергии:

В результате расчета конфигурация системы с минимизированной энергией будет записана в файл em.gro.

Нагрев системы (в течение 60 пс). В основе данной процедуры лежит расчет кратковременной МД с линейно возрастающей температурой в системе (скорости атомов):

от 5 K до заданной температуры (300 K). Этот этап необходим для избежания артефактной дестабилизации структуры белка на начальном этапе МД. Подготовить файл heat.tpr, используя параметры нагревания (heat.mdp) и оптимизированную конформацию системы (em.gro):

grompp –f heat.mdp –p sys.top -c em.gro –o heat.tpr В итоге расчета «нагретая» конформация и скорости всех атомов системы, соответствующие заданной температуре, будут записаны в файл heat.gro.

Запуск длительных расчетов МД Расчет МД проводится в изотермическом-изобарическом ансамбле (NPT, P=1 атм, T=300K) c использованием термостата и баростата Берендсена. Длительность расчета траектории 25 нс. Все параметры расчетов находятся в файле md.mdp. Подготовить файл md.tpr, используя параметры МД (md.mdp) и «нагретую» конформацию системы (heat.gro):

grompp –f md.mdp –p sys.top -c heat.gro –o md.tpr Время, требуемое для выполнения расчетов, зависит от производительности используемого компьютера и может составлять несколько суток в случае загрузки только одного процессора (ядра).

Обработка траектории МД. Получение данных о подвижности аминокислотных остатков, эволюции конформации пептида в течение МД, оценка взаимодействия с растворителем В результате расчетов МД будет получен файл траектории – md.trr (md.xtc) и финальная конформация системы (после 25 нс МД) – md.gro. На основании полученных МД-данных предлагается выполнить следующий анализ:

оценить подвижность аминокислотных остатков (стандартные квадратичные флуктуации, СКФ);

оценить изменение вторичной структуры пептида в процессе МД;

оценить число водородных связей, образуемых между пептидом и растворителем, а также внутри пептида.

Подвижность аминокислотных остатков пептида. Для получения информации о значениях СКФ для каждого остатка, которые можно сопоставить с их подвижностью, необходимо использовать утилиту g_rmsf:

После обработки в файл rmsf.xvg будет записан профиль подвижности аминокислотных остатков в текстовом формате.

Изменение вторичной структуры пептида в процессе МД. Для получения информации об эволюции вторичной структуры пептида необходимо использовать утилиту do_dssp:

do_dssp –s md.tpr –f md.trr –o pep_sec.xpm –dt После обработки в файл pep_sec.xpm будет записана диаграмма изменений конформации (показано различными цветами) каждого аминокислотного остатка в течение МД (через каждые 50 пс МД, -dt 50). Для конвертации файла *xpm в более распространенный формат векторной графики (*.eps, PostScript) необходимо использовать утилиту xpm2ps:

Образование водородных связей внутри молекулы пептида и между пептидом и молекулами растворителя. Для получения информации о числе водородных связей разного типа в процессе МД необходимо использовать утилиту g_hbond:

После запуска утилиты необходимо выбрать, между какими группами оценивать число водородных связей («Protein»+«Protein» – внутри пептида, «Protein»+«SOL» -между молекулами воды и пептидом). После обработки в файл hbonds.xvg будет записана информация о числе водородных связей разных типов в каждый момент времени МД.

Оформление полученных результатов и подготовка отчета о выполненной работе По результатам анализа необходимо построить соответствующие графики и диаграммы, сделать вывод о структурно-динамических свойствах исследуемого пептида и стабильности его -спиральной конформации.

Примерный план отчета о выполнении экспериментов Название, цель и задачи эксперимента.

Краткий обзор литературы (реферат) по теме применение методов молекулярной динамики для установления пространственной структуры и механизмов функционирования белков На основании полученных МД-данных представить результаты анализа: оценка подвижности аминокислотных остатков (стандартные квадратичные флуктуации, СКФ);

оценка изменений вторичной структуры пептида в процессе МД; оценка числа водородных связей, образуемых между пептидом и растворителем, а также внутри пептида.

Сделать вывод о структурно-динамических свойствах исследуемого пептида и стабильности его -спиральной конформации В конце отчета дать общее заключение по проделанным экспериментам.

Список цитированной литературы.

Практикическое занятие № 1. Моделирование взаимодействия сигнальных пептидов с мембранами Цель экспериментов Обучение студентов основам метода управляемой молекулярной динамики.

Задачи экспериментов Получение практических навыков по молекулярному моделированию взаимодействия пептидов с мембранами.

Характер экспериментов: частично-поисковый.

Форма организации студентов: индивидуальная.

Время, отводимое на выполнение экспериментальной работы:

24 академических часа (включая часы самостоятельной работы).

Ход экспериментов Сборка структур сигнальных пептидов в -спиральной конформации на основе их аминокислотной последовательности в программе HyperChem.

Изучение термостабильности сигнальных пептидов Создание системы, содержащей липидный бислой и сигнальный пептид в водном окружении Перемещение пептида в зону углеводородных цепей липидов с помощью метода управляемой молекулярной динамики Обработка результатов Отчет о проделанной работе.

Методические указания по выполнению экспериментов Сборка структур пептидов.

Сборка структур пептидов происходит с помощью программы HyperChem.

Необходимо запустить программу HyperChem и с помощью базы данных аминокислотных остатков собрать по отдельности в конформации -спирали два сигнальных пептида со следующей аминокислотной последовательностью:

Первый сигнальный пептид:

Ace-Ile-Ser-Trp-Cys-Met-Trp-Trp-Leu-Gln-Tyr-Phe-Leu-Thr-Arg-Val-Glu-Ala-Gln-LeuHis-Val-Trp-Val-Pro-Pro-Leu-Asn-Val-Arg-Gly-Gly-Arg-Asp-Ala-Val-Ile-Leu-Leu-Met-Cys-Val- Val-His-Pro-Thr-Nme.

Второй сигнальный пептид:

Ace-Ile-Ala-Gly-Gly-His-Tyr-Val-Gln-Met-Ala-Ile-Ile-Lys-Leu-Gly-Ala-Leu-Thr-GlyThr-Tyr-Val-Tyr-Asn-His-Leu-Thr-Pro-Leu-Arg-Asp-Trp-Ala-Nme.

Изучение термостабильности сигнальных пептидов.

Для изучения термостабильности сигнальных пептидов проводятся эксперименты по молекулярной динамике пептидов в столкновительной среде при различных температурах.

Сначала с помощью программы PredMd GUI создаются структурные файлы signal1.str и signal2.str.

После создания структур следует запустить программу PumaGUI. В ней следует подготовить к запуску эксперименты по изучению термостабильности. Для экспериментов следует выставить следующие параметры:

1. Потенциальное поле: Amber99.

4. Термостаты: Берендсена и столкновительный.

5. Постоянная времени в термостате Берендсена: 0.5 пс.

6. Масса виртуальной частицы в столкновительном термостате: 18 а.е.м.

7. Частота столкновения виртуальных частиц с атомами в расчитываемой системе в столкновительном термостате: 55 пс–1.

8. Диэлектрическая проницаемость среды: = 1.

9. Радиус обрезания для кулоновского взаимодействия: Rel = 20.

10. Радиус обрезания для взаимодествия Ван-дер-Ваальса: RVdW = 20.

12. Шаг записи в траекторный файл: 0.1 пс.

13. Шаг записи в файл статистики: 1 фс.

14. Для численного интегрирования используется алгоритм Верле.

15. Начальные скорости задаются в соответствии с распределением Максвелла с помощью генератора случайных чисел.

Затем программу PumaGUI и папки, содержащие подготовленные для запуска файлы следует скопировать на два компьютера для проведения молекулярно-динамических расчетов и запустить эксперименты в программе PumaGUI.

Создание систем, содержащих липидный бислой и сигнальный пептид в водном окружении Для создания систем используется PDB-файл, содержащий отрелаксированный мембранный бислой в водном окружении, ориентированный перпендикулярно оси Y. Для начала пептид ориентируется вдоль оси X или Z в программе HyperChem. Затем, с помощью программы BilayerGUI пептид помещается в зону молекул воды. Рекомендуется при вставлении пептида в систему указывать координату Y на 35-40 выше геометрического центра системы. Cледует сохранить готовые файлы под именами sig1m.ent и sig2m.ent.

После создание систем следует проверить их адекватность в любой программе, предназначенной для просмотра молекул, например RasMol.

Перемещение пептида в зону углеводородных цепей липидов с помощью метода управляемой молекулярной динамики Для проведения данного эксперимента используется метод управляемой молекулярной динамики. Для начала необходимо с помощью программы PredMDGUI создать структурные файлы sig1m.str и sig2m.str. Затем запустить эксперимент по молекулярной динамике со следующими параметрами:

1. Потенциальное поле: Amber99.

2. Длина траектории: 100 пс.

3. Температура: 300 К.

4. Термостаты: Столкновительный.

5. Баростат: Берендсена 6. Постоянная в баростате 1 пс- 7. Параметры давления по осям: X,Z = –260 атм., Y = 1 атм.

8. Масса виртуальной частицы в столкновительном термостате: 18 а.е.м.

9. Частота столкновения виртуальных частиц с атомами в расчитываемой системе в столкновительном термостате: 55 пс–1.

10. Диэлектрическая проницаемость среды: = 1.

11. Радиус обрезания для кулоновского взаимодействия: Rel = 20.

12. Радиус обрезания для взаимодествия Ван-дер-Ваальса: RVdW = 20.

13. Шаг интегрирования: = 1 фс.

14. Шаг записи в траекторный файл: 0.1 пс.

15. Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле.

16. Сила равна 5 ккал/(моль*А*атом), приложена к атомам пептида и направлена вдоль оси Z в сторону мембраны.

Обработка результатов Обработка результатов экспериментов по термостабильности.

Траектории, полученные в результате экспериментов по термостабильности следует сохранять каждый 100й шаг траектории.

Полученную траекторию открывают в программе VMD и, поставив тип отображения вторичной структуры Cartoon, а тип окрашивания остатков: By ResID оценивают процент вторичной структуры сохранившейся у пептидов в результате динамики при 300К и 700К. На основании полученных данных следует сделать выводы о степени термостабильности первого и второго пептидов.

Обработка результатов экспериментов по проникновению пептида в мембрану.

Для оценки динамики сигнальных пептидов следует построить графики смещения С-атомов сигнальных пептидов вдоль оси Z. Для этого, с помощью любого текстового редактора следует открыть структурные файлы sig1m.ent и sig2m.ent. Затем следует выписать номера С-атомов аминокислотных остатков сигнальных пептидов.

Затем следует запустить программу TrjTools и с помощью команды TrjSelect из меню Tools. В открывшемся окне следует ввести номера С-атомов и сохранить результаты в отдельных файлах Sig1m_C.txt и Sig2m_C.txt.

Полученные файлы следует открыть в программе MSExcel и построить графики смещения С-атомов вдоль оси Z. На основании полученных графиков следует сделать выводы о скорости и характере перемещения сигнальных пептидов.

Кроме того, следует с помощью программ для просмотра молекул, следует сделать серию изображений в формате JPG: Сигнальные пептиды в столкновительной среде при 300К и при 700К, сигнальные пептиды в воде около мембраны до запуска эксперимента, сигнальные пептиды в мембранном бислое.

Примерный план отчета о выполнении экспериментов Название, цель и задачи экспериментов.

План выполнения всех задач, с указанием всех необходимых параметров.

В отчете привести все полученные изображения молекулярных систем, результаты расчетов, таблицы и графики.

Представить результаты оценки процент вторичной структуры, сохранившейся у пептидов в результате динамики при 300К и 700К и выводы о степени термостабильности первого и второго пептидов.

Представить графики проникновения пептида в мембрану и сделанные на основе их выводы о скорости и характере перемещения сигнальных пептидов.

В конце отчета делается общее заключение по проделанным экспериментам.

Список цитированной литературы.

3. ДИСЦИПЛИНА «КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ И

МИКРОСПЕКТРОСКОПИЯ»

Эксперименты, проводимые на уникальном учебно-научном оборудовании по дисциплине «Конфокальная микроскопия и микроспектроскопия» выполняются в рамках трех практических и одной лабораторной работы «Настройка и проведение измерений с использованием проточного цитофлуориметра Cytomics FC 500», «Измерение цитотоксичности биологически-активных соединений методом проточной цитометрии», Настройка лазерного сканирующего конфокального микроскопа и проведение измерений в режимах двумерного и трехмерного сканирования» и «Настройка лазерного сканирующего конфокального микроскопа и проведение измерений в кинетическом и спектральном режимах».

Комплект уникального оборудования для этих работ включает в себя:

(1) приборы (ламинарный шкаф, СО2-инкубатор, клеточная центрифуга, инвертированный микроскоп, автоматический нанос для серологических пипеток, бытовой холодильник для хранения реактивов), расходные материалы и реагенты для культуральной работы с эукариотическими клетками.



Pages:   || 2 | 3 | 4 | 5 |   ...   | 6 |
 


Похожие работы:

«просто смотрит и вроде бы ждет от меня чего-то. И тут я догадалась – он не может говорить, руки за него говорят, и вроде о том, что пришел он по какому-то очень важному делу. Предложила ему стул, вопросительно вглядываясь в лицо необычного посетителя. Он не спеша вытащил чистый лист бумаги, и начал писать: Я, Гусев Владимир Матвеевич. Принес вам свои, так сказать, высказанные на бумаге мысли. О чем? Да вы прочтите!. Статья, как предполагал Фото: Андрей Макаров автор, была написана для газеты, и...»

«PC WORLD RUSSIA CD. BOOKSHELF 2005 2004 МИР ПК – ДИСК КНИЖНАЯ ПОЛКА № 3, март 2006 Рецензии i Юреш Вахалия UNIX ИЗНУТРИ СЕРИЯ “КЛАССИКА COMPUTER SCIENCE” СПб.: Питер, 2003. — 844 с.: ил. Сегодня UNIX представляет собой целое семейство её же преемников — так велико число клонов этой операционной системы. И, разумеется, изданы сотни учебников и руководств, описывающих возможности всех этих реализаций UNIX. Однако подавляющее большинство книг по UNIX показывают систему со стороны пользователя,...»

«Ю. ПЕТРОВ Путь домой Сборник стихов Кемерово 2011 г. 2 Быть чистым или нет – выбирать тебе самому, никто не может очистить других. Е.П. Блаватская Новый взгляд на привычные вещи может наделить нас новой энергией в соответствии с нашими нуждами. Лама Еше. 3 Дорог много, путь один. И хотя для каждого он свой, путь всегда находится внутри нас. Приходит время, когда возникает необходимость вступить на путь. И лишь за счёт чистого сердца, накопленных знаний и собственной интуиции можно двигаться по...»

«Шарль де Костер ЛЕГЕНДА ОБ УЛЕНШПИГЕЛЕ и Ламме Гудзаке, об их доблестных, забавных и достославных деяниях во Фландрии и других краях Предисловие совы Уважаемые художники, глубокоуважаемые издатели, уважае­ мый поэт! Я принуждена сделать несколько замечаний по поводу вашего первого издания. Как? Во всей этой толстой книге, в этом слоне, которого вы в количестве восемнадцати человек[1] пыта­ лись направить на путь славы, не нашлось хотя бы крошечного местечка для птицы Минервы[2], для мудрой, для...»

«“7 Ошибок Начинающего Предпринимателя” Кирилл Гайдук http://nakedbiz.ru Оглавление 1. Об авторе 2. Введение 3. Ошибка №1 Распыленность 4. Ошибка №2 Перфекционизм 5. Ошибка №3 Поиск стартового капитала 6. Ошибка №4 Отсутствие тестовых продаж 7. Ошибка №5 Переучивание рынка 8. Ошибка №6 Переинформированность 9. Ошибка №7 Жадность 10. Эпилог Об авторе Соучредитель компании Обнажённый Бизнес, соучредитель компании “Реальная Жизнь”, директор Студии Продающих Текстов Кирилла Гайдука. Организовал...»

«КОНРАД ЛОРЕНЦ ГОД СЕРОГО ГУСЯ КОНРАД ЛОРЕНЦ ГОД СЕРОГО ГУСЯ 1 КОНРАД ЛОРЕНЦ ГОД СЕРОГО ГУСЯ ФОТОГРАФИИ СИБИЛЛЫ И КЛАУСА КАЛАС Перевод с немецкого И. ГУРОВОЙ Предисловие канд. биол. наук Е.Н. ПАНОВА МОСКВА МИР 1984 2 3 Предисловие Истинное счастье человека — отдать всю свою жизнь занятию любимым делом. Откуда приходит к нам это увлечение? ПочеББК 28.693. му один становится инженером, другой — художником, а треЛ тий — зоологом? И почему одни зоологи страстно интересуютУДК 598. ся исследованием...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра образования и науки Российской Федерации А.Г.Свинаренко 27 декабря 2005 г. Регистрационный номер 767 гум/сп ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Специальность 040104 Организация работы с молодежью Квалификация – Специалист по работе с молодежью Вводится с момента утверждения Москва - 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИАЛЬНОСТИ 040104 – ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ С МОЛОДЕЖЬЮ...»

«СЕРИЯ ЛИТЕРАТУРЫ И ЯЗЫКА ТОМ 41 • № 2 • 1982 И З ПЕРЕП И СКИ АЛЕКСАН ДРА БЛО КА С В Я Ч. ИВАНОВЫМ П убликация Н. В. Котредева Н еровна пиния отношений Б л о к а и И ванова: заочное знакомство по стихам в 1903—1904 гг. и личное в 1905-м; взаимное увлечение с конца 1906-го; единомыслие, когда в 1907-м стан символистов раскололся надвое; еще более тесное сближение в конце 1908 г., когда стало видно, к ак сродни их размы ш ления о России и ее народе; отстаивание заветов символизма и снова общие...»

«Исмаилов Чынгыз Путь к успеху – путь к свободе Бишкек 2012г. 1 Бог дает каждой птице червя, но не бросает его в гнездо 2 УДК 159.9 ББК 88.4 И 88 Гл. редактор: И.А. Пешехонова. Рецензенты: канд. филол. наук, доцент Б.Т. Койчуев; канд. психол. наук, доцент О.В.Киселева. Исмаилов Ч.Э. И88 Путь к успеху – путь к свободе. Б.: Кут Бер, 2012. - 171с. ISBN 978-9967-437-72-2 Книга адресована тем, кто интересуется вопросами самопознания, стремится к личностному росту и хочет научиться управлять своей...»

«Скублов Г.Т., Потапович Е.М. Челябинский метеорит, Челябинскиты и Челябинский НЛО-феномен (материалы дискуссии на заседании РМО – 3.03.2014 г. Содержание статьи : Предисловие.... стр. 1-2 1 – Скублов Г.Т., Потапович Е.М. Челябинскиты – новый тип природных образований из района падения Челябинского метеорита; доклад на заседании Российского минералогического общества 3 марта 2014 г. стр. 2 - 13 2 – Скублов Г.Т. Ленинградские НЛО-феномены и челябинскиты (содоклад на заседании РМО 3 марта 2014...»

«Анекдоты про Чапая Петька влетает к Василию Ивановичу и кpичит: - Василий Иваныч, Василий Иваныч, там. в саpае. белый Анку насильничает!! Василий Иванович хватает винтовку и бегом к саpаю. Вpывается внутpь и Анке: - Анка, ну-ка подмахни ему, я этого гада влет пульну! - Василий Иванович, танк лезет!! - Возьми вон гранату на печке. Ступай! Через полчаса Петька возвращается. Василий Иванович спрашивает: - Ну как, готов танк? - Готов! - Молодец! А гранату на место положь! Петька вбегает к Василию...»

«Валерия Фадеева Самая важная российская книга мамы. Беременность. Роды. Первые годы От автора Здравствуйте, дорогие читатели! Прежде всего, хочу вас поздравить с тем, что вы решили родить ребенка, а возможно, даже сразу двоих или троих! Дети – правда настоящее сокровище! Они наполняют нашу жизнь смыслом, делают ее яркой, насыщенной, похожей на увлекатель­ ное приключение. С ними вы уж точно ни­ когда не заскучаете. Они дарят нам столько радости! Когда женщина наблюдает за хохо­ чущим малышом, в...»

«1 Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра Конструирования и технологии одежды УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Методы и средства исследований Основной образовательной программы по специальности 260901.65 Технология швейных изделий специализация Технология изделий из ткани Благовещенск 2012 1 2 2 1 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА 1.1 Цели и...»

«НАУЧНИ ПУБЛИКАЦИИ НА УЧЕНИТЕ ОТ ИНСТИТУТА ПО ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА МОРФОЛОГИЯ, ПАТОЛОГИЯ И АНТРОПОЛОГИЯ С МУЗЕЙ – 2013 г. І. ИЗЛЕЗЛИ ОТ ПЕЧАТ ПРЕЗ 2013 г. І.1. РЕФЕРИРАНИ И ИНДЕКСИРАНИ В СВЕТОВНАТА СИСТЕМА ЗА РЕФЕРИРАНЕ, ИНДЕКСИРАНЕ И ОЦЕНЯВАНЕ 1. Yossifova L., Gardeva E., Toshkova R., Alexandrov M., Nedyalkov N., Atanasov P. Plasmon-induced photothermal effects of gold nanoparticles on human permanent cell line T-24. Eur. J. Cancer 49, Suppl. 2, 2013, ISSN 0959-8049, IF 5.061, SJR 2.346 2....»

«592 Г79 Сперва я узнал В. С. Гребенникова как художника. И был Виктор Степанович Гребенников известен как осно­ зачарован его рисунками. С кусочков ватмана на меня глядели, ватель первых в нашей стране микрозаповедников и за­ летели и мчались необыкновенно яркие живые создания, в казников полезной энтояофауны. Главная идея его но­ вой книги, как и предыдущих,— охрана Природы. Не острых ракурсах, с очень своеобразными и динамичными поза­ прожектерствовать, не пустословить, а конкретными ми,...»

«МОДЕЛИРОВАНИЕ ФРАКТАЛОВ В СРЕДЕ MAXIMA часть I П.И. ТРОШИН Казанский федеральный университет Казань 2012 Оглавление ВВЕДЕНИЕ 3 1 МОДЕЛИРОВАНИЕ -СИСТЕМ 5 2 СИСТЕМЫ ИТЕРИРОВАННЫХ ФУНКЦИЙ 17 3 ВЫЧИСЛЕНИЕ РАЗМЕРНОСТИ МИНКОВСКОГО 25 4 КОМПЛЕКСНАЯ ДИНАМИКА 33 ПРИЛОЖЕНИЕ 47 РЕСУРСЫ ИНТЕРНЕТА 60 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 63 УКАЗАТЕЛЬ КОМАНД 65 2 ВВЕДЕНИЕ Чем абстрактнее истина, которую ты хочешь преподать, тем сильнее ты должен обольстить ею еще и чувства. Фридрих Ницше Красоту в математике так же трудно...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ: Заместитель Министра образования Российской Федерации В.Д.Шадриков 10 марта 2000 г. Номер государственной регистрации 116 ЕН / СП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Специальность 014400 Гидрогеология и инженерная геология Квалификация – гидрогеолог, инженер-геолог, геокриолог Вводится с момента утверждения Москва, 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИАЛЬНОСТИ 014400 Гидрогеология и инженерная геология...»

«ОРГАНИЗАЦИЯ A ОБЪЕДИНЕННЫХ НАЦИЙ ГЕНЕРАЛЬНАЯ АССАМБЛЕЯ Distr. GENERAL A/HRC/WG.6/5/COG/1 23 February 2009 RUSSIAN Original: FRENCH СОВЕТ ПО ПРАВАМ ЧЕЛОВЕКА Рабочая группа по универсальному периодическому обзору Пятая сессия Женева, 4-15 мая 2009 года НАЦИОНАЛЬНЫЙ ДОКЛАД, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В СООТВЕТСТВИИ С ПУНКТОМ 15 А) ПРИЛОЖЕНИЯ К РЕЗОЛЮЦИИ 5/ СОВЕТА ПО ПРАВАМ ЧЕЛОВЕКА* Конго * Настоящий документ до передачи в службы перевода не редактировался. GE.09-11269 (R) A/HRC/WG.6/5/COG/ page Введение...»

«Бурая лесная Чернозем глеевая почва обыкновенный (грунтового Чернозем умеренный, и смешанного южный промерзающий увлажнения) Каштановая Солонец Чернозем почва черноземный типичный ПОЧВОВЕДЕНИЕ В 2 ЧАСТЯХ Под редакцией В.А. Ковды, Б.Г. Розанова Часть 2 Типы почв, их география и использование Допущено Министерством высшего и среднего специального образования СССР в качестве учебника для студентов почвенных и географических специальностей университетов МОСКВА ВЫСШАЯ ШКОЛА ПРЕДИСЛОВИЕ Во второй...»

«Э.С. Сильнова н.Г. КаневСКая в.Ф. олейниК РУССКИЙ ЯЗЫК Учебник для 3 класса общеобразовательных учебных заведений с обучением на русском языке Рекомендовано Министерством образования и науки Украины (приказ Министерства образования и науки Украины от 17.07.2013 г. № 994) Сильнова Э. С. С36 Русский язык : учеб. для 3-го кл. общеобразоват. учеб. заведений с обучением на рус. яз. / Э. С. Сильнова, н. Г. Каневская, в. Ф. олейник. – К. : Генеза, 2014. – 176 с. ISBN 978-966-11-0339-8. УДК...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.