WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания клеточной поверхности, ...»

-- [ Страница 1 ] --

010420

Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, а также к использованию этих белков и нуклеотидных последовательностей

генов, кодирующих эти белки, для диагностики, предупреждения и лечения заболеваний, например для

диагностики, предупреждения и лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени или печеночной недостаточности.

Все цитированные в настоящем описании публикации, патенты и патентные заявки приведены в качестве ссылки в полном объеме.

Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков согласно изобретению, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеристике других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Недавно заявителем согласно изобретению был разработан превосходный способ оценки последовательностей с неизвестной функцией. Этот способ представляет собой систему генерирования базы данных, называемую поисковой базой данных Biopendium, которая рассматривается в WO 01/69507. Эта система базы данных состоит из общего источника данных, созданного с использованием запатентованной технологии, и содержащего информацию, полученную в результате всестороннего сравнения всех имеющихся последовательностей белков или нуклеиновых кислот.

Помимо объединения данных об этих последовательностях, взятых из отдельных источников, необходимо также объединить как можно больше данных, относящихся как к самим последовательностям, так и к соответствующей информации для каждой последовательности, в один общий источник. Для этого все имеющиеся данные, относящиеся к каждой последовательности, включая данные о трехмерной структуре кодированного белка, если они имеются, суммируют в одно целое, что позволяет наилучшим образом использовать данные, имеющиеся для каждой последовательности, и таким образом, дает возможность сделать в высокой степени обоснованный прогноз, исходя из сравнения этих последовательностей. Комментарии, которые имеются в указанной базе данных и приводятся для каждой последовательности, дают информацию о данных последовательностях в нужном биологическом аспекте.

Такой источник данных дает возможность точно предсказать функцию белка, исходя из отдельно взятой последовательности. С использованием стандартной технологии можно проводить оценку лишь тех белков, последовательности которых в высокой степени идентичны (выше примерно 20-30% идентичности) последовательностям других белков одного и того же функционального семейства. При этом невозможно предсказать функции белков, которые имеют очень низкую степень гомологии с последователями других родственных белков с известной функцией.

Белки, содержащие сигнальный пептид Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида.

Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембраносвязанный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые доставляются в секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами сигнального пептида, который играет главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса, адгезивные молекулы, рецепторы, протеазы и факторы роста и дифференцировки.

-1Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены Было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, играют определенную роль в различных физиологических функциях, и многие из них могут играть определенную роль в патологических процессах. Изменение их активности означает изменение фенотипа заболевания, поэтому такая идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, является крайне необходимой, поскольку указанные молекулы могут играть определенную роль во многих заболеваниях, в частности, в воспалительных, онкологических и в сердечно-сосудистых заболеваниях. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, участвуют в различных биологических процессах, включая эмбриогенез (Martin-Bermudo, M.D. et al., Development. 2000 127 (12): 2607-15;

Chen, L.M., et al., J Neurosci. 2000 20 (10): 3776-84; Zweegman, S., et al., Exp Hematol. 2000 28 (4): 401-10;

Darribere, Т., et al., Biol Cell. 2000 92(1): 5-25), сохранение целостности тканей (Eckes, В., et al., J Cell Sci.

2000 113(Pt 13): 2455-2462; Buckwalter, J.A., et al., Instr Course Lect. 2000 49: 481-9; Frenette, P.S., et al., J Exp Med. 2000 191(8): 1413-22; Delmas, V., et al., Dev Biol. 1999 216(2): 491-506; Humphries, M.J., et al., Trends Pharmacol Sci. 2000 21(l): 29-32; Miosge, N., et al., Lab Invest. 1999 79(12): 1591-9; Nagaoka T, et al., Am J Pathol 2000 M 157: 1 237-47; Nwariaku F.E., et al., J Trauma 1995 39(2): 285-8; Zhu X, et al., Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1): 53-5), экстравазация лейкоцитов/воспаления (Lim, L.H., et al., Am J Respir Cell Mol Biol. 2000 22(6): 693-701; Johnston, В., et al., Microcirculation. 2000 7(2): 109-18;

Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23 (10): 868-73; Chcialowski, A., et al., Pol Merkuriusz Lek. 7(43): 13-7; Rojas, A.I., et al., Grit Rev Oral Biol Med. 1999 10 (3): 337-58; Marinova-Mutafchieva, L., et al., Arthritis Rheum. 2000 43 (3): 638-44; Vijayan, K.V., et al., J Clin Invest. 2000 105(6): 793-802; Currie, A.J., et al., J Immunol. 2000 164 (7): 3878-86; Rowin, M.E., et al., Inflammation. 2000 24(2): 157-73; Johnston, В., et al., J Immunol. 2000 164 (6): 3337-44; Gerst, J.L., et al., J Neurosci Res. 2000 59(5): 680-4; Kagawa, T.F., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2000 97(5): 2235-40; Hillan, K.J., et al., Liver. 1999 19 (6): 509-18; Panes, J., 1999 22(10): 514-24; Arao, Т., et al., J Clin Endocrinol Metab. 2000 85(1): 382-9; Souza, H.S., et al., Gut. 45 (6): 856-63; Grunstein, M.M., et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 278(6): L1154-63; Mertens, A.V., et al., Clin Exp Allergy. 1993 23 (10): 868-73; Berends, C, et al., Clin Exp Allergy. 1993 23 (11): 926-33;

Fernvik, E., et al., Inflammation. 2000 24(1): 73-87; Bocchino, V., et al., J Allergy Clin Immunol. 2000 105(1 Pt l): 65-70; Jones S.C., et al., Gut 1995 36(5): 724-30; Liu C.M., et al., Ann Allergy Asthma Immunol 1998 81 (2):

176-80; McMurray R.W., Semin Arthritis Rheum 1996 25(4): 215-33; Takahashi H., et al., Eur J Immunol 22(11): 2879-85; Carlos T., et al., J Heart Lung Transplant 1992 11(6): 1103-8; Fabrega E., et al., Transplantation 2000 69(4): 569-73; Zohrens G., et al., Hepatology 1993 18(4): 798-802; Montefort S., et al., Am J Respir Crit Care, Med 1994 149(5): 1149-52), онкогенез (Orr, F.W., et al., Cancer. 2000 88 (S12): 2912-2918; Zeller, W., et al., J Hematother Stem Cell Res. 1999 8(5): 539-46; Okada, Т., et al., Clin Exp Metastasis. 1999 17(7):

623-9; Mateo, V., et al., Nat Med. 1999 5(11): 1277-84; Yamaguchi, K., et al., J Exp Clin Cancer Res. 19(1): 113-20; Maeshima, Y., et al., J Biol Chem. 2000 275 (28): 21340-8; Van Waes, C., et al., Int J Oncol.

2000 16(6): 1189-95; Damiano, J.S., et al., Leuk Lymphoma.. 2000 38(1-2): 71-81; Seftor, R.E., et al., Cancer Metastasis Rev. 1999 18 (3): 359-75; Shaw, L.M., J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1999 4(4): 367-76; Weyant, M.J., et al., Clin Cancer Res. 2000 6(3): 949-56), ангиогенез (Koch A.E., et al., Nature 1995 376 (6540):

517-9; Wagener С & Ergun S, Exp Cell Res 2000 261(1): 19-24; Ergun S, et al., Mol Cell 2000 5(2): 311-20), резорбция кости (Hartman GD, & Duggan ME, Expert Opin Investig Drugs 2000 9(6): 1281-91; Tanaka Y, et al., J Bone Miner Res 1995 10(10): 1462-9; Lark M.W., et al., J Pharmacol Exp Ther 1999 291(2): 612-7; Raynal C., et al., Endocrinology 1996 137(6): 2347-54; Ilvesaro J.M., et al., Exp Cell Res 1998 242(1): 75-83), неврологическая дисфункция (Ossege L.M., et al., Int Immunopharmacol 2001 1: 1085-100; Bitsch A., et al., Stroke 1998 29: 2129-35; Iadecola С & Alexander M, Curr Opin Neurol 2001 14:89-94; Becker K, et al, Stroke 2001 32(1): 206-11; Relton J.K., et al, Stroke 2001 32(1): 199-205; Hamada Y, et al, J Neurochem 1996 66:

1525-31), тромбогенез (Wang, Y.G., et al., J Physiol (Lond). 2000 526(Pt l): 57-68; Matsuno, H., et al., Nippon Yakurigaku Zasshi. 2000 115 (3): 143-50; Eliceiri, B.P., et al., Cancer J Sci Am. 2000 6(Suppl 3): S245-9; von Beckerath, N., et al., Blood. 2000 95(11): 3297-301; Topol, E.J., et al., Am Heart J. 2000 139(6): 927-33; Kroll, H., et al., Thromb Haemost. 2000 83(3): 392-6) и инвазию бактериальных патогенов в клеткухозяина/адгезию бактериальных патогенов к клетке-хозяину (Dersch P, et al. EMBO J 1999 18(5): 1199Подробная характеристика структуры и функции нескольких семейств молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, послужила стимулом для создания различными фармацевтическими компаниями программ по разработке модуляторов, которые могут быть использованы в целях лечения заболеваний, включая воспалительные, онкологические, нервные, иммунные и сердечно-сосудистые заболевания. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, участвуют фактически в каждой биологической функции, начиная с эмбриогенеза и кончая апоптозом. Они играют важную роль в обеспечении структурной целостности или гомеостаза большинства тканей. Поэтому не удивительно, что дефекты в молекулах распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, приводят к развитию заболеваний, и что многие заболевания возникают в результате модуляции молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Члены этого семейства описаны ниже в табл. 1.

Действительно, семейство молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, включает несколько отдельных семейств. Некоторые из этих семейств представляют особый фармацевтический интерес, который обусловлен тем, что малые молекулы легко поддаются модуляции. Эти семейства включают:

1. Адгезивные молекулы иммуноглобулина, представляющие собой контррецепторы для интегринов, например, внеклеточные адгезивные молекулы (ICAM) и васкулярные клеточно-адгезивные молекулы (VCAM). Члены этого семейства состоят из различного числа глобулярных, иммуноглобулинподобных внеклеточных доменов. Некоторые члены этого семейства, например, PECAM-1 (CD31) и NCAM, опосредуют гомотипическую адгезию. Другие члены этого семейства, например ICAM-1 и VCAM-1, опосредуют адгезию посредством взаимодействия с интегринами.

2. Рецепторы клеточной поверхности для факторов роста. Факторы роста являются внеклеточными молекулами, и они взаимодействуют со специфическими высокоаффинными рецепторами, локализованными на плазматических мембранах клеток-мишеней, с продуцированием биологического эффекта. Молекулярная характеризация различных рецепторов факторов роста показала, что они принадлежат к определенным семействам, а именно, к семейству тирозинкиназных рецепторов, к ассоциированным с Gбелком семидоменным трансмембранным рецепторам, и к серин/треонинкиназным рецепторам. Примерами тирозинкиназных рецепторов фактора роста являются VEGFR, PDGFR, FGFR, CSF-1R и c-KIT, которые также содержат иммуноглобулиновые домены во внеклеточной части. Dys-регуляция функции факторов роста приводит ко многим патологиям различных фенотипов, включая, но не ограничиваясь ими, онкологические заболевания (Bartucci M. et al. (2001) Cancer Res. Sep. 15; 61 (18): 6747-54, Dias S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Sep. 11; 98 (19) :10857-62, Djavan B. et al. (2001) World J. Urol. 19(4):

225-33), воспаление (Fiocchi C. (2001) J. Clin. Invest. Aug. 108(4):523-6, Hodge S. et al., (2001) Respirology Sep; 6(3): 205-211, Fenwick S.A. et al. (2001) J. Anat. Sep; 199(Pt3):231-40), нервные заболевания (Cooper J.D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(18): 10439-44, Fahnestock M. et al. (2001) Mol. Cell. Neurosci.

18 (2) :210-20) и метаболизм (Vickers M.H. et al. (2001) Endocrinology 142(9):3964-73).

Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены -3Таким образом, было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, играют определенную роль в различных физиологических функциях, многие из которых могут играть определенную роль в различных патологических процессах. Изменение их активности влечет за собой изменение патологического фенотипа, а поэтому идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, является в высокой степени необходимой, поскольку эти молекулы могут играть определенную роль в развитии заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, расстройств центральной нервной системы и инфекций.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белки INSP052 и INSP055 функционируют как молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, а более конкретно, как антагонисты цитокинов. Примеры таких молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, приводятся в табл. 1.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (i) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 или SEQ ID NO:26;

(ii) представляет собой фрагмент указанной последовательности, который обладает активностью полипептида (i) или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (i), или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Используемый авторами термин "активность полипептида по п. (i)", означает активность молекулы распознавания, расположенной на клеточной поверхности и содержащей иммуноглобулиновые домены.

Используемый авторами термин "активность молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащей иммуноглобулиновые домены," относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность или структурные особенности, которые могут быть идентифицированы как консервативные признаки, присущие семейству молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены.

Это определение также включает антагонистическую активность по отношению к цитокинам. Термин "антагонист цитокина" означает, что полипептид, его фрагмент или функциональный эквивалент ингибирует активность по меньшей мере одного цитокина. Предпочтительно антагонисты цитокина согласно изобретению могут ингибировать активность цитокина посредством ингибирования экспрессии и/или секреции цитокина. Антагонисты цитокинов, которые ингибируют экспрессию цитокина посредством других механизмов, например посредством связывания с цитокином или цитокиновым рецептором, также входят в объем настоящего изобретения. Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают способностью ингибировать активность более чем одного цитокина.

Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают иммуномодуляторной активностью.

Термин "иммуномодуляторная активность" означает любую активность, детектируемую in vitro или in vivo, которая влияет на иммунный ответ. Примерами иммуномодуляторной активности являются иммуносупрессорная активность, противовоспалительная активность, проапоптотическая активность, антиапоптотическая активность и противоопухолевая активность.

Цитокинами, которые могут ингибироваться антагонистами цитокинов согласно изобретению, являются: TGF-альфа; EGF; члены семейства цитокинов, имеющих структурный мотив в виде пучка из четырех спиралей (такие как IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-13, G-CSF, GM-CSF, CNTF, OSM, EPO, IL-10, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма и M-CSF); члены семейства цитокинов, имеющие структуру с цистиновыми узлами (такие как NGF, TGF-бета, PDGF и VEGF); хемокины (такие как IL-8, MIP-1альфа, MIP-1-бета, MIP-2, PF-4, PBP, I-309/TCA-3, МСР-1, МСР-2, МСР-3 и IP-10), члены семейства цитокинов TNF (таких как TNF-альфа, TNF-бета и LT-бета) и члены семейства цитокинов, имеющие бетаконформацию типа "клеверный лист", включая FGF-альфа, FGF-бета, IL-1-альфа, IL-1-бета и IL-1ra).

Предпочтительные антагонисты цитокинов согласно изобретению ингибируют активность TNF-альфа, IL-4 и/или IL-2.

Цитокины образуют гетерогенное семейство секретируемых полипептидов с относительно низкой молекулярной массой, действующих как регуляторы клеточных взаимодействий со стимуляторами различных типов, в частности, взаимодействий, связанных с воспалительными и иммунными реакциями, а также взаимодействий, связанных с клеточной пролиферацией, репарацией, межклеточными взаимодействиями и дифференцировкой клеток.

Цитокины представлены, главным образом, неферментными гликопротеинами, которые были исторически разделены на несколько групп в соответствии с такими критериями, как гомология последовательностей, структурные элементы, экспрессирующие клетки и/или активность связывания. Примерами таких семейств последовательностей являются интерлейкины, лимфокины, монокины и интерфероны, а также и многие другие последовательности, которые были в последние годы охарактеризованы как молекулы, которые обладают цитокиновой активностью (такие как некоторые факторы роста или хемокины), что затрудняет их исчерпывающую классификацию (Haddad J.J. 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 297:700-13).

Цитокины продуцируются, главным образом, моноцитами, макрофагами и лимфоцитами, а также клетками других типов (такими как лейкоциты, остеобласты, клетки гладкой мышцы, эпителиальные клетки, нейроны, эндотелиальные клетки или фибробласты), но обычно они не продуцируются конститутивно. Цитокины обычно секретируются иммунными клетками в ответ на действие аллергенов (например, бактерий, вирусов или других патогенов), которые могут стимулировать их экспрессию de novo и секрецию из клеток с последующим изменением либо их собственных функций (аутокринных/интракринных эффектов) или функций смежных клеток и локального микроокружения (паракринных/юкстакринных эффектов).

Цитокины действуют на клетки-мишени посредством рецепторов, которые стимулируют различные пути передачи клеточных сигналов (Ishiara K. & Hirano Т. 2002, Biochim Biophys. Acta. 1592:281-296).

Обычно действие цитокинов является плейотропным (один цитокин может обладать несколькими физиологическими эффектами) и избыточным (различные цитокины могут быть ответственны за аналогичные физиологические эффекты), и оно может быть направлено на различные и перекрывающиеся популяции клеток-мишеней.

Наблюдаемые физиологические эффекты цитокинов обусловлены тем фактом, что цитокины, в сочетании с воспалительным ответом, приводящим к мобилизации и агрегации клеток, могут индуцировать (или подавлять) продуцирование многих белков координированным образом, включая продуцирование других цитокинов и/или рецепторов цитокинов. Таким образом, многие физиологические ответы (при физиологических и патологических состояниях) являются результатом взаимосвязанной избыточной сети синергических или антагонистических взаимодействий между цитокинами.

Клонирование и биологические анализы цитокинов и их рецепторов позволяют в общих чертах понять молекулярные механизмы, лежащие в основе их плейотропности и избыточности. Это свойство часто приписывают составу комплексов цитокиновых рецепторов, включающих передающую сигнал рецепторную субъединицу, которая используется всеми членами семейства цитокинов, и связывающую субъединицу, которая является специфичной для каждого цитокина. Таким образом, индуцированный цитокинами каскад передачи сигналов представляет собой механизм, конечный результат которого для конкретной клетки или ткани определяется числом различных сигналов, передаваемых одновременно на клеточную поверхность.

Конкретные детали функционирования цитокиновой сети пока еще точно не известны, но уже очевидно, что цитокины являются важными медиаторами и участвуют в патогенезе различных заболеваний, прямо или опосредованно ассоциированных с природными или адаптивными иммунными ответами. В частности, главные патофизиологические эффекты цитокинов являются результатом их избыточного продуцирования или их продуцирования в нежелательном месте и приводят к индуцированию воспалительного состояния, негативно влияющего на здоровье пациента. Поэтому, в общих чертах, можно сделать вывод, что любой механизм, эффективно ингибирующий один или несколько цитокинов, в частности, провоспалительных цитокинов, может иметь позитивный эффект в лечении человеческих заболеваний, благодаря подавлению неблагоприятного каскада клеточных событий, ассоциированных с нежелательным или пролонгированным продуцированием конкретных цитокинов.

В настоящее время в литературе описан широкий ряд стратегий и соединений, используемых в методах генерирования и/или введения антагонистов цитокинов, блокирующих их воспалительную активность. Неисчерпывающий список таких методов включает использование растворимых вариантов человеческих цитокиновых рецепторов, цитокин-специфических антител, цитокинов, связывающихся с вирусными белками, и небольших молекул, ингибирующих продуцирование цитокинов. Однако существует совсем немного антагонистов цитокинов, доступных для их использования в лечении заболеваний человека. Однако возможное применение других соединений, обладающих фармакологическим действием на клеточно-опосредованные воспалительные процессы посредством модуляции внеклеточных или внутриклеточных путей передачи сигналов, пока еще не подвергалось тщательному исследованию, которое осуществляется в рамках программ поиска лекарственных средств (Stevceva L. 2002, Curr. Med.

Chem. 9: 2201-7; Inagaki-Ohara K. et al. 2003, Curr. Opin. Pharmacol. 3:435-42).

Из представленных ниже примеров очевидно, что внеклеточный домен INSP052 (также называемый INSP052EC) ингибирует секрецию TNF-альфа, IL-4 и IL-2 in vitro в анализе с использованием стимулированных конканавалином А (СопА) человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (hPBMC) и в аналогичном анализе с использованием CD4+-Т-клеток. Кроме того, было обнаружено, что доставка кДНК INSP052EC в in vivo модель молниеносного гепатита приводит к снижению уровней TNF-альфа и m-IL-6 в сыворотке и оказывает значительное влияние на снижение уровней трансаминаз в сыворотке. Этот эффект был подтвержден путем подкожных инъекций белка INSP052EC.

Снижение уровней аспартат-аминотрансферазы (ASAT) и аланин-аминотрансферазы (ALAT) может быть обусловлено снижением уровней TNF-альфа и IL-4. TNF-альфа и IL-4 представляют собой цитокины, играющие важную роль в разрушении печени, индуцированном инъекцией ConA. В этой мышиной модели гепатита TNF-альфа продуцируется, главным образом, макрофагами печени, так называемыми клетками Купфера, a IL-4 продуцируется NK-T-клетками (природными киллерами Т) печени. Было показано, что антитела против TNF-альфа обеспечивают иммунитет против данного заболевания (Seino et al.

2001, Annals of surgery 234, 681), и было показано, что ингибирование продуцирования IL-4 NKTклетками оказывает гепато-протективное действие при Т-клеточноопосредованном гепатите у мышей (Ajuebor et al. 2003 J. Immunology 170, 5259-9).

-6Кроме того, на модели ЛПС-индуцированного высвобождения цитокинов у мышей, было продемонстрировано, что INSP052EC может ингибировать ЛПС-индуцированное высвобождение TNF-альфа или IL-6.

Кроме того, INSP052EC тестировали на гаптен-индуцировнную контактную гиперчувствительность (CHS) на мышиной модели воспалительного заболевания кожи. Авторами настоящей заявки было показано, что INSP052EC способствует значительному и дозозависимому уменьшению опухлости уха у мышей, что позволяет предположить о снижении степени инфильтрации лейкоцитов и последующего воспаления и указывает на то, что INSP052EC может быть использован для лечения Т-клеточноопосредуемого воспаления кожи, такого как аллергический контактный дерматит и псориаз.

В настоящем описании со всей очевидностью продемонстрировано, что выделенный внеклеточный домен INSP052 (INSP052EC) может быть использован (как таковой или как вариант или гибридный белок, содержащий последовательность этого белка, или полноразмерный белок) для модуляции цитокиновой активности, поскольку он может функционировать, в частности, как антагонист секреции и/или экспрессии цитокинов, и может играть терапевтическую роль в лечении заболеваний, прямо или опосредованно ассоциированных с природными и адаптивными иммунными ответами. Эти результаты, полученные с использованием внеклеточного домена INSP052, позволили авторам сделать вывод, что другие варианты полипептида INSP052, а также полипептид с полноразмерной последовательностью, вероятно, имеют общие функции, эквивалентные продемонстрированным функциям. В соответствии с этим считается, что INSP052, INSP052EC (SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:22) и родственные функционально эквивалентные белки могут быть использованы для лечения аутоиммунных заболеваний, вирусных заболеваний или острых заболеваний печени, а также алкогольной печеночной недостаточности. Они могут быть также эффективными для лечения других воспалительных заболеваний.

Ингибирующие активности в определенном интервале, обнаруживаемые тестируемой молекулой на основе INSP052EC в различных клеточных анализах и у животных с моделью заболевания, подтверждают, что патофизиологические эффекты цитокинов, являющиеся результатом их избыточного продуцирования или продуцирования в нежелательном месте, могут быть блокированы этой молекулой. Ингибирование клеточных процессов, ассоциированных с пролонгированным продуцированием провоспалительных цитокинов, может быть достигнуто с помощью молекул, содержащих INSP052EC, а поэтому эти молекулы могут быть использованы для ослабления аномальных воспалительных состояний, ассоциированных, в частности, с аутоиммунными и воспалительными заболеваниями, поражающими различные ткани и органы (например, печень, кожу, легкие и центральную нервную систему); причем такое использование откроет новые возможности для терапевтического лечения онкологических, нервных, сердечнососудистых и инфекционных заболеваний. Другие клинические применения молекул на основе INSP052EC могут быть найдены с помощью цитокиновых анализов, которые позволяют выявить избыточную экспрессию и/или секрецию цитокинов в образцах, взятых у пациентов, страдающих другими заболеваниями (Wong С.K. and Lam C.W. Adv. Clin. Chem. 2003, 37:1-46; Whiteside T.L., Biotechniques, 2002, Oct. Suppl: 4-8, 10, 12-5), а затем оценивать терапевтическую эффективность молекулы INSP052EC как антагониста цитокинов.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, будет далее называться "полипептидом экзона 1 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, будет далее называться "полипептидом экзона 2 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, будет далее называться "полипептидом экзона INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, будет далее называться "полипептидом экзона 4 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, будет далее называться "полипептидом экзона 5 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:12, будет далее называться "полипептидом экзона INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, будет далее называться "полипептидом экзона 7 INSP052". В результате объединения последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14 получают последовательность, обозначенную SEQ ID NO:16. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, будет далее называться "полипептидом INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NO:20, представляет собой внеклеточный домен INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:22, будет далее называться внеклеточным доменом зрелого полипептида INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:24, будет далее называться зрелым полипептидом экзона 2 INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:26, будет далее называться зрелым полипептидом INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:29, будет далее называться гистидин-меченым внеклеточным доменом зрелого INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:30, будет далее называться Fc-гибридом внеклеточного домена зрелого INSP052. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:31, будет далее называться фрагментом INSP052, содержащим домены Ig (INSP052Ig2).

Используемый здесь термин "полипептиды экзонов INSP052" означает полипептиды, содержащие 1 INSP052, полипептид экзона 2 INSP052, полипептид экзона 3 INSP052, полипептид экзона 4 INSP052, полипептид экзона 5 INSP052, полипептид экзона 6 INSP052, полипептид экзона 7 INSP052, полипептид INSP052, внеклеточный домен INSP052, внеклеточный домен зрелого INSP052, полипептид экзона 2 зрелого INSP052, зрелый полипептид INSP052, меченный гистидином внеклеточный домен зрелого INSP052, Fc-гибрид внеклеточного домена зрелого INSP052 и фрагмент INSP052, содержащий домен Ig.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид согласно этому варианту состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16 (полипептида INSP052), или он представляет собой его фрагмент или функциональный эквивалент. В другом варианте осуществления изобретения указанный полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14, или представляет собой ее вариант.

В другом варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22;

(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида (i), или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID NO:20, представляет собой внеклеточный домен INSP052 и соответствует аминокислотам 1-240 полноразмерного белка (см. раздел "Примеры"). SEQ ID NO:22 представляет собой внеклеточный домен зрелого INSP052. См. также фиг. 7, относящуюся к внеклеточному домену INSP052.

Существует высокая вероятность того, что внеклеточный домен будет иметь правильную укладку и будет обладать биологической активностью в том случае, если в полипептидном фрагменте будут присутствовать другие остатки у С- и/или N-конца границ полипептидных последовательностей. Например, дополнительные 5, 10, 20, 30, 40, 50 или даже 100 аминокислотных остатков полипептидной последовательности INSP052 или гомологичной последовательности могут быть включены у С- или у N-конца или у обоих концов границ домена, связывающегося с рецептором, при условии, что они не будут негативно влиять на способность данного полипептидного фрагмента к "правильной" укладке и на его биологическую активность. Из-за присутствия крупных петель между вторичными структурными элементами может оказаться необходимым удлинение, составляющее по меньшей мере 100 или 200 остатков.

В усеченных вариантах внеклеточного домена INSP052 один или несколько аминокислотных остатков (например, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или более) могут быть делетированы у С- или у N-конца или у обоих концов этого домена без какого-либо негативного воздействия на биологическую активность.

Предпочтительным усеченным вариантом внеклеточного домена INSP052 является фрагмент INSP052, содержащий домен Ig (INSP052Ig2) и имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:31. Настоящее изобретение относится к полипептиду, который:

(i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:31;

(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида по (i) или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом по (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Как обсуждается ниже, полипептиды согласно изобретению могут быть получены в форме гибридного белка или в виде "свободного" белка. В соответствии с этим, в одном из своих вариантов настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из внеклеточного домена INSP052. В другом своем варианте настоящее изобретение относится к полипептиду, состоящему из INSP052 (полноразмерного белка или его внеклеточного домена, включая его зрелый вариант и усеченные варианты), присоединенного по меньшей мере к другому полипептиду, вместе с которым он образует гибридный белок.

В соответствии с этим, в других своих вариантах настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему две последовательности (а) и (b) или состоящему из них, где указанный полипептид:

а) представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична:

(i) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 или SEQ ID NO:31;

(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида по (i) или имеющий общую антигенную детерминанту с полипептидом по (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii); и b) представляет собой гетерологичную аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из сигнальной последовательности, метки для очистки; внеклеточного домена мембраносвязанного белка; секретированного белка; инициирующего метионина; линкерной области, содержащей сайт узнавания для эндопептидазы; или Fc-области, происходящей от молекулы иммуноглобулина.

полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 90%, а предпочтительно по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% гомологична любой из вышеуказанных последовательностей полипептида INSP052 по всей длине данного полипептида, и находящегося в одной и той же рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную последовательность белка.

Используемый здесь термин "гетерологичный" относится к любому полипептиду, отличающемуся от человеческого полипептида INSP052. Примерами гетерологичных последовательностей, которые могут присутствовать в гибридных белках у N- или у С-конца, являются внутриклеточные домены мембраносвязанного белка, константные области иммуноглобулина (Fc-области), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, секреторные последовательности и последовательности, облегчающие очистку аффинной хроматографией.

Многие из этих гетерологичных последовательностей являются коммерчески доступными как последовательности, присутствующие в экспрессионных плазмидах, поскольку включение этих последовательностей в гибридные белки придает им дополнительные свойства и не оказывает значительного влияния на специфическую биологическую активность присоединенных к ним белков (Terpe K. 2003, Appl.

Microbiol. Biotechnol, 60:523-33).

Примерами таких дополнительных свойств этих белков являются их более длительное время полужизни в физиологических жидкостях, более легкая процедура их очистки, наличие дополнительного сайта связывания, способность к созреванию посредством эндопротеолитического гидролиза, повышенная стабильность во время рекомбинантного продуцирования или внеклеточная локализация. Последний признак является особенно важным, поскольку он позволяет полипептидам локализоваться в пространстве, из которого более легко осуществить выделение и очистку этих полипептидов.

Конструирование молекул, лигандов и линкеров, а также методы и стратегии конструирования, очистки, детекции, созревания и применения гибридных белков подробно описаны в литературе (Nilsson J. et al., Protein Expr. Purif. 11:1-16, 1997; "Applications of Chimeric genes and Hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Academic Press, 2000).

Если это необходимо, то гетерологичная последовательность может быть элиминирована путем протеолитического расщепления после очистки белка или in vivo. Это может быть достигнуто, например, путем встраивания сайта протеолитического расщепления между белком и гетерологичной последовательностью, и обработки этого гибридного белка соответствующей эндо/экзопептидазой. Эти свойства облегчают продуцирование гибридных белков и их применение для получении фармацевтических композиций.

Например, гетерологичная последовательность может быть присоединена к белку посредством линкерной последовательности, содержащей сайт распознавания для эндопептидазы (такой как каспаза), которая может быть использована для отделения нужного белка от гетерологичной последовательности in vivo или in vitro.

Альтернативно, если экспрессируемый белок не содержит инициирующего метионина (например, если он представляет собой зрелую последовательность без сигнального пептида), то эта гетерологичная последовательность может иметь инициирующий метионин, обеспечивающий соответствующую экспрессию в клетке-хозяине. Эта дополнительная аминокислота может быть затем элиминирована под действием экзопептидазы, такой как метионин-аминопептидаза, в соответствии с методами, описанными в литературе (Van Valkenburgh H.A. & Kahn R.A. Methods Enzymol. 344:186-193, 2002; Ben-Bassat A., BioProccess Technol, 12:147-159, 1991).

Гетерологичные последовательности, к которым могут быть присоединены полипептиды согласно изобретению, могут состоять из последовательностей, облегчающих секрецию белка, таких как сигнальные пептиды и сигналы секреции (Rapoport Т.A. et al., Annu. Rev. Biochem. 1996; 65:271-303).

Альтернативно, гетерологичная последовательность в гибридном белке может облегчать очистку этого белка. Например, полипептид INSP052 может быть очищен с помощью гекса-гистидинового пептида, присоединенного у С-конца INSP052. Пример такого гибридного полипептида представлен в SEQ ID NO:29. Этот гексагистидиновый пептид образует так называемую "гистидиновую" метку, которая облегчает очистку (Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:821-4). Вместо гистидиновой метки могут быть использованы "НА"-метка, эпитоп, происходящий от белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., 1994, Cell, 37:767-78), или другие метки для аффинной очистки, такие как GST, FLAG или МВР.

Гетерологичная последовательность гибридного белка может обладать дополнительной функциональной активностью. Например, внеклеточный домен INSP052, который обладает цитокинантагонистической активностью, может быть присоединен к гетерологичной последовательности, которая также обладает противовоспалительной или, по существу, иммуномодуляторной активностью, такой как последовательность других антагонистов цитокинов, агентов, связывающихся с коллагеном II (таких как агенты, описанные в WO 01/37861), и самих цитокинов (таких как цитокины, описанные в WO 03/095488, WO 03/014359 и WO 03/035105).

-9Гетерологичная последовательность может обеспечивать более высокую стабильность, более длительное время полужизни полипептида согласно изобретению и, тем самым, увеличение его терапевтической активности. Например, полипептиды могут быть присоединены к альбумину человеческой сыворотки или к другим последовательностям, которые связываются с альбумином человеческой сыворотки (см. Chuang V.T. et al., Pharm. Res. 2002; 19:569-577; Graslund T. et al., Protein Expr. Purif. 1997, 9:125-32;

WO 01/77137). Альтернативно, такая дополнительная последовательность может обеспечивать доставку в конкретно локализованную область, такую как головной мозг (WO 03/32913).

Гетерологичная последовательность может улучшать стабильность посредством образования мультимеров белка. Примерами гетерологичных последовательностей, стимулирующих мультимеризацию, являются домены, выделенные из белков, таких как hCG (WO 97/30161), коллаген X (WO 04/33486), C4ВР (WO 04/20639), белки Erb (WO 98/02540) или суперспирализованные пептиды (WO 01/00814).

В предпочтительном варианте изобретения указанный полипептид присоединен к константной области молекулы Ig. Пример такого полипептида представлен в SEQ ID NO:30. Указанный полипептид, предпочтительно, присоединяют к области тяжелой цепи, такой как, например, домены CH2 и СН3 человеческого IgG1. Для продуцирования гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы молекул Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или изоформы Ig других классов, такие как, например, IgM или IgA. Указанная константная область улучшает стабильность посредством стимуляции мультимеризации. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, либо гетеро- или гомомультимерными.

Примеры стратегий для генерирования гибридных белков, содержащих белок и иммуноглобулиновый фрагмент, описаны в литературе (WO 91/08298; WO 96/08570; WO 93/22332; WO 04/085478; WO 01/03737, WO 02/66514).

Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточный домен зрелого INSP052, может быть клонирована в экспрессионном векторе, присоединенном к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность исходного INSP052 (или любую другую соответствующую сигнальную/секреторную последовательность) на своем 5'-конце, и к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область тяжелой цепи лямбда человеческого иммуноглобулина IgG1 (NCBI Acc. № CAA7 5302; сегмент 246-477) у его 3'-конца. Полученный вектор может быть использован для трансформации клеточной линии хозяина СНО или НЕК 293, и могут быть отобраны клоны, стабильно экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный гибридный белок, имеющий внеклеточный домен INSP052 у N-конца и последовательность IgG1 у С-конца. Затем этот клон может быть использован для повышения уровня продуцирования и для улучшения очистки рекомбинантного гибридного белка из культуральной среды. Альтернативно, положение нуклеиновой кислоты, кодирующей константную область тяжелой цепи лямбда человеческого иммуноглобулина IgGl и внеклеточный домен INSP052 может быть изменено, и полученный белок может быть экспрессирован и секретирован с использованием исходной сигнальной последовательности INSP052, или другой соответствующей сигнальной/секреторной последовательности.

Могут быть также генерированы гетеродимеры с использованием этой технологии путем коэкспрессии конструкций, кодирующих два различных гибридных белка в одной и той же клетке (WO 00/18932). Например, клетка может экспрессировать первый гибридный белок, содержащий внеклеточный домен INSP052, присоединенный к Fc-домену, и второй гибридный белок, содержащий Fc-домен, присоединенный к белку с другой активностью, такому как другой антагонист цитокинов, агент, связывающийся с коллагеном II (такой как агент, описанный WO 01/37861), и/или сам цитокин (такой как цитокин, описанный в WO 03/095488, WO 03/014359 и WO 03/035105).

Если данный гибридный белок содержит область иммуноглобулина, то такое присоединение может быть осуществлено непосредственно или посредством короткого линкерного пептида, который может иметь длину по меньшей мере 1-3 аминокислотных остатка или более, например, 13 аминокислотных остатков. Указанным линкером может быть трипептид, имеющий последовательность, например, E-F-M (Glu-Phe-Met), или линкерную последовательность, состоящую из 13 аминокислот и содержащую последовательность Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, введенную между последовательностью соединения согласно изобретению и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как более длительное время пребывания в физиологических жидкостях (т.е. повышенное время полужизни), повышенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии или способность облегчать очистку этих гибридных белков.

В другом предпочтительном варианте изобретения по меньшей мере одна молекула присоединена к одной или нескольким функциональным группам в полипептиде согласно изобретению, которые присутствуют в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Такой молекулой предпочтительно является стабилизирующий полимер, позволяющий образовывать конъюгаты и комплексы (Harris J.M. & Chess R.B. Nat. Rev. Drug. Discov. 2:214-221, 2003; Greenwald R.B. et al., Adv. Drug.

Deliv. Rev. 55:217-250, 2003; Pillai 0. & Panchagnula R. Cur. Opin. Chem. Biol. 5:447-451, 2001). Данный полимер может быть продуцирован после сайт-направленной модификации соответствующего остатка во внутреннем или в концевом положении. Аминокислотные остатки в полипептиде или в гибридном белке присоединяться к полимеру (то есть боковую цепь аминокислоты, несущей функциональную группу, например, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, цистеина, гистидина и т.п.). Альтернативно, остаток в этих сайтах может быть заменен другой аминокислотой, имеющей боковую цепь, способную присоединяться к полимеру.

Например, дополнительный цистеин, позволяющий осуществлять прямое ПЭГилирование, может быть присоединен у N- или С-конца внеклеточного домена INSP052. Альтернативно, цистеин может быть включен в данный белок путем замены остатка, например, в соответствии с сайтом гликозилирования. Кроме того, боковые цепи генетически кодируемых аминокислот могут быть химически модифицированы для присоединения к полимеру, либо могут быть использованы неприродные аминокислоты с функциональными группами соответствующих боковых цепей. Полимеры могут быть также присоединены к углеводу или к другой молекуле, которая присоединена к боковой цепи аминокислоты в нужном положении.

Полимеры, подходящие для этих целей, являются нетоксичными для биологических систем. Такие полимеры могут быть гидрофобными или гидрофильными по природе, биологически разлагаемыми или биологически неразлагаемыми, либо они могут обладать комбинацией этих свойств. Такими полимерами являются природные полимеры (такие как коллаген, желатин, целлюлоза, гиалуроновая кислота), в также синтетические полимеры (такие как сложные полиэфиры, сложные полиортоэфиры, полиангидриды).

Примерами гидрофобных неразлагаемых полимеров являются полидиметилсилоксаны, полиуретаны, политетрафторэтилены, полиэтилены, поливинилхлориды и полиметилметакрилаты. Примерами гидрофильных неразлагаемых полимеров являются поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поливиниловый спирт, поли(N-винилпирролидон), полиалкилены, полиакриламид и их сополимеры. Предпочтительные полимеры содержат в качестве повторяющегося звена этиленоксид, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Предпочтительный метод присоединения предусматривает использование комбинированного метода пептидного синтеза и химического лигирования. Присоединение водорастворимого полимера может быть осуществлено посредством биологически разлагаемого линкера, в частности, в аминоконцевой области белка. В результате такой модификации продуцируется белок в форме предшественника (или "пролекарства"), из которой после расщепления линкера высвобождается белок, не модифицированный полимером.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид согласно первому аспекту изобретения.

Указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит или состоит из них:

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:1 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:3 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:5 (кодирующую полипептид экзона 3 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:7 (кодирующую полипептид экзона 4 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:9 (кодирующую полипептид экзона 5 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:11 (кодирующую полипептид экзона 6 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:13 (кодирующую полипептид экзона 7 INSP002);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:15 (кодирующую полипептид INSP052); или последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID N0:17 (кодирующую полипептид INSP055), SEQ ID NO:20 (кодирующую внеклеточный домен полипептида INSP052), SEQ ID No:22 (кодирующую внеклеточный домен зрелого полипептида INSP052), SEQ ID NO:24 (кодирующую экзон 2 зрелого полипептида INSP052), SEQ ID NO:26 (кодирующую зрелый полипептид INSP052), или избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей.

При объединении последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:11 и SEQ ID N0:13, продуцируется последовательность, представленная в SEQ ID NO:15.

При объединении последовательностей, представленных в SEQ ID N0:23, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:13, продуцируется последовательность, представленная в SEQ ID NO:25.

В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который включает внеклеточный домен INSP052 (SEQ ID NO:20) или состоит из этого домена. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID N0:19, или состоит из нее. Эта последовательность также представлена на фиг. 7 одновременно рассматриваемой патентной заявки WO 03/093316, хотя эти последовательности включают гистидиновые остатки, присоединенные у С-конца.

В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который включает внеклеточный домен зрелого INSP052 (SEQ ID NO:22) или состоит из этого домена. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:21, или состоит из нее.

Эта последовательность также представлена на фиг. 7 одновременно рассматриваемой патентной заявки WO 03/093316, хотя эти последовательности включают гистидиновые остатки, присоединенные у Сконца.

В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, содержащий вариант внеклеточного домена зрелого INSP052 или состоящий из этого варианта, который представляет собой фрагмент INSP052, содержащий домен Ig (SEQ ID NO:31).

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты согласно второму аспекту изобретения.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения.

В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором согласно четвертому аспекту изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом согласно первому аспекту изобретения и который предпочтительно ингибирует активность указанного полипептида. Специалисту в данной области очевидно, что термин "лиганд" охватывает любую молекулу, которая специфически связывается с полипептидом согласно первому аспекту изобретения, включая, например, антитела и рецепторы-"сироты".

Используемый авторами термин "активность полипептида согласно изобретению" и аналогичные понятия означают активность, присущую молекулам распознавания на клеточной поверхности, содержащим иммуноглобулиновые домены. В частности, этот термин также включает антагонистическую активность, направленную против цитокинов и определенную выше, в частности, активность, направленную на ингибирование экспрессии и/или секреции цитокинов, в частности, цитокинов TNF-альфа, IL-4 и IL-2. Антагонисты цитокинов согласно изобретению предпочтительно обладают иммуномодуляторной активностью. Примером такого применения полипептидов согласно изобретению является их использование для лечения Т-клеточно-опосредуемого воспаления кожи, такого как аллергический контактный дерматит и псориаз.

Методы идентификации лигандов согласно шестому аспекту настоящего изобретения подробно описаны ниже. В частности, настоящее изобретение относится к способу идентификации соединения, которое представляет собой лиганд, специфически связывающийся с полипептидами SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22, где указанный способ включает контактирование полипептида согласно первому аспекту настоящего изобретения с одним или несколькими соединениями, которые, как предполагается, обладают аффинностью связывания с указанным полипептидом; и отбор соединения, специфически связывающегося с указанным полипептидом. Лиганды полипептидов согласно изобретению, идентифицированные такими способами, могут быть использованы для идентификации других антагонистов цитокинов. Например, методы скрининга могут включать контактирование, осуществляемое для идентификации соединений, связывающихся с указанными лигандами, такими как антитела, которые могут также действовать, как антагонисты цитокинов.

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным с точки зрения изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или с точки зрения регуляции активности полипептида согласно первому аспекту изобретения.

Соединение согласно седьмому аспекту изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептидов INSP052 и INSP055 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения согласно шестому и седьмому аспекту изобретения могут быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

В представленных ниже примерах со всей очевидностью продемонстрировано, что внеклеточный домен INSP052 может быть использован для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени и печеночной недостаточности. В соответствии с этим получение соединения согласно седьмому аспекту настоящего изобретения, которое имитирует конформацию внеклеточного домена INSP052, или представляет собой агонист внеклеточного домена INSP052, является особенно предпочтительным, поскольку оно может найти свое применение для предупреждения или лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, заболеваний печени и печеночной недостаточности.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики предпочтительно воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени (включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности (включая алкогольную печеночную недостаточность).

Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного препарата для предупреждения или лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния.

Такими заболеваниями предпочтительно являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение, раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, ишемическая болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия, болезнь легких, ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких), астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит, заболевание печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона" (общее название группы заболеваний, характеризующихся поражением периферических мотонейронов), нервномышечное заболевание, ВИЧинфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния, в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены, в частности антагонисты цитокинов.

Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения особенно предпочтительно использовать в целях изготовления лекарственного средства для лечения воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени (включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности (включая алкогольную печеночную недостаточность).

Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения могут быть использованы в комбинации с другими терапевтическими средствами для лечения заболеваний, перечисленных выше. В частности, полипептиды согласно изобретению (включая гибридные белки), которые обладают антицитокиновой активностью, могут быть использованы в комбинации с другим терапевтическим средством.

Поэтому настоящее изобретение относится к использованию (i) соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения, в частности полипептида или гибридного белка, содержащего внеклеточный домен INSP052, и (ii) другого терапевтического средства в целях изготовления лекарственного средства для лечения заболеваний или состояний, в патогенезе которых участвуют предпочтительно цитокин TNF, IL-2 и/или IL-4. Такое заболевание или состояние предпочтительно выбирают из воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, кожных болезней, заболеваний печени (включая вирусные и острые заболевания печени) и печеночной недостаточности (включая алкогольную печеночную недостаточность).

Другое терапевтическое средство может ингибировать такой же цитокин, как и полипептиды согласно изобретению, либо оно может ингибировать другую молекулу данного физиологического пути, вызывающую указанное заболевание, либо оно может ослаблять симптомы данного заболевания.

Таким терапевтическим средством предпочтительно является антагонист цитокина (предпочтительно антагонист TNF, IL-2 и/или IL-4) или противовоспалительное средство.

Примерами антагонистов цитокинов, которые могут быть использованы в качестве других терапевтически средств, являются антагонисты TNF-альфа, такие как этанерцепт, инфликсимаб (ингибитор TNFальфа-конвертирующего фермента, ингибитор ТАСЕ), и лефлуномид, используемый для лечения ревматоидного артрита; и антагонисты IL-2, такие как базилимаб и даклизумаб, используемые для предупреждения отторжения трансплантата. Другим терапевтическим средством может быть также противовоспалительное средство, такое как стероидное или нестероидное противовоспалительное средство, либо другое средство, уже используемое для лечения аутоиммунного заболевания, кожной болезни, заболевания печени или печеночной недостаточности.

Дополнительное терапевтическое средство может быть введено пациенту одновременно с соединением согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения, т.е. в виде смеси. Альтернативно, соединение согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения может быть введено пациенту, которому уже было введено терапевтическое средство, либо указанное терапевтическое средство может быть введено пациенту, которому уже было введено соединение согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения. Таким образом, указанное терапевтическое средство и указанное соединение, используемые в данной комбинации, могут быть введены одновременно, последовательно или отдельно.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, предусматривающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или оценку уровня активности полипептида согласно первому аспекту изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro.

Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем рецидива заболевания.

Предпочтительный способ детекции полипептидов согласно первому аспекту изобретения включает стадии: (а) контактирования лиганда согласно шестому аспекту изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.

Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то каждому читателю известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы с использованием антител. Аналогичные методы могут применяться в течение коротких или продолжительных периодов времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания.

Заболеванием, диагностируемым способом в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, является заболевание, в котором участвуют описанные выше молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены.

Предпочтительным заболеванием, диагностируемым способом в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, кожная болезнь, заболевание печени (включая вирусное и острое заболевание печени) и печеночная недостаточность (включая алкогольную печеночную недостаточность).

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептидов согласно первому аспекту изобретения в качестве молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Важная роль Ig-доменов в рецепторах клеточной поверхности описана Lokker N.A. et al., "Functional importance of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor extracellular immunoglobulin-like domains. Identification of PDGF binding site and neutralizing monoclonal antibodies", J.Biol.Chem. 1997 Dec. 26; 272 (52) :33037-44.

Настоящее изобретение также относится к использованию полипептидов согласно первому аспекту изобретения в качестве антагонистов цитокинов, описанных выше, в частности, антагонистов секреции TNF-альфа, IL-4 и IL-2. В соответствии с этим полипептиды согласно изобретению могут действовать как антагонисты цитокинов посредством снижения уровней экспрессии цитокинов, уровней цитокиновой активности, уровней секреции цитокинов и т.п.

Настоящее изобретение также относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения для экспрессии белка, обладающего активностью молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены. Настоящее изобретение также относится к способу стимуляции активности молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновые домены, где указанный способ предусматривает использование полипептида согласно первому аспекту изобретения.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид согласно первому аспекту изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектор согласно четвертому аспекту изобретения, или клетку-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганд согласно шестому аспекту изобретения, или соединение согласно седьмому аспекту изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В соответствии с одним из вариантов одиннадцатого аспекта настоящего изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать другое терапевтическое средство. Указанное другое терапевтическое средство может ингибировать такой же цитокин, как и полипептиды согласно изобретению, либо оно может ингибировать другую молекулу в данном физиологическом пути, вызывающую данное заболевание, либо оно может ослаблять симптомы данного заболевания.

Таким терапевтическим средством предпочтительно является антагонист цитокина (предпочтительно антагонист TNF, IL-2 и/или IL-4) или противовоспалительное средство.

Примерами антагонистов цитокинов, которые могут быть использованы в качестве других терапевтических средств, являются антагонисты TNF-альфа, такие как этанерцепт, инфликсимаб (ингибитор TNF-альфа-конвертирующего фермента, ингибитор ТАСЕ) и лефлуномид, используемый для лечения ревматоидного артрита; и антагонисты IL-2, такие как базилимаб и даклизумаб, используемые для предупреждения отторжения трансплантата. Другим терапевтическим средством может быть также противовоспалительное средство, такое как стероидное или нестероидное противовоспалительное средство, либо другое средство, уже используемое для лечения аутоиммунного заболевания, кожной болезни, заболевания печени или печеночной недостаточности.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду согласно первому аспекту изобретения или к молекуле нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или к вектору согласно четвертому аспекту изобретения, или к клетке-хозяину согласно пятому аспекту изобретения, или к лиганду согласно шестому аспекту изобретения, или к соединению согласно седьмому аспекту изобретения, которые могут быть использованы в целях изготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболеваний. Эти молекулы могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. Такими заболеваниями, предпочтительно, являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение, раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, ишемическая болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия, болезнь легких, ХОБЛ, астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит, заболевание печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона", нервномышечное заболевание, ВИЧ-инфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния, в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены.

Соединения согласно первому, второму, третьему, четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения особенно предпочтительно использовать в целях изготовления лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания, заболевания печени или печеночной недостаточности.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида согласно первому аспекту изобретения или молекулы нуклеиновой кислоты согласно второму или третьему аспекту изобретения, или вектора согласно четвертому аспекту изобретения, или клетки-хозяина согласно пятому аспекту изобретения, или лиганда согласно шестому аспекту изобретения или соединения согласно седьмому аспекту изобретения.

В случае заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или активность полипептида согласно первому аспекту изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, указанные полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые данному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, в случае заболеваний, при которых уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид согласно первому аспекту изобретения, или активность полипептида согласно первому аспекту изобретения выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, указанный полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые данному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

- 15 Предпочтительным заболеванием является заболевание, в котором участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновые домены.

Особенно предпочтительным заболеванием является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, заболевание печени или печеночная недостаточность.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, дефицитным по полипептиду согласно первому аспекту изобретения, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни такого полипептида или вообще не экспрессируют указанного полипептида. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания.

Таким заболеванием предпочтительно является заболевание, которое ассоциировано с вышеописанными молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащими иммуноглобулиновые домены.

Особенно предпочтительным заболеванием является воспалительное заболевание, аутоиммунное заболевание, заболевание печени или печеночная недостаточность.

При этом следует отметить, что объем охраны для рассматриваемых полипептидов и нуклеиновых кислот согласно изобретению не распространяется на нуклеиновые кислоты или полипептиды, присутствующие в их природных источниках. Точнее говоря, полипептиды и нуклеиновые кислоты, заявленные в настоящем изобретении, могут рассматриваться как "выделенные" или "очищенные". Используемые здесь термины "выделенный" и "очищенный" относятся к нуклеиновой кислоте или полипептиду, выделенным по меньшей мере из одного другого компонента (например, нуклеиновой кислоты или полипептида), присутствующего вместе с нуклеиновой кислотой или с полипептидом в их природном источнике.

Например, полипептид, содержащийся в экстракте ткани, может быть компонентом "выделенного" или "очищенного" полипептида, а также компонентом синтетически или рекомбинантно продуцированного полипептида. В одном из вариантов нуклеиновая кислота или полипептид присутствуют (если вообще присутствуют) только в растворителе, буфере, вместе с ионами или с другим соединением, обычно присутствующим в растворе указанных соединений.

При этом следует отметить, что термины "выделенный" и "очищенный" не означают метод, с помощью которого были получены указанный полипептид или нуклеиновая кислота, или уровень чистоты этого препарата. Например, такие выделенные или очищенные молекулы могут быть продуцированы рекомбинантным способом, могут быть выделены непосредственно из нужной клетки или ткани, либо они могут быть продуцированы путем синтеза на основе определенных последовательностей.

Краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Изобретательский уровень настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

В этом описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в этой области.

Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Например, наиболее подходящее описание, которое может быть использовано в качестве консультации, приводится в следующих работах:

Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory-Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D.

Hames & SJ. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & SJ. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.

1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); и Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and С. С Blackwell eds. 1986).

Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам или полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид согласно изобретению может присутствовать в форме зрелого белка либо он может пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид согласно первому аспекту изобретения может образовывать часть гибридного белка.

Например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

Такие гибридные белки могут быть получены путем клонирования полинуклеотида, кодирующего полипептид, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 85% гомологична последовательности полипептида INSP052, в одной рамке считывания с последовательностями, кодирующими гетерологичную последовательность белка.

Используемый здесь термин "гетерологичный" относится к любому полипептиду, отличающемуся от человеческого полипептида INSP052. Примеры гетерологичных последовательностей, которые могут присутствовать в гибридных белках у N- или С-конца, описаны выше, и такими примерами являются внеклеточные домены мембраносвязанного белка, константные области иммуноглобулина (Fc-области), домены мультимеризации, домены внеклеточных белков, сигнальные последовательности, секреторные последовательности и последовательности, облегчающие очистку аффинной хроматографией. Если это необходимо, то такая гетерологичная последовательность может быть элиминирована посредством протеолитического расщепления, как описано выше.

В предпочтительном варианте изобретения указанный белок присоединен к константной области молекулы Ig. Такой белок предпочтительно присоединен к областям тяжелой цепи, таким как, например, домены СН2 и СН3 человеческого IgG1. Для продуцирования гибридных белков согласно изобретению могут быть также использованы и другие изоформы молекул Ig, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или изоформы Ig других классов, такие как, например, IgM или IgA. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, либо гетеро- или гомомультимерными.

В другом предпочтительном варианте изобретения функциональное производное содержит по меньшей мере одну молекулу, присоединенную к одной или нескольким функциональным группам, которые присутствуют в виде одной или нескольких боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительной молекулой является молекула полиэтиленгликоля (ПЭГ).

ПЭГилирование может быть осуществлено известными методами, такими как, например, методы, описанные в WO 99/55377.

Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах согласно изобретению, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPI-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование; и убихитинизация.

В частности, аминокислотное производное может содержать замещенные или незамещенные алкильные группы, которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими, и могут включать один или несколько гетероатомов. Аминокислотные производные могут быть получены de novo, либо они могут быть получены из коммерчески доступных источников (Calbiochem-Novabiochem AG, Switzerland; Bachem, USA).

Указанные модификации осуществляют для получения полипептидов согласно изобретению, которые могут быть легко очищены и которые обладают повышенной эффективностью и/или улучшенными фармакокинетическими свойствами. Например, если пептид является восприимчивым к расщеплению пептидазами после его инъекции индивидууму, то эта проблема может быть решена путем замены особенно чувствительной пептидной связи нерасщепляемым пептидным миметиком, в результате чего можно получить более стабильный пептид, который является более подходящим для использования в качестве терапевтического средства. Аналогично, замена L-аминокислотного остатка является стандартным способом получения пептида, менее чувствительного к протеолизу, и, в конечном счете, соединения, более похожего на органические соединения, а не на пептиды. Для модификации полипептидов согласно изобретению могут быть также использованы аминоконцевые блокирующие группы, такие как третбутилоксикарбонил, ацетил, теил, сукцинил, метоксисукцинил, суберил, адипил, азелаил, данзил, бензилоксикарбонил, флуоренилметоксикарбонил, метоксиазелаил, метоксиадипил, метоксисуберил и 2,4динитрофенил.

Специалистам известны и многие другие модификации, способствующие повышению эффективности, увеличению активности, облегчению очистки и/или увеличению времени полужизни, а также методы синтеза и получения пептидных миметиков, которые описаны в литературе (WO 02/10195; Villain M.

et al., Chem. Biol. 8:673-679, 2001; Hurby V.J. & Balse P.M., Curr. Med. Chem. 7:945-970, 2000; Golebiowski A. et al., Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 4:428-34, 2001). (Dougherty D.A. Curr. Opin. Chem. Biol. 4:645-52, 2000).

Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах согласно изобретению.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации по большей части будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды согласно изобретению могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.

Функционально эквивалентные полипептиды согласно первому аспекту изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам INSP052 и INSP055, а предпочтительно внеклеточный домен INSP052 (т.е. SEQ ID NO:20 или SEQ ID NO:22). Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин "сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatic and Genome Projects, Smith, D.W., ed. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersy, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1897; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M., & Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991).

Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP052 и INSP055, предпочтительно внеклеточного домена INSP052. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и таким замененным аминокислотным остатком может быть, а может и не быть, остаток, кодируемый генетическим кодом. Обычно такими заменами являются замены между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu;



Pages:   || 2 | 3 |


Похожие работы:

«007985 Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, и к использованию этих белков и последовательностей нуклеиновых кислот генов, кодирующих эти белки, для диагностики, профилактики и лечения заболеваний. Все процитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Сыктывкарский государственный университет Институт гуманитарных наук УТВЕРЖДАЮ _2011г. Рабочая программа дисциплины Русский язык и культура речи Направление подготовки: 010400 Прикладная математика и информатика Квалификация (степень) выпускника: бакалавр по направлению подготовки 010400 Прикладная математики и информатика Форма обучения очная Сыктывкар 2011 1. Цели освоения дисциплины Дисциплина Русский язык и культура речи нацелена прежде...»

«высшее профессиональное образование Бакалавриат Ю. Д. железняк, П. к. Петров основы научно-метоДической Деятельности в физической культуре и сПорте Для студентов учреждений высшего профессионального образования, обучающихся по направлению Педагогическое образование профиль Физическая культура 6-е издание, переработанное УДК 7А(075.8) ББК 75.1я73 Ж51 Р е ц е н з е н т ы: доктор педагогических наук, академик РАО, профессор Института информатизации образования РАО И.В.Роберт; доктор биологических...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет в г. Анжеро-Судженске 1 марта 2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по дисциплине Отечественная история (ГСЭ.Ф.3) для специальности 080116.65 Математические методы в экономике факультет информатики, экономики и математики курс: 1 экзамен: 1 семестр семестр: 1 лекции: 36 часов практические занятия: 18...»

«ИстоРИоГРАфИЯ ИстоРИчесКой ИнфоРМАтИКИ HISTORIOGRAPHY OF HISTORICAL COMPUTER SCIENCE состоянИе И развИтИе квантИтатИвной ИсторИИ И ИсторИческой ИнформатИкИ. в казахстане: multa paucis tHe state anD DeveLopMent of QuantItatIve HIstory anD HIstorIc InforMatIcs In kaZakHstan: MuLta paucIs Saule А. Zhakisheva Жакишева сауле Аукеновна доктор исторических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Института истории и этнологии им. ч. ч. валиханова министерства образования и науки республики...»

«МЭРИЯ НОВОСИБИРСКА УПРАВЛЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ Информационный ВЕСТНИК ОБРАЗОВАНИЯ В следующем выпуске: Об_итогах деятельности муниципальной системы образования за 2004/2005 год и задачах на новый учебный год О_развитии государственно-общественного управления в образовательных учреждениях О_награждении педагогических и руководящих работников за 2004/2005 учебный год О_золотых медалистах 2005 г. О_победителях Всероссийской олимпиады школьников № 2 (май 2005) 1 Уважаемые руководители! Вы можете...»

«Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Геофизический центр Российской академии наук ОТЧЕТ ГЕОФИЗИЧЕСКОГО ЦЕНТРА РАН ЗА 2012 ГОД. Результаты научных исследований и международных проектов Москва 2013 GEOPHYSICAL CENTER OF RUSSIAN ACADEMY OF SCIENCES REPORT OF GEOPHYSICAL CENTER OF RAS Results of Science Researches and International Projects for 2012 Moscow 2013 В настоящем издании содержатся сведения о работе Учреждения Российской академии наук Геофизического центра в 2012 году, а...»

«ТЕОРИЯ И МЕТОДОЛОГИЯ УДК 336.722.112:316 Т. А. Аймалетдинов О ПОДХОДАХ К ИССЛЕДОВАНИЮ ЛОЯЛЬНОСТИ КЛИЕНТОВ В БАНКОВСКОЙ СФЕРЕ АЙМАЛЕТДИНОВ Тимур Алиевич - директор по исследованиям ЗАО НАФИ, кандидат социологических наук, доцент кафедры социальной и педагогической информатики РГСУ. Email: aimaletdinov@nacfin.ru Аннотация. В статье приводится обзор классических и современных подходов к теоретической интерпретации и эмпирическим исследованиям лояльности клиентов к банкам. На основе анализа...»

«Электронное научное издание Альманах Пространство и Время. Т. 3. Вып. 1 • 2013 Специальный выпуск ПРОСТРАНСТВО И ВРЕМЯ ГРАНИЦ Electronic Scientific Edition Almanac Space and Time Special issue 'Space, Time, and Boundaries’ Elektronische wissenschaftliche Auflage Almabtrieb ‘Raum und Zeit‘ Spezialausgabe ‘Der Raum und die Zeit der Grenzen‘ ‘Т е о р и я и методология Theory and Methodology / Theorie und Methodologie УДК 001:351.746.1 Боярский В.И. Наука о регулятивной функции государственной...»

«ПРАВИТЕЛЬСТВО МОСКВЫ КОМИТЕТ ПО АРХИТЕКТУРЕ И ГРАДОСТРОИТЕЛЬСТВУ УКАЗАНИЕ от 20 февраля 1998 г. N 7 ОБ УТВЕРЖДЕНИИ ПОСОБИЯ К МГСН 2.02-97 ПРОЕКТИРОВАНИЕ ПРОТИВОРАДОНОВОЙ ЗАЩИТЫ ЖИЛЫХ И ОБЩЕСТВЕННЫХ ЗДАНИЙ 1. Утвердить и ввести в действие для использования проектными организациями, осуществляющими проектирование жилых и общественных зданий для строительства в г. Москве и лесопарковом защитном поясе, разработанное НИИ строительной физики РААСН по заказу Москомархитектуры пособие к МГСН 2.02-97...»

«УТВЕРЖДЕН ученым советом Государственного университета – Высшей школы экономики Протокол от 02.07.2010 г. № 15 ПРАВИТЕЛЬСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ - ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ, в отношении которого установлена категория национальный исследовательский университет по направлению подготовки 080500.62 БИЗНЕС-ИНФОРМАТИКА Уровень подготовки: Бакалавр Москва...»

«ТЕХНИЧЕСКИЙ КОДЕКС ТКП 192 – 2009 (02140) УСТАНОВИВШЕЙСЯ ПРАКТИКИ ПРАВИЛА ТЕХНИЧЕСКОЙ ЭКСПЛУАТАЦИИ СЕТЕЙ ПРОВОДНОГО ВЕЩАНИЯ ПРАВIЛЫ ТЭХНIЧНАЙ ЭКСПЛУАТАЦЫI СЕТАК ПРАВАДНОГА ВЯШЧАННЯ Издание официальное Минсвязи Минск ТКП 192 – 2009 УДК 654.1 МКС 33.020 КП 02 Ключевые слова: правила, сети проводного вещания, техническая эксплуатация, техническое обслуживание, распределительная сеть, эксплуатационно-технические нормы Предисловие Цели, основные принципы, положения по государственному регулированию...»

«СБОРНИК РАБОЧИХ ПРОГРАММ Профиль бакалавриата : Математическое и программное обеспечение вычислительных машин и компьютерных сетей Содержание Страница Б.1.1 Иностранный язык 2 Б.1.2 История 18 Б.1.3 Философия 36 Б.1.4 Экономика 47 Б.1.5 Социология 57 Б.1.6 Культурология 71 Б.1.7 Правоведение 83 Б.1.8.1 Политология 89 Б.1.8.2 Мировые цивилизации, философии и культуры Б.2.1 Алгебра и геометрия Б.2.2 Математический анализ Б.2.3 Комплексный анализ Б.2.4 Функциональный анализ Б.2.5, Б.2.12 Физика...»

«Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АЭРОКОСМИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ имени академика С.П. КОРОЛЕВА Факультет информатики Кафедра информационных систем и технологий АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ АППРОКСИМАТИВНОГО АНАЛИЗА СЛУЧАЙНЫХ ПРОЦЕССОВ Под редакцией Прохорова С.А. Самара 2010 Автоматизированные системы аппроксимативного анализа случайных процессов. Под ред. Прохорова С.А./ Самар. гос....»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра общей математики и информатики УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ ЭКОНОМЕТРИКА Основной образовательной программы по направлению подготовки 080100.62 – Экономика Благовещенск 2013 2 УМКД разработан старшим преподавателем кафедры ОМиИ Киселевой Аленой Николаевной Рассмотрен и рекомендован на...»

«Лагунин Алексей Александрович КОМПЬЮТЕРНАЯ ОЦЕНКА ПЛЕЙОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ Математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В Н Ореховича Российской академии медицинских наук (ФГБУ ИБМХ РАМН) Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«Российская академия наук Сибирское отделение Институт систем информатики им. А. П. Ершова НОВОСИБИРСКАЯ ШКОЛА ПРОГРАММИРОВАНИЯ. Перекличка времен Под редакцией проф. И. В. Поттосина, к.ф.-м.н. Л. В. Городней Новосибирск 2004 УДК 007.621.391 ББК 32.81 Новосибирская школа программирования. Перекличка времен. — Новосибирск: Ин-т систем информатики им. А.П. Ершова СО РАН, 2004. — 244 с. Настоящий сборник содержит статьи с представлением разнообразных явлений, сопутствовавших развитию...»

«Мультиварка RMC-M150 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ УВАЖАЕМЫЙ ПОКУПАТЕЛЬ! Благодарим вас за то, что вы отдали предпочтение бытовой технике REDMOND. REDMOND — это качество, надежность и неизменно внимательное отношение к потребностям наших клиентов. Надеемся, что вам понравится продукция нашей компании, и вы также будете выбирать наши изделия в будущем. Мультиварка REDMOND RMC-M150 — современный много- Чтобы вы могли быстрее освоить технику приготовления в функциональный прибор нового поколения для...»

«Федеральное агентство по образованию АМУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ГОУВПО АмГУ УТВЕРЖДАЮ Зав. кафедрой МАиМ Т. В. Труфанова _ 2007 г. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ГЕОМЕТРИЯ Учебно-методический комплекс по дисциплине для специальности 010101 – Математика, 010501 – Прикладная математика Составитель: Н. А. Грек Благовещенск 2007 г. Печатается по решению редакционно-издательского совета факультета математики и информатики Амурского государственного университета Грек Н. А. Дифференциальная геометрия:...»

«Туберкулез в российской Федерации 2007 г. аналиТический обзор основных сТаТисТических показаТелей по Туберкулезу, используемых в российской Федерации Под редакцией М.И. Перельмана и Ю.В. Михайловой москва 2008 УДК 616-002.5-312.6(047) ББК 55.4 Т81 Туберкулез в Российской Федерации 2007 г.: Аналитический обзор основных статистических Т81 показателей по туберкулезу, используемых в Российской Федерации / Под ред. М.И. Перельмана, Ю.В. Михайловой. – М., 2008. – 172 с. Аналитический обзор является...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.