WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Настоящее изобретение относится к новому белку, обозначаемому INSP201 и идентифицированному в настоящей заявке как гликопротеин клеточной поверхности, и к применению ...»

-- [ Страница 1 ] --

011261

Настоящее изобретение относится к новому белку, обозначаемому INSP201 и идентифицированному в настоящей заявке как гликопротеин клеточной поверхности, и к применению этого белка и последовательностей нуклеиновой кислоты, содержащей гены, кодирующие указанный белок, в целях диагностики, предупреждения и лечения заболеваний.

Все цитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных о последовательностях этих белков.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков согласно изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточной высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Введение Секретируемые белки Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида.





Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-связанный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые доставляются в секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами сигнального пептида, который играет главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки.

Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептид INSP201 представляет собой гликопротеин клеточной поверхности.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (i) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 и/или SEQ ID NO:18;

(ii) представляет собой ее фрагмент, который является членом семейства гликопротеинов клеточной поверхности или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидами (i), или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Предпочтительно полипептид согласно первому аспекту изобретения содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:12. Такой предпочтительный белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.

В соответствии со вторым вариантом своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO:2;

SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: и/или SEQ ID NO:18.

Предпочтительно фрагментом, исключенным из объема настоящего изобретения, является фрагмент, состоящий из первых 79 аминокислот SEQ ID NO:8. Этот фрагмент описан в GenPept NCBI per. № AX884746 и в нижеследующих патентных документах под названием Genset: US20050106595, US6822072, JP2001269182, JP2002511259, ЕР1033401, WO9953051 и US6783961. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, будет далее называться "полипептидом экзона -1INSP201". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:4, будет далее называться "полипептидом экзона 2 INSP201". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:6, будет далее называться "полипептидом экзона 3 INSP201". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:8, будет далее называться "полноразмерным полипептидом INSP201".

Не претендуя на какую-либо теорию, заявители лишь предполагают, что первые 21 аминокислоты полипептида INSP201 образуют сигнальный пептид.

Полипептид экзона 1 INSP201, не содержащий этой предполагаемой сигнальной последовательности, представлен в SEQ ID NO:10. Полноразмерная последовательность полипептида INSP201, не содержащая этой предполагаемой сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:12.





Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:10, будет далее называться "зрелым полипептидом экзона 1 INSP201". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:12, будет далее называться "зрелым полипептидом INSP201".

В настоящей заявке высказывается предположение, что полипептид INSP201 содержит определенное число возможных сайтов N-гликозилирования. В соответствии с этим, гликопротеины, содержащие (или состоящие из) полипептид(a) INSP201, модифицированный(ого) посредством N-гликозилирования в одном, двух, трех, четырех, пяти, шести или семи положениях, соответствующих Asnl24, Asnl56, Asnl88, Asn204, Asn220, Asn250 и Asn268 SEQ ID NO:8, являются аспектами настоящего изобретения.

В настоящей заявке высказывается предположение, что полипептид INSP201 содержит трансмембранную область, локализованную между остатками 406-427, включительно, последовательности SEQ ID NO:8. В соответствии с этим, внеклеточные варианты полипептида INSP201 являются аспектами настоящего изобретения. Предпочтительно, чтобы такие варианты включали внеклеточные формы, содержащие, или состоящие из них, аминокислотные остатки 1-405 SEQ ID NO:8, или остатки 22-405, включительно, последовательности SEQ ID NO:8, в их апо- и N-гликозилированных формах, описанных выше.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, будет далее называться "внеклеточным полипептидом INSP201". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, будет далее называться "зрелым внеклеточным полипептидом INSP201", и этот полипептид не включает аминокислоты, предположительно, образующие сигнальную последовательность полипептида INSP201.

Полипептидные варианты такого типа могут быть, в частности, использованы в скрининг-анализах на лиганды, такие как секретируемые лиганды, связывающиеся с полипептидом INSP201 и с другими белками указанного типа. Такие варианты могут быть также использованы для количественной оценки указанных лигандов, например для диагностики заболевания, в патогенезе которых эти лиганды и указанный полипептид играют определенную роль.

Аспектом настоящего изобретения также является внутриклеточный вариант полипептида INSP201.

Таким вариантом является полипептид, состоящий из аминокислотных остатков 428-518, включительно, последовательности SEQ ID NO:8. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, будет далее называться "внутриклеточным полипептидом INSP201".

Используемый здесь термин "полипептиды INSP201" включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 INSP201, полипептид экзона 2 INSP201, полипептид экзона 3 INSP201, полноразмерный полипептид INSP201, зрелый полипептид экзона 1 INSP201, зрелый полипептид INSP201, внеклеточный полипептид INSP201, зрелый внеклеточный полипептид INSP201 и внутриклеточный полипептид INSP201. Все эти полипептиды являются аспектами настоящего изобретения.

В соответствии с вышеупомянутыми вариантами первого аспекта настоящего изобретения предпочтительно, чтобы такой полипептид функционировал как секретируемый белок, в частности как член семейства гликопротеинов клеточной поверхности.

Гликопротеины клеточной поверхности представляют значительный интерес для специалиста в области биологии человека, а значит, и физиологии человека, а также в области здравоохранения. Очевидно, что внешняя поверхность клеточной мембраны играет важную роль в образовании тканей и в сохранении их целостности. Внешние поверхности развивающихся и дифференцированных клеток содержат рецепторные молекулы, распознающие системные сигналы, лиганды или гормоны. Связывание или диссоциация лигандов регулирует некоторые из различных функций клеток и приводит их в соответствие с требованиями всей системы организма. Внешняя поверхность клеток также покрыта гликопротеинами и протеогликанами. Такие крупные комплексы белка и полисахаридов образуют тканеспецифический матрикс, в котором клетки, имеющие аналогичную функцию, могут действовать совместно как единая ткань. При эмбриогенезе сортировка и объединение клеток, имеющих общую функцию, облегчается и, вероятно, регулируется благодаря молекулярной специфичности гликопротеиновых и протеогликановых поверхностей данных клеток.

Углеводные цепи представляют собой гликопротеины, связанные N- и О-гликозидными связями и образующие сложные структуры. Фактически, N- и О-гликановые цепи формируются в эндоплазматическом ретикулуме и в аппарате Гольджи в результате регулируемого каскада гликотрансферазных и гликозидазных реакций процессинга под влиянием событий специфической регуляции (например, на уровне -2экспрессии гена или локализации фермента). Такая комплексная регуляция приводит к образованию сотен структур, некоторые из которых варьируются, в зависимости от типа клеток/тканей или стадии их развития/дифференцировки.

В настоящее время наблюдается всевозрастающий интерес к заболеваниям, вызываемым нарушением гликозилирования, и к терапевтическим гликопротеинам, продуцируемым методами рекомбинантных ДНК. В частности, патологические клетки могут содержать относительные количества указанных структур, которые в большинстве случаев отличаются от нормальных клеток по своим свойствам и могут быть использованы в целях определения стадии заболевания и в целях диагностики. Информация о структурах гликопротеинов, ассоциированных с данным заболеванием и об их функциях, может быть использована в терапии, например, в иммунотерапии, для блокирования клеточной адгезии или предотвращения других процессов связывания или других биологических процессов (Brockhausen I. et al., Acta Anat. 1998; 161(1-4):36-78; Bhatia P.K. & Mukhopadhyay A., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1999; 64:155Так, например, была исследована взаимосвязь между характером гликозилирования/экспрессии гликопротеинов и прогрессированием рака/развитием злокачественных заболеваний (Dennis J.W. et al., Biocheim. Biophys. Acta. 1999 Dec. 6; 1473 (1) :21-34) или наследственных заболеваний (Dennis J.W. et al., Bioassays. 1999 May; 21 (5) :412-21).

С учетом того, что гликопротеины обычно экспрессируются в виде смесей гликоформ, были разработаны различные методы получения гомогенных гликопептидных и гликопротеиновых материалов для их использования в экспериментах, проводимых в целях биологического исследования гликопротеинов (Grogan M.J. et al., Annu.Rev.Biochem. 2002; 71:593-634).

Многие гликопротеины клеточной поверхности подвергаются ограниченному протеолизу под действием клеточных протеаз. Такой механизм "слущивания" способствует секреции внеклеточных доменов, которые могут влиять на активность связывания других циркулирующих белков, распознаваемых этими внеклеточными доменами. Фактически, такое "слущивание" внеклеточных доменов в результате изменения клеточных ответов на экзогенные раздражители приводит к развитию ряда патофизиологических процессов, таких как воспаление, дегенерация и апоптоз клеток, а также онкогенез, как было показано в результате интенсивного исследования систем "цитокин/рецептор цитокина" (Mullberg J. et al., Eur. Cytokine Netw. 2000 Mar; 11 (1) :27-38; Arribas J. & Merlos-Suarez A. Curr. Top. Dev. Biol. 2003;

54:125-44; Dello Sbarba P. & Rovida E; Biol. Chem. 2002 Jan; 383 (1):69-83).

Полипептиды согласно первому аспекту настоящего изобретения могут дополнительно содержать гистидиновую метку. Такая гистидиновая метка предпочтительно присутствует у С-конца данного полипептида. Предпочтительно такая гистидиновая метка содержит 1-10 гистидиновых остатков (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков). Более предпочтительно указанная гистидиновая метка содержит гистидиновых остатков.

"Антигенная детерминанта" согласно изобретению может представлять собой часть полипептида согласно изобретению, которая связывается с антигенсвязывающим сайтом антитела или с Т-клеточным рецептором (TCR). Альтернативно, "антигенная детерминанта" может представлять собой сайт на поверхности полипептида согласно изобретению, с которым связывается одна молекула антитела. Вообще говоря, антиген имеет несколько или множество различных антигенных детерминант и реагирует с антителами, обладающими множеством различных специфичностей. Такое антитело предпочтительно является иммуноспецифичным к полипептиду согласно изобретению. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к полипептиду согласно изобретению, который не составляет часть гибридного белка. Предпочтительно указанное антитело является иммуноспецифичным к INSP201 или к его фрагменту. Антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и могут иметь специфические трехмерные структуры, а также определенный заряд. Предпочтительно термин "антигенная детерминанта" означает конкретную химическую группу на полипептиде согласно изобретению, которая является антигенной, то есть вырабатывает специфический иммунный ответ.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно первому аспекту изобретения.

Термин "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" предпочтительно означает молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению, которая (1) отделена, по меньшей мере примерно от 50% белков, липидов, углеводов или других соединений, с которыми ассоциируется природная полноразмерная нуклеиновая кислота при ее выделении из клеток-источников; (2) не связана со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми указанная "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" ассоциируется в природе, (3) функционально присоединена к полинуклеотиду, с которым она не ассоциируется в природе; или (4) не встречается в природе как часть более крупной полинуклеотидной последовательности.

Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению, по существу, не содержит любой(ых) другой(их) примесной(ых) молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты или других примесей, которые присутствуют в ее природном окружении и могут препятствовать использованию этой нуклеиновой кислоты для продуцирования полипептидов или ее терапевтическому, диагностическому или профилактическому применению или применению в целях исследования.

Предпочтительный вариант изобретения, в частности, относится к молекулам геномных ДНК, которые не входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно геномная ДНК, в частности, имеющая размер более чем 10 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов), 50 т.п.н., 100 т.п.н., 150 т.п.н., 200 т.п.н., 250 т.п.н.

или 300 т.п.н., не входит в объем изобретения. При этом предпочтительно, если такая "очищенная молекула нуклеиновой кислоты" состоит только из кДНК.

Предпочтительно очищенная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:1 (кодирующей полипептид экзона 1 INSP201), SEQ ID NO:3 (кодирующей полипептид экзона 2 INSP201), SEQ ID NO:5 (кодирующей полипептид экзона INSP201), SEQ ID NO:7 (кодирующей полипептид INSP201), SEQ ID NO:9 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 INSP201), SEQ ID NO:11 (кодирующей зрелый полипептид INSP201), SEQ ID NO: (кодирующей внеклеточный полипептид INSP201), SEQ ID NO:15 (кодирующей внутриклеточный полипептид INSP201) или SEQ ID NO:17 (кодирующей зрелый внеклеточный полипептид INSP201), или представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из указанных последовательностей.

Настоящее изобретение также относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 (кодирующей полипептид экзона 1 INSP201), SEQ ID NO:3 (кодирующей полипептид экзона 2 INSP201), SEQ ID NO:5 (кодирующей полипептид экзона 3 INSP201), SEQ ID NO:7 (кодирующей полипептид INSP201), SEQ ID NO:9 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 INSP201), SEQ ID NO:11 (кодирующей зрелый полипептид INSP201), SEQ ID NO:13 (кодирующей внеклеточный полипептид INSP201), SEQ ID NO:15 (кодирующей внутриклеточный полипептид INSP201) или SEQ ID NO:17 (кодирующей зрелый внеклеточный полипептид INSP201), или представляющей собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из указанных последовательностей.

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5XSSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1Х SSC приблизительно при 65°С.

Используемый здесь термин "функциональный эквивалент" означает молекулу белка или нуклеиновой кислоты, обладающую функциональными или структурными свойствами, в основном аналогичными свойствам молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты согласно изобретению. Функциональный эквивалент белка может содержать модификации, если такие модификации необходимы для осуществления конкретной функции. Термин "функциональный эквивалент" включает фрагменты, мутанты, гибриды, варианты, аналоги или химические производные молекулы.

Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая любой одной или несколькими функциональными активностями полипептидов согласно изобретению.

Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая, по существу, аналогична активности INSP201 или его фрагмента, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая идентична активности или превышает активность INSP201 или его фрагмента, измеренную в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть молекула белка или нуклеиновой кислоты, обладающая активностью, которая составляет 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, 100% или более от активности INSP201 или его фрагментов, измеренной в соответствующем анализе на биологическую активность или функцию.

Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть белок или полипептид, обладающий in vivo или in vitro активностью, которая по существу аналогична активности полипептидов согласно изобретению. Предпочтительно "функциональным эквивалентом" может быть белок или полипептид, способный взаимодействовать с другими клеточными или внеклеточными молекулами по механизму, который, по существу, аналогичен механизму взаимодействия соответствующей части полипептидов согласно изобретению. Так, например, в иммуноанализе, "функциональный эквивалент" может способствовать снижению способности к связыванию антитела с соответствующим пептидом (то есть, пептидом, имеющим модифицированную аминокислотную последовательность, а поэтому являющимся "функциональным эквивалентом") полипептида согласно изобретению или с самим полипептидом согласно изобретению, где указанное антитело вырабатывается против соответствующего пептида полипептида согласно изобретению. Эквимолярная концентрация указанного функционального эквивалента будет снижать уровень вышеупомянутого связывания соответствующего пептида по меньшей мере примерно на 5%, предпочтительно примерно на 5-10%, более предпочтительно примерно на 10-25%, еще Так, например, функциональные эквиваленты могут быть полностью функциональными, либо у них может отсутствовать одна или несколько активностей. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, модификации могут влиять на функцию, например на активности полипептида, которые подтверждают их идентификацию как гликопротеина клеточной поверхности. В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с членами семейства гликопротеинов клеточной поверхности в соответствии с первым аспектом изобретения. Предпочтительно такой лиганд ингибирует функцию полипептида согласно первому аспекту изобретения, который является членом семейства гликопротеинов клеточной поверхности. Лиганды для полипептидов согласно изобретению могут иметь различные формы, включая природные или модифицированные субстраты, ферменты, рецепторы, небольшие органические молекулы, такие как небольшие природные или синтетические органические молекулы размером для 2000 Да, а предпочтительно 800 Да или менее, пептидомиметики, неорганические молекулы, пептиды, полипептиды, антитела, и их структурные или функциональные миметики.

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида согласно первому аспекту изобретения.

Такие соединения могут быть идентифицированы с применением описанных здесь методов анализа и скрининга.

Соединение согласно седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептида INSP201 дает возможность, разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Внеклеточные и внутриклеточные формы полипептида INSP201, предположительно, являются особенно подходящими для их применения в способах скрининга их источников. Лиганды и соединения согласно шестому и седьмому аспектам изобретения могут быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению гена или полипептида INSP201 в качестве мишени для скрининга кандидатов на лекарственные средства-модуляторы, а в частности лекарственных средств-кандидатов, обладающих активностью, направленной против расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности, где указанные способы включают в себя выявление способности указанного соединения связываться с геном или полипептидом INSP201 или с их фрагментами.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способам скрининга соединений на возможность их применения для лечения расстройств, ассоциированных с гликопротеином клеточной поверхности, где указанные способы включают в себя анализ на модуляцию активности гена или полипептида INSP201 или их фрагментов.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту настоящего изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту настоящего изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту настоящего изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту настоящего изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту настоящего изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний, в патогенезе которых участвуют члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности. Такими заболеваниями могут быть клеточно-пролиферативные расстройства, включая новообразование, меланому, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли;

миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, неходжкинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши; аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов; сердечно-сосудистые заболевания, включая гипертензию, отеки, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, инсульт, реперфузионное поражение и ишемию; неврологические расстройства, включая расстройства центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждения головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли; заболевания дыхательных путей, включая хроническую обструктивную болезнь легких и кистозный фиброз; нарушение развития; метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение; СПИД и почечные заболевания; инфекции, включая вирусные инфекции, бактериальные инфекции, грибковые инфекции и паразитарные инфекции, и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются заболевания, в патогенезе которых участвуют гликопротеины клеточной поверхности. Эти молекулы могут быть также использованы в целях приготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний. Такие молекулы могут быть также использованы для контрацепции или для лечения репродуктивных расстройств, включая бесплодие.

Молекулы согласно изобретению (то есть полипептиды согласно первому аспекту изобретения, молекула нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспектам изобретения, вектор согласно четвертому аспекту изобретения, клетка-хозяин согласно пятому аспекту изобретения, лиганд согласно шестому аспекту изобретения или соединение согласно седьмому аспекту изобретения) могут быть, в частности, использованы для лечения или диагностики расстройств/заболеваний (в данном описании изобретения, эти два термина являются взаимозаменяемыми), включая воспаление, дегенерацию и апоптоз клеток и онкогенез.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, включающему в себя оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или оценку активности полипептида согласно первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности молекулы полипептида или нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.

Предпочтительный способ детектирования полипептидов согласно первому аспекту изобретения включает в себя стадии (а) контактирования лиганда согласно шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лигандполипептид; и (b) детектирования указанного комплекса.

Что касается девятого аспекта изобретения, то в этой связи следует отметить, что для детектирования аномальных уровней белка существуют различные методы, известные специалисту, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Подобные методы могут быть использованы в короткий или продолжительный период времени, что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение относится также к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания.

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида согласно первому аспекту изобретения в качестве гликопротеина клеточной поверхности. Подходящим применением полипептидов согласно изобретению в качестве гликопротеинов клеточной поверхности является их использование в качестве регулятора клеточного роста, метаболизма или дифференцировки клеток; в качестве части пары рецептор/лиганд и в качестве диагностического маркера для детектирования физиологического или патологического состояния.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно первому аспекту изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганд согласно шестому аспекту изобретения, или соединение согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях приготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, лимфома, миелодиспластические синдромы и карцинома, новообразование, меланома, опухоли легких, ободочной кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи, и другие солидные опухоли, гематологические расстройства, такие как макроглобулинемия, аутоиммунные заболевания и воспалительные расстройства, включая аллергию, воспалительное заболевание кишечника, артрит, псориаз, рассеянный склероз, воспаление дыхательных путей, астму и отторжение трансплантированных органов, В-клеточные расстройства, сердечно-сосудистые расстройства, неврологические расстройства, нарушения развития, бесплодие, нарушения метаболизма, СПИД, почечное заболевание, инфекции и другие патологические состояния.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганда согласно шестому аспекту изобретения, или соединения согласно седьмому аспекту изобретения.

В том случае, если заболевания, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения, ниже, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, в случае, если заболевания, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или уровень активности полипептида согласно первому аспекту изобретения, выше, чем соответствующий уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

Полипептиды INSP201 представляют собой гликопротеины клеточной поверхности, а поэтому, они играют определенную роль в развитии многих патологических состояний. Антагонисты полипептидов INSP201 представляют особый интерес, поскольку они позволяют благоприятно воздействовать на динамику патологических состояний.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, которые являются дефицитными по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения и не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни указанного полипептида или вообще не экспрессируют такого полипептида.

Указанные трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики данного заболевания.

Различные стандартные методы и процедуры, которые могут применяться для осуществления изобретения, систематизированы ниже. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается описанными конкретными методами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология применяется только для описания конкретных вариантов изобретения, и эта терминология не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем изобретения ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

В настоящем описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения используются стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в данной области.

Более полное описание указанных методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящие описания, которые могут быть использованы в качестве консультации, приводятся в следующих работах: Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B.

Perbal, A. Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); и Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированных пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препро-белка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препро-части этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препро-последовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид согласно первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка.

-7Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, такому как соединение, увеличивающее время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

Гибридный белок полипептида согласно первому аспекту изобретения может, например, содержать иммуноглобулиновый гибрид, то есть гибридный белок, содержащий весь внеклеточный INSP201 (например, INSP201-EC) или его фрагмент, слитый с полноразмерным иммуноглобулином или его частью.

Методы получения гибридных белков иммуноглобулина хорошо известны специалистам и описаны, например, в WO 01/03737. Специалистам в данной области известно, что полученный гибридный белок согласно изобретению, по существу, сохраняет биологическую активность полипептида согласно первому аспекту изобретения, такую, например, как ингибирование IL-2, которое может быть определено в in vitro анализах, описанных в примере 6, или в анализе на рак, описанном в примере 7, или с использованием животных-моделей воспалительного кишечного заболевания, описанных в примере 8. Указанный гибрид может быть получен путем прямого присоединения компонентов или путем их присоединения посредством короткого линкерного пептида, длина которого может составлять по меньшей мере 1- аминокислотных остатка или более, например 5, 7, 9, 11 или 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть, например, трипептид с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met) или линкерная последовательность, состоящая из 13 аминокислот и содержащая последовательность Glu-Phe-Gly-AlaGly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, встроенную между полипептидом согласно первому аспекту изобретения и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время его присутствия в физиологических жидкостях (время полужизни), повышенная удельная активность, повышенный уровень экспрессии, или способность указанного гибридного белка легко подвергаться очистке.

В предпочтительном варианте изобретения полипептид согласно первому аспекту изобретения присоединяют к константной области молекулы Ig, например к Fc-части иммуноглобулина. Предпочтительно такой полипептид присоединяют к областям тяжелой цепи, таким как домены СН2 и СН3, например, но необязательно, вместе с шарнирной областью человеческого IgG1. Fc-часть может быть, например, мутирована для предупреждения нежелательных активностей, таких как связывание с комплементом, связывание с Fc-рецепторами или т.п.

Получение специфических гибридных белков, содержащих полипептид согласно первому аспекту изобретения и часть иммуноглобулина, описано, например, в примере 11 заявки WO99/09063. Для получения гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, и изоформы других классов Ig, таких, например, как IgM или IgA.

Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, а также гетеро- или гомомультимерными.

Другие гибридные белки полипептида согласно первому аспекту изобретения могут быть получены путем присоединения доменов, выделенных из других белков, с образованием димеров, тримеров и т.п.

Примерами последовательностей белков, которые могут образовывать мультимеры полипептидов согласно изобретению, являются домены, выделенные из таких белков, как hCG (WO97/30161), коллаген X (WO 04/33486), С4ВР (WO 04/20639), белки Erb (WO 98/02540) или суперспирализованные пептиды (WO 01/00814). Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное связывание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPIякоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование, и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любой области полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбокси-концы. Действительно, блокирование амино- или карбокси-конца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будут определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов (см., например, Bray 2003, Nat. Rev. Drug. Discov. 2(7):587-93; Casi & Hilvert 2003, Curr. Opin. Struct.

Biol., 13(5):589-94).

Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептиду INSP201. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей,эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин "сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко вычислена (Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing Informatics and Genome Projects, Smith D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin A.M. & Griffin H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov M. & Devereux J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991).

Поэтому, гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых эти полипептиды происходят) и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептида INSP201. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr;

между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; между основными остатками Lys и Arg; или между ароматическими остатками Phe и Tyr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, то есть от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота, являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются "молчащие" замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков имеют группу-заместитель.

В соответствии с настоящим изобретением любая замена должна быть предпочтительно "консервативной" или "допустимой" заменой, которую обычно определяют как замену, вводящую аминокислоты, имеющие аналогичные химические свойства (например, основная положительно заряженная аминокислота должна быть заменена другой основной, положительно заряженной аминокислотой), которые являются достаточными для сохранения структуры и биологической функции данной молекулы.

В литературе описано множество моделей, с помощью которых может быть осуществлен отбор консервативных аминокислотных замен, исходя из статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры белков (Rogov S.I. и Nekrasov A.N., 2001). Эксперименты по конструированию белков показали, что использование специфических подпоследовательностей аминокислот позволяет продуцировать белки с соответствующей укладкой и активные белки и классифицировать аминокислотные "синонимичные" замены, которые могут легко адаптироваться к белковой структуре и которые могут быть использованы для детектирования функциональных и структурных гомологов и паралогов (Murphy L.R. et al., 2000). Группы синонимичных аминокислот и группы более предпочтительных синонимичных аминокислот представлены в табл. 1.

В полипептиды согласно изобретению также могут быть также введены в различных целях специфические неконсервативные мутации. Мутации, снижающие аффинность гликопротеина клеточной поверхности, допускают возможность повторного использования этих полипептидов, а также их применения в других целях, что потенциально повышает их терапевтическую эффективность (Robinson C.R., 2002). Иммуногенные эпитопы, фактически присутствующие в полипептидах согласно изобретению, могут быть использованы для разработки вакцин (Stevanovic S., 2002), либо они могут быть удалены путем модификации их последовательности известными методами отбора мутаций, повышающих стабильность белка, и их коррекции (van den Burg В. & Eijsink V., 2002; WO 02/05146, WO 00/34317 и WO 98/52976).

Предпочтительной альтернативой синонимичным группам для аминокислотных производных, включенных в пептидомиметики, являются группы, определенные в табл. 2. Неисчерпывающий список аминокислотных производных также включает аминоизомасляную кислоту (Aib), гидроксипролин (Hyp), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-COOH, индолин-2-карбоновую кислоту, 4-дифторпролин, L-тиазолидинкарбоновую кислоту, L-гомопролин, 3,4-дегидропролин, 3,4-дигидроксифенилаланин, циклогексилглицин и фенилглицин.

Термин "аминокислотное производное" означает аминокислоту, не входящую в 20 кодируемых генетическим кодом природных аминокислот, или химическую молекулу, подобную такой аминокислоте.

В частности, такое аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные молекулы, молекулы с прямой цепью, молекулы с разветвленной цепью или циклоалкильные молекулы, а также может включать один или несколько гетероатомов. Указанные аминокислотные производные могут быть получены de novo, либо они могут быть взяты из коммерчески доступных источников (Calbiochem-Novabiochem A.G., Switzerland; Bachem, USA).

Различные методы включения неприродных аминокислотных производных в белки с использованием in vitro и in vivo систем трансляции для зондирования и/или улучшения структуры и функции белков описаны в литературе (Dougherty D.A., 2000). Методы синтеза и получения пептидомиметиков, а также непептидомиметиков также хорошо известны специалистам (Golebiowski A. et al., 2001; Hruby V.J. & Balse P.M., 2000; Sawyer Т.К., "Structure Based Drug Design", edited by Veerapandian P., Marcel Dekker Inc., pg.557-663, 1997).

Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30%-ную идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов согласно первому аспекту изобретения были более чем на 80% идентичны последовательности полипептида INSP201 или его активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами согласно первому аспекту изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов структурного сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока геномных данных (Inpharmatica Genome Threader™), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Biopendium, может быть применена (см. заявку РСТ WO 01/69507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидом INSP201, высказывается предположение, что они представляют собой члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности, где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностью полипептида INSP201. Термин "значительная структурная гомология" означает, что технология Inpharmatica Genome Threader™ позволяет предсказать структурную гомологию двух белков с достоверностью по крайней мере 10% и выше.

Полипептид согласно первому аспекту изобретения также включает фрагменты полипептида INSP201 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептида INSP201, при условии, что эти фрагменты являются членами семейства гликопротеинов клеточной поверхности или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидом INSP201.

Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей аминокислотной последовательности полипептида INSP201, либо одному из его функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по крайней мере n смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности, указанное число n предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Предпочтительно минимальная длина фрагмента согласно изобретению составляет 6, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 или 500 аминокислот.

Предпочтительно максимальная длина фрагмента согласно изобретению составляет 517, 515, 510, 500, 475, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 100 или 50 аминокислот.

Предпочтительно минимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент согласно изобретению, составляет 18, 30, 75, 150, 300, 450, 600, 750, 900, 1050, 1200, 1350 или 1500 нуклеотидов.

Предпочтительно максимальная длина молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент согласно изобретению, составляет 1551, 1545, 1530, 1500, 1425, 1350, 1200, 1050, 900, 750, 600, 450, 300 или 150 нуклеотидов.

Предпочтительно максимальная длина полипептида согласно изобретению составляет 518, 520, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500 или 5000 аминокислот.

согласно изобретению, составляет 1554, 1560, 1750, 1800, 1950, 2100, 2400, 2700, 3000, 5000, 7500, 10000, 20000, 30000, 50000, 75000 или 100000 нуклеотидов.

Фрагменты полноразмерного полипептида INSP201 могут состоять из комбинаций 2 или всех трех 3 последовательностей смежных экзонов в последовательностях полипептидов INSP201, соответственно.

Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме", то есть они могут не быть частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют.

Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако в состав одного более крупного полипептида могут входить несколько фрагментов.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя-специалиста, такие антитела помимо других применений могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин "иммуноспецифический" означает, что данные антитела имеют, в основном, более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.

Под понятием "значительно более высокая аффинность" авторы подразумевают заметно более высокую аффинность к полипептиду согласно изобретению по сравнению с аффинностью известных секретируемых белков.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105, 106 раз или более превышала аффинность по отношению к известным секретируемым белкам, таким как члены семейства гликопротеинов клеточной поверхности.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду согласно изобретению значительно превышала аффинность по отношению к известным гликопротеинам клеточной поверхности.

Если предпочтительными являются поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом согласно первому аспекту изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Такой связанный полипептид может быть затем использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.

Моноклональные антитела против полипептидов согласно первому аспекту изобретения могут быть легко получены специалистом в данной области. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии хорошо известна специалистам (см., например, Kohler G. & Milstein С, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов согласно первому аспекту изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы и химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см., например, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например путем их "гуманизации" (см., Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 34181 (1991) и Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин "гуманизованное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.

В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами согласно изобретению, либо из набора ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки "необученных" лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (McCafferty J. et al. (1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также повышена путем перестановки цепей (Clackson Т. et al., (1991) Nature 352, 624-628).

Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Поликлональные антитела, направленные против полипептида согласно изобретению, обычно вырабатываются у животных (например, у кроликов или мышей) посредством нескольких подкожных или внутрибрюшинных инъекций полипептида INSP201 и адъюванта. Может оказаться желательным использовать конъюгат полипептида согласно изобретению с белком-носителем, который является иммуногенным у иммунизуемого животного, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин или ингибитор соевого трипсина. Кроме того, для усиления иммунного ответа используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут кровь и сыворотку анализируют на титр антитела против INSP201.

Моноклональные антитела, направленные против полипептида согласно изобретению, продуцируют любым методом, который позволяет вырабатывать молекулы антитела путем культивирования непрерывной клеточной культуры. Примерами подходящих методов получения моноклональных антител являются гибридомные методы и метод получения человеческой В-клеточной гибридомы. Настоящее изобретение также относится к гибридомным клеточным линиям, продуцирующим моноклональные антитела, реагирующие с полипептидом INSP201.

Моноклональные антитела согласно изобретению могут быть модифицированы для их применения в качестве терапевтических средств. Одним из вариантов является "химерное антитело", в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (L) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности антител, происходящих от конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу, а остальная(ые) цепь(и) идентична(ы) или гомологична(ы) соответствующей последовательности антител, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу. Настоящее изобретение также относится к фрагментам таких антител, при условии, что они обладают нужной биологической активностью.

В другом своем варианте моноклональное антитело согласно изобретению является "гуманизованным" антителом. Вообще говоря, гуманизованное антитело имеет один или несколько аминокислотных остатков, введенных в это антитело из источника, не относящегося к человеку. Гуманизация может быть осуществлена, например, методами, известными специалистам, путем замены по меньшей мере одной части гипервариабельной области грызунов соответствующими областями человеческого антитела.

Термин "антитело" или "иммуноглобулин" охватывает как поликлональное, так и моноклональное антитело. Предпочтительным антителом является моноклональное антитело, реагирующее с антигеном.

Термин "антитело" также включает смеси более чем одного антитела, реагирующего с антигеном (например, смесь моноклональных антител различных типов, реагирующих с антигеном). Термин "антитело" также включает полноразмерные антитела, их биологически функциональные фрагменты, одноцепочечные антитела и генетически модифицированные антитела, такие как химерные антитела, содержащие части антител более чем одного вида, бифункциональные антитела, конъюгаты антител, гуманизованные и человеческие антитела. Биологически функциональными фрагментами антител, которые также могут быть использованы, являются пептидные фрагменты антитела, достаточные для связывания с антигеном.

Используемый здесь термин "антитело" включает полноразмерное антитело, а также любые его фрагменты (например, F(ab')2, Fab', Fab, Fv), способные связываться с представляющими интерес эпитопами, антигенами или антигенными фрагментами.

Термин "очищенное антитело" означает антитело, которое, в основном, не содержит других белков, углеводов и липидов, с которыми оно обычно ассоциируется в природе. Такое антитело "преимущественно связывается" с полипептидами INSP201 согласно изобретению (или с его антигенным фрагментом), то есть, в основном, не распознает и не связывается с другими антигенно неродственными молекулами. Очищенное антитело согласно изобретению является предпочтительно иммунореактивным с INSP201 конкретного вида и обладает иммунной специфичностью к INSP201 конкретного вида, а более предпочтительно является иммуноспецифичным к нативному человеческому INSP201.

Термин "специфически связывается" означает, что данное антитело связывается со специфическим полипептидом, то есть INSP201, с высокой авидностью и/или высокой аффинностью. Связывание антитела со своим эпитопом на этом специфическом полипептиде предпочтительно является более сильным, чем связывание того же самого антитела с любым другим эпитопом. Антитела, которые специфически связываются с INSP201, могут связываться и с другими полипептидами на более низком, но еще детектируемом уровне (например, на уровне, составляющем 10% или менее от уровня связывания, наблюдаемого для представляющего интерес полипептида). Такое слабое связывание или фоновое связывание можно легко дифференцировать от специфического связывания антитела с представляющим интерес соединением или полипептидом, например, с использованием соответствующего контроля.

Предпочтительно аффинность антитела по отношению к полипептиду согласно изобретению по меньшей мере в 1,5, 2,5, 10, 100, 103, 104, 105, 106 или более раз превышает аффинность по отношению к другим известным членам семейства INSP201.

Термин "генетически модифицированные антитела" означает антитела, аминокислотная последовательность которых отличается от последовательности нативного антитела. Благодаря релевантности методов рекомбинантных ДНК согласно изобретению, нет необходимости ограничиваться последовательностями аминокислот, обнаруживаемых в природных антителах, то есть антитела могут быть реконструированы для сообщения им желательных свойств. Возможными изменениями является множество замен, которые варьируются в пределах от замены только одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции, например, вариабельной или константной области. Вообще говоря, для улучшения или изменения других свойств, таких как фиксация комплемента, взаимодействие с мембранами или другие эффекторные функции, могут быть сделаны модификации в константной области. Для улучшения антигенсвязывающих свойств могут быть сделаны модификации в вариабельной области.

Термин "гуманизованное антитело" или "гуманизованный иммуноглобулин" означает иммуноглобулин, содержащий человеческую каркасную область, и по меньшей мере одну, а предпочтительно все гипервариабельные области (CDR), происходящие от нечеловеческого антитела, где любая присутствующая в иммуноглобулине константная область, по существу, по меньшей мере примерно на 85-90%, а предпочтительно по меньшей мере на 95%, идентична константной области человеческого иммуноглобулина. Следовательно, все части гуманизованного иммуноглобулина, возможно, за исключением CDR, по существу идентичны соответствующим частям одной или нескольких нативных последовательностей человеческого иммуноглобулина. См., например, Queen et al., патенты США №№ 55301101; 5585089;

5693762 и 6180370 (каждый из которых во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки).

"Полностью гуманизованные антитела" представляют собой молекулы, содержащие вариабельную и константную область человеческого иммуноглобулина. Полностью гуманизованные антитела могут быть использованы в терапии, где их повторное введение необходимо для лечения хронических и рецидивирующих заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания. Один из методов получения полностью человеческих антител заключается в "гуманизации" мышиной гуморальной иммунной системы, то есть в продуцировании мышиных штаммов, способных вырабатывать человеческий Ig (Xenomice), путем введения локусов человеческого иммуноглобулина (Ig) мыши, у которой были инактивированы эндогенные гены Ig. Области Ig являются исключительно сложными по своей физической структуре, и для конечного продуцирования иммунного ответа широкого ряда необходимо осуществление процессов реаранжировки и экспрессии генов. Разнообразие антител, главным образом, генерируется путем комбинаторной реаранжировки различных генов V, D и J, присутствующих в локусах Ig. Такие локусы также содержат чередующиеся регуляторные элементы, осуществляющие регуляцию экспрессии антител, аллельное исключение, переключение классов и созревание аффинности. Введение неаранжированных трансгенов человеческих Ig-трансгенов мышам продемонстрировало, что мышиный механизм рекомбинации совместим с механизмом рекомбинации человеческих генов. Кроме того, гибридомы, секретирующие антигенспецифические человеческие mAb различных изотипов, могут быть получены путем иммунизации мышей Xenomice антигеном.

Полностью гуманизованные антитела и методы их получения известны специалистам (Mendez et al., Nature Genetics 15:14 6-156 (1997); Buggemann et al., Eur. J. Immunol. 21:1323-1326 (1991); Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:722-727 (2000), заявка на патент WO 98/24893).

Термин "химерное антитело" означает антитело, в котором константная область происходит от антитела одного вида (обычно человеческого антитела), а вариабельная область происходит от антитела другого вида (обычно антитела грызуна). Следовательно, химерные антитела представляют собой молекулы, различные части которого происходят от животных различных видов, таких как молекулы, имеющие вариабельную область, происходящую от мышиного Mab и константную область человеческого иммуноглобулина. Так, например, при использовании мышиных Mab, достигаются более высокие выходы из гибридов, но при этом наблюдается более высокая иммуногенность у человека, а поэтому для снижения иммуногенности и для увеличения выхода продукта, главным образом, используются химерные антитела, такие как человеческие/мышиные химерные Mab. Химерные антитела и методы их получения известны специалистам (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125023 (опубликованная 14 ноября, 1984); Neuberger et al., Nature 314:268- (1985); Taniguchi et al., Европейская патентная заявка 171496 (опубликованная 19 февраля, 1985); Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494 (опубликованная 5 марта, 1986); Neuberger et al., заявка РСТ WO 8601533 (опубликованная 13 марта, 1986); Kudo et al., Европейская патентная заявка (опубликованная 11 июня, 1986); Sahagan et al., J. immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson et al., Международная патентная заявка № WO 8702671 (опубликованная 7 мая, 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); Riechmann et al., Nature 332:323-327; и Harlow & Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, см. выше. Эти публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Используемый здесь термин "фрагмент антитела" означает молекулу, содержащую часть антитела, способного специфически связываться с антигеном, антигенной детерминантой или эпитопом. Следует отметить, что Fab и F(ab)2 и другие фрагменты антител, используемых в настоящем изобретении, могут быть использованы для детектирования и количественной оценки их антигенов методами, описанными здесь для молекул интактных антител. Такие фрагменты обычно получают путем протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов).

Что касается упомянутых здесь антител, то термин "моноклональное антитело" включает моноклональные антитела, химерные антитела, полностью гуманизованные антитела, антитела против антиидиотипических антител (анти-анти-Id антитела), которые могут быть помечены в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, полученные любыми известными методами, такими как, но не ограничивающимися ими, ферментативное расщепление, пептидный синтез или методы рекомбинантных ДНК.

Моноклональные антитела представляют собой, по существу, гомогенную популяцию антител, специфичных к антигенам, где указанные популяции содержат, в основном, аналогичные эпитопсвязывающие сайты. Mab могут быть получены методами, известными специалистам. См., например, работы Kohler G.

& Milstein С, Nature 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; Ausubel et al., eds., Harlow & Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988); и Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publisching Assoc. and Wiley Interscience, N.Y. (1992-1996), содержание которых во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Такие антитела могут принадлежать к иммуноглобулинам любого класса, включая IgG, IgM, IgE, IgA, GILD и любого подкласса. Гибридома, продуцирующая mAb согласно изобретению, может быть культивирована in vitro, in situ или in vivo. Благодаря продуцированию высоких титров Mab in vivo или in situ, этот метод получения является предпочтительным. Термин "моноклональное антитело" также означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие, например, как Fab и F(ab')2, способные связываться с антигеном. Fab и F (ab')2-фрагменты не содержат Fc-фрагмента интактного антитела, более быстро выводятся из кровотока и могут обладать способностью к менее неспецифическому связыванию с тканями, чем интактное антитело (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Считается, что моноклональное антитело "способно связываться" с молекулой, если оно способно специфически реагировать с указанной молекулой, и если такая реакция приводит к связыванию данной молекулы с антителом.

"Антиген" представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться с антителом, где указанный антиген, кроме того, обладает способностью индуцировать у животного вырабатывание антитела, способного связываться с эпитопом такого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Упомянутый выше термин "специфическая реакция" означает, что указанное антитело реагирует с высокой степенью селективности с эпитопом на соответствующем антигене, но не с множеством других антигенов, индуцирующих вырабатывание других антител.

Эти антитела, включая фрагменты антител, используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для количественной или качественной оценки их антигенов в образце, или для детектирования присутствия клеток, экспрессирующих свои антигены. Такая оценка может быть осуществлена иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно меченого антитела (см. ниже) в комбинации с флуоресцентной микроскопией, проточной цитометрией или флуориметрического детектирования.

Антитела (или их фрагменты), используемые в настоящем изобретении, могут быть применены для гистологического анализа, а также в иммунофлуоресцентной или иммуноэлектронной микроскопии, для in situ детектирования их антигенов. Детектирование in situ может быть осуществлено путем забора гистологического образца у пациента и обработки такого образца меченым антителом согласно изобретению. Это антитело (или фрагмент) предпочтительно добавляют к биологическому образцу, либо на этот биологический образец наносят меченое антитело (или его фрагмент). Путем осуществления такой процедуры может быть определено не только присутствие данных антигенов, но также и их распределение в рассматриваемой ткани. Для среднего специалиста совершенно очевидно, что для осуществления in situ детектирования с помощью настоящего изобретения могут быть применены любые модифицированные методы гистологических анализов (таких как процедуры окрашивания) широкого ряда.

Такие анализы на присутствие антигенов обычно включают инкубирование биологического образца, такого как биологические жидкости, тканевые экстракты, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, которые были инкубированы в тканевой культуре в присутствии меченого антитела, способного идентифицировать антигены, и детектирование антитела любыми методами, хорошо известными специалистам.

Биологический образец может быть иммобилизован на твердофазной подложке или на носителе, таком как нитроцеллюлоза, или на другой твердофазной подложке или на другом носителе, способном иммобилизовывать клетки, клеточные частицы или растворимые белки. Затем такая подложка или носитель могут быть промыты подходящими буферами, а затем обработаны меченым антителом согласно изобретению, как было упомянуто выше. Затем твердофазная подложка или носитель могут быть промыты буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество несвязанной метки на указанной твердой подложке или на носителе может быть затем оценено стандартными методами.

Молекула антитела согласно изобретению может быть адаптирована для использования в иммунометрическом анализе, также известном как "двухсайтовый" или "сэндвич"-анализ. В типичном иммунометрическом анализе, определенное количество немеченого антитела (или фрагмента антитела) иммобилизуют на твердой подложке или на твердом носителе и добавляют определенное количество детектируемо меченого растворимого антитела, что позволяет детектировать и/или количественно оценивать трехкомпонентный комплекс, образованный антителом, иммобилизованном на твердофазном носителе, антигеном и меченым антителом.

Антитела согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с методами иммуноаффинной хроматографии. Более конкретно, такие антитела могут быть помещены на поверхность материала в хроматографической колонке. Затем, очищаемая композиция может быть пропущена через указанную колонку. Если очищаемый образец включает любые полипептиды INSP201, которые связываются с антителами, то такие полипептиды INSP201 могут быть удалены из образца, а затем очищены.

Следовательно, в целом, методы диагностики могут быть осуществлены in vitro с использованием клеточного образца (например, пробы крови, биоптата лимфоузлов или ткани), выделенного у млекопитающего, либо они могут быть осуществлены путем in vivo визуализации.

Композиции, содержащие антитела согласно изобретению, могут быть использованы для детектирования присутствия INSP201, например, с помощью радиоиммуноанализа, ELISA, FACS и т.п. Одна или несколько молекул-меток могут быть присоединены к гуманизованному иммуноглобулину. Примерами молекул-меток являются красители, непроницаемые для рентгеновских лучей, рентгеноконтрастное вещество, флуоресцентные молекулы, спин-меченые молекулы, ферменты и другие молекулы-метки, используемые в диагностике, а в частности, в радиологических методах или в методах визуализации с помощью магнитного резонанса.

Препараты антител IgG согласно изобретению могут быть преимущественно выделены из антисыворотки согласно изобретению путем аффинной очистки, предпочтительно посредством G-белокиммунопреципитации. Антисыворотка, полученная от иммунизованного животного, может быть использована для детектирования с оптимальной чувствительностью посредством вестерн-иммуноблот-анализа, иммунопреципитации и ELISA-анализа полипептидов INSP201.

В общих чертах, очищенное антитело или фрагмент антитела согласно изобретению, способное(ый) специфически связываться с антигеном-мишенью, обычно являются оптимальными с точки зрения репродуцируемости, стандартизации или точности детектирования по сравнению с неочищенным препаратом согласно изобретению.

Для среднего специалиста в данной области очевидно, что указанное антитело или фрагмент, имеющее(ий) аффинность, определяемую константой диссоциации, составляющей до 10-12 для когнатного антигена, может быть получено стандартными методами.

Как было описано выше, указанный препарат может преимущественно содержать антитело или фрагмент антитела, присоединенные к детектируемой молекуле любого типа.

Фрагмент антитела имеет то преимущество, что его размер меньше, чем размер родительского антитела, от которого он происходит, но при этом он сохраняет, по существу, такую же специфичность связывания с антигеном-мишенью, либо такую же специфичность и аффинность связывания, как родительское антитело. Таким образом, благодаря тому, что фрагмент антитела имеет меньший размер, чем родительское антитело, он будет, в основном, иметь гораздо лучшее биологическое распределение в ткани и лучшие диффузные свойства (например, в системе in vivo или в выделенных тканях), чем родительское антитело. Фрагмент антитела, в котором, по существу, отсутствует Fc-область, такой как одноцепочечный Fv-, Fab'-, Fab- и F(ab')2-фрагмент или CDR, является предпочтительным для использования в - 15 целях обработки данного препарата молекулой, способной специфически связываться с такой Fcобластью, и в тех случаях когда такое связывание является нежелательным. Обычно такими случаями являются нежелательное связывание Fc-области с когнатным Fc-рецептором, или связывание Fc-области с компонентом комплемента (например, с компонентом Clq комплемента, присутствующего в сыворотке). Fc-рецепторы присутствуют на поверхности иммунных клеток многих типов, включая специализированные АПК, такие как дендритные клетки; В-лимфоциты и гранулоциты, такие как нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты, макрофаги и тучные клетки. Таким образом, отсутствие Fc-области во фрагменте антитела может быть особенно предпочтительным для предотвращения нежелательной активации иммунных клеток, опосредуемой Fc-рецептором, или нежелательного каскада реакций активации комплемента, опосредуемых компонентом комплемента, а в частности, при введении указанного препарата индивидууму in vivo.

F(ab')2 представляет собой фрагмент молекулы антитела, содержащий двухвалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела.

F(ab')2-препарат согласно изобретению может быть соответствующим образом получен стандартными методами путем обработки указанного препарата антитела, такого как антисыворотка согласно изобретению, ферментом пепсином. Полученный F(ab')2-продукт представляет собой частицу 5S.

Fab- или Fab' представляет собой фрагмент молекулы антитела, содержащий одновалентную антигенсвязывающую часть молекулы антитела.

CDR может быть генерирована, как описано в ЕР0585939 или как описано у Strandberg et al. (Protein Eng. 2001 Jan; 14 (1):67-74). CDR согласно изобретению может представлять собой модифицированную CDR, которая оказывает значительное влияние на модуляцию полипептида INSP201. Методы модификации активных пептидов описаны, например Sawa et al. 1999 (J. Med. Chem. 42, 3289-3299).

Fab'-препарат согласно изобретению может быть легко получен стандартными методами путем обработки антителосодержащего препарата согласно изобретению ферментом пепсином с последующим проведением реакции восстановления с получением F(ab')2. Такое восстановление может быть осуществлено с использованием тиолового восстановителя и с использованием, но необязательно, группы, блокирующей сульфгидрильные группы, полученные в результате расщепления дисульфидных связей. В результате такой обработки получают два моновалентных 3,5S Fab-фрагмента и Fc-фрагмента.

Fab-препарат может быть легко получен стандартными методами путем обработки антителосодержащего препарата согласно изобретению, такого как антисыворотка согласно изобретению, ферментом папаином с получением интактной легкой цепи и части тяжелой цепи, состоящей из вариабельного домена и CH1-домена.

Полное описание генерирования фрагмента антитела путем ферментативной обработки антитела имеется в специальной литературе (см., например, Goldenberg, патенты США №№ 4036945 и 4331647;

Porter R.R., 1959. Biochem J. 73:119-126).

Одноцепочечный Fv-фрагмент (также обозначаемый в литературе scFv) представляет собой одноцепочечную молекулу, включающую вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи, соединенные подходящим полипептидным линкером.

F(ab')2-, Fab'-, Fab-, scFv- или CDR-препарат согласно изобретению может быть получен методами рекомбинантных ДНК.

Рекомбинантный фрагмент антитела получают путем выделения мРНК из В-лимфоцитов животных, иммунизованных антигеном-мишенью; продуцирования кДНК из мРНК посредством ОТ-ПЦР; и использования указанной кДНК для конструирования библиотеки фагового представления фрагментов антитела. В-лимфоциты могут быть соответствующим образом выделены из селезенки или, альтернативно, из крови, костного мозга или лимфатических узлов иммунизованного животного.

При этом следует отметить, что вышеописанная методика может быть применена для получения препарата, содержащего фрагмент моноклонального антитела согласно изобретению, обладающий, по существу, любой желательной аффинностью и/или специфичностью связывания с антигеном-мишенью.

Такой препарат может быть использован в различных целях, при которых предпочтительно использовать реагент, способный связываться с антигеном-мишенью с определенными параметрами связывания.

Поскольку Fab' имеет структуру, по существу аналогичную структуре Fab, то препарат настоящего изобретения, содержащий Fab', может быть использован, в основном, в таких же целях, как препарат, содержащий Fab, где указанные Fab'- и Fab-фрагменты содержат по существу аналогичные вариабельные области тяжелой и легкой цепи. В данном случае, в зависимости от конкретного применения, препарат согласно изобретению, содержащий фрагмент антитела, способный связываться с антигеном-мишенью с максимальной аффинностью, то есть F (ab)2-препарат, согласно изобретению может обладать значительно большим преимуществом по сравнению с Fab-, Fab'- или scFv-препаратами согласно изобретению, поскольку, в отличие от одновалентного связывания указанного одновалентного фрагмента антитела, F (ab)2-препарат обладает двухвалентным связыванием с антигеном-мишенью.

Как было упомянуто выше, в зависимости от применения и цели этого применения, препарат, содержащий антитело или его фрагмент, может быть получен от млекопитающего любого вида.

Препарат, содержащий антитело или его фрагмент согласно изобретению, происходящих от млекопитающего нужного вида, может быть выделен из сыворотки животного такого вида, иммунизованного антигеном-мишенью.

Препарат согласно изобретению, содержащий человеческое или гуманизованное антитело или его фрагмент, может быть предпочтительным для его применения, предусматривающего введение препарата индивидууму. Так, например, человеческое или гуманизованное антитело или его фрагмент обычно имеют оптимальную иммунологическую переносимость, а поэтому они имеют оптимальное время полужизни in vivo у человека и тем самым обладают оптимальной эффективностью. Дополнительное описание получения и применения человеческих или гуманизованных антител приводится ниже.

Данный препарат может быть использован per se, либо он может быть получен в виде активного ингредиента, входящего в состав фармацевтической композиции.

Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и, в качестве активного ингредиента, антитело или фрагмент антитела согласно изобретению.

Способы получения фармацевтической композиции, содержащей антитело или его фрагмент согласно изобретению в качестве активного ингредиента, и способы применения такой фармацевтической композиции описаны ниже.

Доставку антитела или его фрагмента предпочтительно осуществляют путем введения фармацевтической композиции согласно изобретению, содержащей антитело или его фрагмент согласно изобретению в качестве активного ингредиента.

Указанное антитело или его фрагмент предпочтительно вводят в целях достижения уровня фрагмента антитела, связанного с антигеном-мишенью, достаточного для достижения желательной регуляции биохимической активности.

Средний специалист в данной области, такой как лечащий врач, а более предпочтительно врачспециалист по данному заболеванию, может самостоятельно провести требуемое обследование в целях определения подходящей схемы терапии, включая подходящий способ введения и подходящую дозу антитела или его фрагмента, эффективную для лечения заболевания в соответствии с настоящим изобретением.

Как было описано выше, антиген-мишень (то есть INSP201), который представляет собой полипептид, может быть получен различными способами.



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«ИНФОРМАТИКА 2007 июль-сентябрь №3 УДК 528.8 (15):629.78 Б.И. Беляев ИССЛЕДОВАНИЯ ОПТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЗЕМЛИ С ПИЛОТИРУЕМЫХ ОРБИТАЛЬНЫХ СТАНЦИЙ Описываются многолетние исследования природных образований Земли из космоса в оптическом диапазоне длин волн. Рассматриваются приборы для изучения земной поверхности из космоса спектральными методами. Оценивается влияние различных факторов, формирующих спектральное распределение уходящей радиации, и условий освещения на результаты космической...»

«И.М.Лифиц СТАНДАРТИЗАЦИЯ, МЕТРОЛОГИЯ И СЕРТИФИКАЦИЯ УЧЕБНИК Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальностям Коммерция, Маркетинг, Товароведение и экспертиза товаров 5-е издание, переработанное и дополненное МОСКВА • ЮРАЙТ • 2005 УДК 389 ББК 30.10ц; 65.2/4-80я73 Л64 Рецензенты: М.А. Николаева — доктор технических наук, профессор, действительный член Международной академии информатизации: Г.Н....»

«Научное обоснование развития сети особо охраняемых природных территорий в Республике Карелия Карельский научный центр Российской академии наук Научное обоснование развития сети особо охраняемых природных территорий в Республике Карелия Петрозаводск 2009 УДК 502.172 (470.22) ББК 20.18 (2Рос. Кар.) Н 34 Научное обоснование развития сети особо охраняемых природных территорий в Республике Карелия. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2009. 112 с.: ил. 14, табл. 6. Библиограф. 96 назв. ISBN...»

«Московская городская педагогическая гимназия-лаборатория №1505 Курсы по выбору – одна из форм организации учебно-познавательной и учебноисследовательской деятельности гимназистов Сборник авторских программ педагогического коллектива гимназии Под ред. канд. пед. наук, ст.н.с. Кучер Т.В. Москва, 2005 г. Настоящий сборник представляет собой пятый выпуск, подготовленный коллективом Московской городской педагогической гимназии-лаборатории №1505 при поддержке. Его содержание – продолжение реализации...»

«Министерство образования и науки РФ Новокузнецкий институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет Факультет информационных технологий Кафедра математики и математического моделирования УТВЕРЖДАЮ Декан факультета информационных технологий Каледин В.О. _ _20_ г. Рабочая программа дисциплины (модуля) Б2.Б.5 Физика (Наименование дисциплины (модуля) Направление подготовки 010400....»

«7 СРГ ПДООС НЕ ДЛЯ ПУБЛИКАЦИИ И РАСПРОСТРАНЕНИЯ Перевод с английского языка СВЯЗЫВАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ С РЕЗУЛЬТАТАМИ Практика и перспективы совершенствования показателей природоохранной контрольно-надзорной деятельности в России 10 октября 2005 г. Цель настоящего доклада заключается в анализе той роли, которую играют показатели контрольно-надзорной деятельности (КНД) в достижении целей экологической политики в Российской Федерации. В нем характеризуется система показателей КНД России, обсуждаются...»

«Федеральное агентство по образованию Владивостокский государственный университет экономики и сервиса В.М. ГРИНЯК, Е.И. КОГАЙ ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ УПРАВЛЕНИЯ ТОРГОВЛЕЙ Практикум Владивосток Издательство ВГУЭС 2010 ББК 65.01 Г 85 Рецензенты: П.В. Зиновьев, доцент кафедры ММ, ДВГТУ; С.М. Моисеев, директор фирмы Созвездие, г. Владивосток Гриняк, В.М., Когай, Е.И. ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ УПГ 85 РАВЛЕНИЯ ТОРГОВЛЕЙ [Текст] : практикум. – Владивосток : Изд-во ВГУЭС, 2010. – 152 с. Рассмотрены...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет Факультет гуманитарный Кафедра иностранных языков УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Б1. Б2 Иностранный язык (английский) (код и название дисциплины по учебному плану направления) Для направления 010400.62 Прикладная математика и информатика (код и название направления) Цикл дисциплин учебного...»

«Мультиварка RMC-M150 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ www.multivarka.pro УВАЖАЕМЫЙ ПОКУПАТЕЛЬ! Благодарим вас за то, что вы отдали предпочтение бытовой технике REDMOND. REDMOND — это качество, надежность и неизменно внимательное отношение к потребностям наших клиентов. Надеемся, что вам понравится продукция нашей компании, и вы также будете выбирать наши изделия в будущем. Мультиварка REDMOND RMC-M150 — современный много- Чтобы вы могли быстрее освоить технику приготовления в функциональный прибор...»

«М И Р программирования р. ХАГГАРТИ Дискретная математика для программистов Перевод с английского под редакцией С. А. Кулешова с дополнением А. А. Ковалева Допущено УМО вузов РФ по образованию в области прикладной математики в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению подготовки Прикладная математика ТЕХНОСФЕРА Москва 2003 p. Хаггарти Дискретная математика для программистов Москва: Техносфера, 2003. - 320с. ISBN 5-94836-016-4 Элементарное...»

«Акбилек Е.А. АСОУ К вопросу о реферировании при обучении иностранному языку. В настоящее время при обучении иностранному языку все больше внимания уделяется работе с иноязычными печатными источниками информации. Чтение и обработка специальных иностранных текстов становится крайне необходимым в современных условиях. Умение работать с литературой – одно из базовых умений, лежащих в основе любой профессиональной деятельности, так как чтение служит основным источником получения информации....»

«Министерство образования и науки РФ Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тобольский государственный педагогический институт им. Д. И. Менделеева Кафедра зоологии, экологии и природопользования Утверждена на заседании кафедры протокол № 1 от 30.09 2008 года УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ПО ДИСЦИПЛИНЕ БИОЛОГИЯ С ОСНОВАМИ ЭКОЛОГИИ Специальность 050201.65- Математика Профиль Алгебра и геометрия Программу составила: к....»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ МОСКОВСКИЙ ИНСТИТУТ ЭЛЕКТРОНИКИ И МАТЕМАТИКИ НАЦИОНАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ ФАКУЛЬТЕТ ИНФОРМАТИКИ И ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОЙ ТЕХНИКИ УТВЕРЖДЕНО на заседании Ученого совета МИЭМ НИУ ВШЭ председатель Ученого совета _ А.Н.Тихонов 01 октября 2013 г. протокол № ОТЧЕТ по результатам самообследования...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра образования Российской Федерации В.Д. Шадриков 14 марта 2000 г. Номер государственной регистрации: 52 мжд / сп ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ Специальность 351400 ПРИКЛАДНАЯ ИНФОРМАТИКА (по областям) Квалификация информатик-(квалификация в области) В соответствии с приказом Министерства образования Российской Федерации от 04.12.2003 г. №4482 код данной специальности по...»

«Международный консорциум Электронный университет Московский государственный университет экономики, статистики и информатики Евразийский открытый институт П.В. Бахарев Арбитражный процесс Учебно-практическое пособие Москва 2008 УДК – 347.9 ББК – 67.410 Б – 30 Бахарев П.В. АРБИТРАЖНЫЙ ПРОЦЕСС: Учебнометодический комплекс. – М.: Изд. центр ЕАОИ, 2008. – 327 с. ISBN 978-5-374-00077-1 © Бахарев П.В., 2007 © Евразийский открытый институт, 2007 2 Оглавление Предисловие Раздел 1. Структура арбитражных...»

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАТИКИ И РАДИОЭЛЕКТРОНИКИ В. Л. Ланин, А. П. Достанко, Е. В. Телеш ФОРМИРОВАНИЕ ТОКОПРОВОДЯЩИХ КОНТАКТНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ИЗДЕЛИЯХ ЭЛЕКТРОНИКИ Минск “Издательский центр БГУ” 2007 2 УДК 621.791.3: 621.396.6 ББК 34.64 Р е ц е н з е н т ы: Член-корр. НАН Беларуси, д-р. техн. наук, профессор ВА. Пилипенко; д-р. техн. наук, профессор С.П. Кундас Ланин, В. Л. Формирование токопроводящих контактных соединений в изделиях электроники / В.Л. Ланин, А. П....»

«Российская Академия Образования Институт Социологии Образования СОцИОлОгИя ОбРАзОвАнИя Под редакцией В.С. Собкина Москва, 2009 УДК 301 ббК 60.59 С 54 научное направление РАО Социокультурные проблемы современного образования Печатается по решению Ученого Совета Учреждения Российской академии образования Института социологии образования РАО научный редактор В.С. Собкин Рецензенты доктор психологических наук, профессор К.Н. Поливанова доктор психологических наук, профессор Б.Д. Эльконин Социология...»

«Министерство образования и науки РФ Новокузнецкий институт (филиал) федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет Факультет информационных технологий Кафедра математики и математического моделирования УТВЕРЖДАЮ Директор В.С. Гершгорин _20г. УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Б2.Б.1.4 ДИСКРЕТНАЯ МАТЕМАТИКА Для направления 230100.62 Информатика и вычислительная техника Квалификация (степень)...»

«Федеральное государственное образовательное бюджетное учреждение высшего профессионального образования ПОВОЛЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТЕЛЕКОММУНИКАЦИЙ И ИНФОРМАТИКИ РУКОВОДЯЩИЙ РД ПГУТИ 2.35.7 – 2013 (версия 2) ДОКУМЕНТ Система управления качеством образования РЕЙТИНГОВАЯ ОЦЕНКА ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРОФЕССОРСКО-ПРЕПОДАВАТЕЛЬСКОГО СОСТАВА Положение Самара РД ПГУТИ 2.35.7 – 2013 (версия 2) Рейтинговая оценка деятельности профессорско-преподавательского состава. Положение Предисловие 1 РАЗРАБОТАН...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Сыктывкарский государственный университет Институт гуманитарных наук УТВЕРЖДАЮ _2011г. Рабочая программа дисциплины Русский язык и культура речи Направление подготовки: 010400 Прикладная математика и информатика Квалификация (степень) выпускника: бакалавр по направлению подготовки 010400 Прикладная математики и информатика Форма обучения очная Сыктывкар 2011 1. Цели освоения дисциплины Дисциплина Русский язык и культура речи нацелена прежде...»






 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.