WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 | 3 |

«Настоящее изобретение относится к новому семейству белков, называемому семейством SECFAM3, к членам этого семейства, включающего новые белки INSP123, INSP124 и INSP125, ...»

-- [ Страница 1 ] --

010405

Настоящее изобретение относится к новому семейству белков, называемому семейством SECFAM3,

к членам этого семейства, включающего новые белки INSP123, INSP124 и INSP125, идентифицированные в настоящем изобретении как секретируемые белки, содержащие домен фактора фон Виллебранда

типа C (vWFC) длиной от 50 до 60 аминокислот и содержащие десять консервативных цистеиновых остатков; и к использованию этих белков и последовательностей нуклеиновых кислот кодирующих генов для диагностики, предупреждения и лечения заболеваний.

Все цитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научноисследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков настоящего изобретения, позволяют получать окончательные результаты с достаточно высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств все еще остается актуальной.

Введение Секретируемые белки.

Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Все ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида.





Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-связанный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые нацелены на секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами секретируемых белков, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса (адгезивные молекулы), протеазы и факторы роста и дифференцировки.

Белки, содержащие домен фактора фон Виллебранда типа C.

Домен фактора фон Виллебранда типа C (vWFC) характеризуется консервативной пространственной структурой, состоящей из 10 цистеинов, в области длиной примерно 56 аминокислот. Эти домены являются общим отличительным признаком крупных внеклеточных мультидоменных белков, включая хордин, тромбоспондин, проколлаген типа IIA и вентроптин. Эти домены были также обнаружены в более мелких белках, ассоциированных с регуляцией развития, такой как SOG (преждевременная гаструляция). Домены vWFC были впервые охарактеризованы в белке фактора фон Виллебранда. Этот белок, очевидно, играет важную роль в свертывании крови в месте поражения сосудов благодаря его участию во взаимодействии тромбоцитов с эндотелиальными клетками сосудов посредством образования нековалентного комплекса с фактором свертывания VIII в области раны. Очевидно, что в этом случае домены vWFC участвуют в событиях олигомеризации белка. Тот факт, что этот домен также обнаруживается в других комплекс-образующих белках, указывает на его роль в белок-белковых взаимодействиях в процессе образования комплексов.

Была также выявлена роль доменов vWFC в эволюционных процессах. В работе Sandell L.J. et al.

(2002), J. Musculoskel. Interact. 2(6):521-523 сообщается, что белки хордин и коллаген типа IIA конкурентно связываются с белками морфогенеза кости (BMP) через свои домены vWFC. Такое конкурентное связывание может играть регуляторную роль в формировании хряща и костей во время развития скелета.

Было также высказано предположение, что BMP могут играть определенную роль в развитии состояний, ассоциированных с избыточным ростом хряща и костей, таких как остеоартрит. Таким образом, возможно, что терапевтические белки, содержащие домены vWFC, могут способствовать замедлению прогрессирования таких состояний.

-1Поэтому сбор дополнительных сведений об этих доменах имеет крайне важное значение для лучшего понимания основных путей, которые приводят к развитию патологических состояний и заболеваний, ассоциированных с вышеупомянутыми состояниями, а значит, и для разработки более эффективной генной и/или лекарственной терапии этих расстройств.





В настоящем изобретении подробно описана идентификация совершенно нового семейства секретируемых белков-лигандов. Термин "секретируемый белок-лиганд" означает белок, который секретируется из конкретной клетки и вырабатывает фенотипический ответ в той же самой или в другой клетке посредством модуляции (включая ингибирование лиганда, как было продемонстрировано в случае семейства Dan) активности когнитивного рецептора и последующего пути передачи сигнала. Примером уже известного семейства секретируемых белков-лигандов является семейство гликопротеиновых гормонов.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой член семейства гликопротеиновых гормонов. У мужчин ФСГ секретируется клетками передней доли гипофиза, поступает в кровоток, а затем связывается с когнитивными рецепторами на клетках Сертоли яичек, и тем самым регулируют процесс сперматогенеза. У женщин ФСГ связывается с рецепторами на текальных, стромальных и зернистых клетках яичников и регулирует овуляцию. Дефицит ФСГ может приводить к бесплодию как у мужчин, так и женщин. Для борьбы с ФСГ-ассоциированным бесплодием восстановление уровней ФСГ может быть осуществлено путем его введения в форме терапевтического белка. ФСГ является коммерчески доступным и поставляется в виде препарата GONAL-fTM (Serono).

По аналогии с этим примером очевидно, что идентификация нового семейства секретируемых белков-лигандов открывает путь к выявлению новых механизмов взаимодействия лиганд-рецептор и имеет решающее значение для определения фенотипических последствий связывания с лигандом. Если у человека идентифицировано расстройство, которое является следствием нарушения функций любого белкачлена нового семейства секретируемых белков-лигандов, то для лечения указанного расстройства этот белок может быть введен в качестве терапевтического белка.

Описание изобретения Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептиды INSP123, INSP и INSP125 представляют собой секретируемые белки, а более конкретно, секретируемые белки, содержащие домен vWFC. INSP123, INSP124 и INSP125, взятые вместе, составляют часть семейства белков, идентифицированных здесь как белки семейства SECFAM3. Предполагается, что INSP123, INSP124 и INSP125 представляют собой варианты сплайсинга, обладающие различными функциями, такими как различные аффинности связывания со своими партнерами.

Описание семейства белков SECFAM3.

Белки настоящего изобретения не описаны в литературе, и эти белки содержат элемент, являющийся главным отличительным признаком секреторных белков, а именно сигнальный пептид, и могут образовывать кластеры с аналогичными белками, что подтверждается ортологами, происходящими от других видов животных. Дополнительные исследования позволили определить состав этого до сих пор неохарактеризованного семейства белков, которое включает в себя белки, кодируемые 2 человеческими генами, и которое, включая ортологи позвоночных и хордовых, содержит всего 22 последовательности. Эта группа родственных последовательностей называется здесь "семейством SECFAM3".

Все эти 22 последовательности обнаруживают область высокоактивного сигнального пептида различного состава, а остальные части этих последовательностей обнаруживают высокую степень сходства.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к способу идентификации члена семейства SECFAM3, предусматривающему поиск в базе данных транслируемых последовательностей нуклеиновой кислоты или полипептидных последовательностей для идентификации полипептидной последовательности, которая соответствуют нижеследующему профилю последовательности:

-2где, при введении этого профиля в программу поиска BLAST в качестве запрашиваемой последовательности с использованием параметров по умолчанию, установленных NCBI (The National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [матрица Blosum 62: штраф за пробел-пропуск=11, а штраф за пробел-удлинение=1], членами семейства SECFAM3 считаются те члены, которые имеют значение E=10-2 или менее.

Таким образом, термин "член семейства SECFAM3" интерпретируется здесь как полипептидная последовательность, которая удовлетворяет описанному выше профилю с максимальным пороговым значением E=10-2 при ее использовании в качестве запрашиваемой последовательности в BLAST с параметрами, описанными выше. При этом предпочтительно, чтобы указанная полипептидная последовательность имела минимальное пороговое значение E=10-5 или менее, 10-10 или менее, 10-50 или менее, а наиболее предпочтительно 10-70 или менее. Так, например, при сравнении члена семейства INSP (SEQ ID NO:12) с профилем, соответствующим первому аспекту настоящего изобретения, было установлено, что значение E составляет 10-143. Значение E означает ожидаемое число лучших или таких же хороших соответствий, случайно обнаруженных в базе данных, или, альтернативно, такое значение может быть представлено как вероятность того, что данное соответствие является случайным. В соответствии с этим все "совпадения" были распределены по рангу в соответствии с их значениями E, которые, в свою очередь, зависят от числа кандидатов, имеющихся в каждом положении последовательности (20 в случае аминокислот), от длины последовательности или соответствующей области и от размера базы данных, в которой осуществляют поиск. Поэтому более короткие последовательности, такие как члены семейства SECFAM3, могут давать более высокие значения E, чем соответствия между двумя сравниваемыми более длинными последовательностями.

Вышеописанный профиль учитывает присутствие сигнальной последовательности и домена vWFC.

Такой профиль обеспечивает более высокую степень вариабельности аминокислотной последовательности области сигнального пептида (аминокислоты 1-23) по сравнению с доменом vWFC. В контексте настоящего изобретения термин "вариабельность" означает степень сходства и идентичности между аминокислотными последовательностями. Это определенным образом отражает ситуацию, наблюдаемую для 22 членов семейства SECFAM3, которые были идентифицированы в настоящем изобретении. Высокая степень сходства между пятнадцатью членами vWFC-подобных доменов также позволяет предположить, что vWFC-подобный домен, вероятно, играет важную роль в функции данной молекулы. Если этот домен не играет важной роли, то степень консервативности среди его членов не должна быть слишком высокой.

База данных, в которой осуществляют поиск транслируемых последовательностей нуклеиновой кислоты, может включать в себя, не ограничиваясь ими, транслируемые последовательности нуклеиновой кислоты из баз данных кДНК, EST, мРНК и полного или неполного генома.

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, который:

i) содержит полипептидную последовательность или состоит из полипептидной последовательности, которая имеет величину E=10-2 или менее, если представленный ниже профиль вводят в программу поиска BLAST в качестве запрашиваемой последовательности, с использованием параметров по умолчанию, установленных NCBI (The National Center for Biotechnology Information;

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [матрица Blosum 62: штраф за пробел-пропуск=11, а штраф за пробелудлинение=1].

-8ii) представляет собой его фрагмент, который является членом семейства белков, содержащих домен vWFC, или содержит антигенную детерминанту, общую с полипептидами (i); или - 12 iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Полипептид настоящего изобретения предпочтительно представляет собой член семейства секретируемых белков, содержащих домен vWFC. При этом предпочтительно, чтобы в вышеупомянутом тесте указанные полипептиды имели максимальное пороговое значение E=10-2. Более предпочтительно, чтобы указанная полипептидная последовательность имела минимальное пороговое значение E=10-5 или менее, 10-10 или менее, 10-50 или менее, а наиболее предпочтительно 10-70 или менее. Снижение порогового значения действует как более жесткий фильтр для отделения полипептидов, содержащих сигнальный пептид и домен WFC, от полипептидных последовательностей общего фона.

В третьем варианте своего второго аспекта настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, который:

i) содержит полипептид, удовлетворяющий требованиям, предъявляемым к консенсусной аминокислотной последовательности:

(ii) представляет собой его фрагмент, который является членом семейства белков, содержащих домен vWFC, или содержит антигенную детерминанту, общую с полипептидами (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Полипептид настоящего изобретения предпочтительно является членом семейства секретируемых белков, содержащих домен vWFC. Последовательность, описанная в этом варианте настоящего изобретения, охватывает область высокой степени идентичности INSP124 (SEQ ID NO:12), простирающуюся от аминокислоты 54 до аминокислоты 171 (аминокислоты 155-279 при выравнивании, см. фиг. 1).

В четвертом варианте осуществления изобретения указанный полипептид содержит полипептид или состоит из полипептида, удовлетворяющего требованиям, предъявляемым к консенсусной аминокислотной последовательности:

В пятом варианте своего второго аспекта настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, который состоит из полипептида, удовлетворяющего требованиям, предъявляемым к консенсусной аминокислотной последовательности:

- 13 В шестом варианте своего второго аспекта настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду третьего варианта второго аспекта настоящего изобретения, где указанный выделенный полипептид содержит один или несколько, а предпочтительно и все 10 цистеиновых остатков в положениях аминокислот 2, 23, 25, 27, 34, 40, 47, 57, 58 и 61 консенсусной аминокислотной последовательности третьего, четвертого и пятого вариантов второго аспекта настоящего изобретения.

В другом варианте настоящего изобретения выделенный полипептид содержит один или несколько, а предпочтительно все 10 цистеиновых остатков в положениях аминокислот 68, 88, 91, 93, 101, 109, 114, 124, 125 и 128 консенсусной аминокислотной последовательности четвертого варианта второго аспекта настоящего изобретения.

В еще одном варианте настоящего изобретения выделенный полипептид содержит один или несколько, а предпочтительно все цистеиновые остатки в положениях аминокислот 2, 23, 25, 27, 34, 40, 47, 57, 58, 61, 68, 88, 91, 93, 101, 109, 114, 124, 125 и 128 консенсусной аминокислотной последовательности четвертого варианта второго аспекта настоящего изобретения.

Аминокислотные последовательности третьего, четвертого и пятого вариантов второго аспекта настоящего изобретения описаны в системе обозначений программы PROSITE (сайты и структуры белков), где аминокислоты представлены их однобуквенными кодами (Bairoch, A., Bucher, P., and Hofmann, K., (1997). The PROSITE Database: Its status in 1997. Nucl. Acids Res. 25, 217-221). Короче говоря, пептид, соответствующий следующей формуле:

может быть интерпретирован следующим образом:

A(k) представляет собой компонент, который либо определяет одну аминокислоту, например C, либо серию возможных аминокислот, например [ILVF]. Компонент A(k) представляет собой идентичный компонент, если он точно определяет одну аминокислоту (например, C или L), либо неоднозначный компонент, если он определяет более чем одну аминокислоту ([например, ILVF] или [FWY]);

i(k), j(k) означают целые числа, так, чтобы i(k)j(k) для всех k. Часть x(ik, jk) определяет универсальную область соответствия в структурах между произвольными аминокислотами ik и jk. Универсальная область x(ik, jk) является "гибкой", если jk больше чем ik (например, x(2, 3)). Гибкость такой области обозначается jk-ik.br. Так, например, гибкость x(2, 3) равна 1. Универсальная область является фиксированной, если j(k) равно i(k), например область x(2, 2), которая может прочитываться как x(2). Момент гибкости для такой структуры представляет собой произведение гибкостей гибких универсальных областей в данной структуре, если это не определено особо.

Так, например, C-x(2)-H представляет собой структуру с двумя компонентами (C и H) и одну фиксированную универсальную область. Эта область соответствует любой последовательности, содержащей C, за которой следуют любые две произвольные аминокислоты, а за ними следует H. В эту формулу должны входить аминокислотные последовательности ChgHyw и liChgHlyw. C-x(2, 3)-H представляет собой структуру с двумя компонентами (C и H) и одну гибкую универсальную область. Эта область соответствует любой последовательности, содержащей C, за которым следуют любые две или три произвольные аминокислоты, а за ними следует H, например aaChgHywk и liChgaHlyw. C-x(2, 3)-[ILV] представляет собой структуру с двумя компонентами (C и [ILV]) и одну гибкую универсальную область. Она соответствует любой последовательности, содержащей C, за которым следуют любые две или три произвольные аминокислоты, а за ними следуют I, L или V.

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он высказывает предположение, что все полипептиды вышеописанных вариантов настоящего изобретения имеют последовательности сигнальных пептидов. В соответствии с этим зрелые формы описанных полипептидов, не содержащих сигнальные пептиды, составляют дополнительный аспект настоящего изобретения.

В одном из вариантов своего третьего аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:

(i) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 и/или SEQ ID NO:45;

(ii) представляет собой его фрагмент, который является членом семейства белков, содержащих домен vWFC, или имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидами (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Во втором варианте своего третьего аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43 и/или SEQ ID NO:45.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, будет далее называться "полипептидом INSP123".

Небольшое количество данных в EST, в основном EST для грызунов, позволяет предположить, что последовательность INSP123 должна присутствовать в кДНК-матрицах головного мозга или в нервной ткани.

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он предполагает, что первые 23 аминокислоты полипептида INSP123 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная полипептидная последовательность INSP123, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, будет далее называться "зрелым полипептидом INSP123".

Альтернативно, хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он предполагает, что первые 22 аминокислоты клонированного полипептида INSP123 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP123, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:41 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, будет далее называться "клонированным полипептидом INSP123". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:41, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 1 INSP123".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения он предполагает, что первые 21 аминокислоты клонированного полипептида INSP123 образуют сигнальный пептид.

Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP123, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO: соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, будет далее называться "клонированным полипептидом INSP123". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:43, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 2 INSP123".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения он предполагает, что первые 31 аминокислоты клонированного полипептида INSP123 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP123, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:39 и SEQ ID NO:45 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:39, будет далее называться "клонированным полипептидом INSP123". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:45, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 3 INSP123".

При этом предпочтительно, чтобы антигенная детерминанта, фрагмент или функциональный эквивалент второго варианта третьего аспекта настоящего изобретения содержали один или несколько из десяти цистеиновых остатков в положениях аминокислот 53, 74, 76, 78, 85, 90, 97, 105, 106 и SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, чтобы один или несколько из указанных цистеиновых остатков участвовали в образовании дисульфидной связи в физиологических условиях. В этом аспекте изобретения термин "физиологические условия" означает природное окружение, в котором может находиться нативный полипептид или полипептид дикого типа. Образование дисульфидной связи часто осуществляется вместе с формированием правильной конформации белка, а следовательно, и его функции, как единого целого. Поэтому очень важно, чтобы такие цистеиновые остатки были консервативными.

В третьем варианте своего третьего аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:

(i) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51 и/или SEQ ID NO:53;

(ii) представляет собой фрагмент, который является членом семейства белков, содержащих домен vWFC, или имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидами (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Предпочтительно, если полипептид третьего аспекта настоящего изобретения состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51 и/или SEQ ID NO:53.

При этом предпочтительно, чтобы антигенная детерминанта, фрагмент или функциональный эквивалент четвертого варианта третьего аспекта настоящего изобретения содержали один или несколько из десяти цистеиновых остатков в положениях аминокислот 53, 74, 76, 78, 85, 90, 97, 105, 106 и SEQ ID NO:12. Более предпочтительно, чтобы один или несколько из указанных цистеиновых остатков участвовали в образовании дисульфидной связи в физиологических условиях. И даже более предпочтительно, чтобы указанная антигенная детерминанта, фрагмент или функциональный эквивалент дополнительно содержали один или несколько из десяти цистеиновых остатков в положениях аминокислот 116, 134, 137, 139, 147, 152, 157, 167, 168 и 171.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, далее будет называться "полипептидом экзона 1 INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:8, далее будет называться "полипептидом экзона 2 INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, далее будет называться "полипептидом экзона INSP124".

Предполагается, что INSP124 аналогичен вентроптину, также известному как нейралин, антагонист BMP-4 (белок морфогенеза кости 4), экспрессируемый в виде двойного градиента белка в сетчатке. BMP представляют собой многофункциональные секретируемые белки, которые передают сигнал посредством специфических рецепторов. Они играют ключевую роль в хондрогенезе, на что указывает их способность индуцировать эктопический хондрогенез у взрослых животных (Chimal-Monroy J. et al., Dev.

Biol. 2003, May, 15:257(2):292-301).

Вентроптин является членом семейства хординов, и известно, что он является антагонистом ВМР2, а также ВМР4 (Takahashi H. et al., Development. 2003 Nov; 130(21):5203-15). Нарушение экспрессии вентроптина приводит к изменению характера экспрессии нескольких топографических генов в сетчатке и к прорастанию аксонов сетчатки в покровную структуру вдоль обеих осей. Таким образом, топографическое разрастание покровного слоя сетчатки, очевидно, обусловлено присутствием двойного градиента молекулы вентроптина вдоль обеих осей (Sakuta H. et al., Science, 2001 Jul, 6:293(5527):111-5). Во время органогенеза вентроптин обнаруживает широкой профиль экспрессии во многих тканях, таких как спинномозговые узлы, кишка, склерозирующие хрящи скелета и развивающиеся фолликулы волос (Coffinier C. et al., Mech. Dev. 2001 Jan, 100(1):119-22).

Недавно был идентифицирован новый хординоподобный белок, подобный хордину, CHL2, структура которого наиболее гомологична структуре вентроптина. При инъекции PHK CHL2 в эмбрионы Xenopus она индуцирует развитие вторичной оси. Было высказано предположение, что CHL2 может играть негативную роль в (ре)генерировании и созревании суставных хондроцитов в гиалиновом хряще как развивающихся, так и разрушающихся суставов (Nakayama N. et al., 2004 Jan; 131(1):229-40).

Небольшое количество данных EST, в основном для EST грызунов, позволяет предположить, что последовательность INSP124 должна присутствовать в нервной ткани.

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он предполагает, что первые 23 аминокислоты полипептида экзона 1 INSP124 образуют сигнальный пептид. Экзон 1 и полноразмерные полипептидные последовательности INSP124, без сигнальной последовательности, представлены в SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:16 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:14, далее будет называться "зрелым полипептидом экзона 1 INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:16, далее будет называться "зрелым полипептидом INSP124".

Альтернативно, хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он предполагает, что первые 22 аминокислоты клонированного полипептида INSP124 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP124, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49, соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:47, будет далее называться "клонированным полипептидом INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:49, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 1 INSP124".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения он предполагает, что первые 21 аминокислоты клонированного полипептида INSP124 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP124, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:51 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:47, будет далее называться "клонированным полипептидом INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:51, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 2 INSP124".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения, он предполагает, что первые 31 аминокислоты клонированного полипептида INSP124 образуют сигнальный пептид.

Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP124, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO: соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:47, далее будет называться "клонированным полипептидом INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:53, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 3 INSP124".

Используемый здесь термин "полипептиды экзонов INSP124" включает в себя полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 INSP124, полипептид экзона 2 INSP124, зрелый полипептид экзона 1 INSP124, полипептид экзона 3 INSP124, зрелый полипептид 1 INSP124, зрелый полипептид 2 INSP124 или зрелый полипептид 3 INSP124, а также полипептиды, состоящие из полипептида экзона 1 INSP124, зрелого полипептида экзона 1 INSP124, полипептида экзона 2 INSP124, полипептида экзона 3 INSP124, полипептида INSP124 или зрелого полипептида INSP124.

В пятом варианте своего третьего аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который:

(i) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59 и/или SEQ ID NO:61;

(ii) представляет собой фрагмент, который является членом семейства белков, содержащих домен vWFC, или имеет антигенную детерминанту, общую с полипептидами (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

В соответствии с шестым вариантом своего третьего аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51 и/или SEQ ID NO:53.

При этом предпочтительно, чтобы антигенная детерминанта, фрагмент или функциональный эквивалент шестого варианта третьего аспекта настоящего изобретения содержали один или несколько из десяти цистеиновых остатков в положениях аминокислот 69, 82, 90, 92, 100, 105, 110, 120, 121 и SEQ ID NO:26. Более предпочтительно, чтобы один или несколько из указанных цистеиновых остатков участвовали в образовании дисульфидной связи в физиологических условиях. Образование дисульфидной связи часто осуществляется вместе с формированием правильной конформации белка, а следовательно, и его функции, как единого целого. Поэтому очень важно, чтобы такие цистеиновые остатки были консервативными.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, далее будет называться "полипептидом экзона 1 INSP125". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:20, далее будет называться "полипептидом экзона 2 INSP125". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:22, далее будет называться "полипептидом экзона INSP125". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:24, далее будет называться "полипептидом экзона 4 INSP125".

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:26, далее будет называться "полипептидом INSP125".

Небольшое количество данных в EST, в основном EST для грызунов, позволяет предположить, что последовательность INSP125 должна присутствовать в нервной ткани.

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он высказывает предположение, что первые 23 аминокислоты полипептида экзона 1 INSP125 образуют сигнальный пептид. Экзон 1 и полноразмерные полипептидные последовательности INSP125 без сигнальной последовательности представлены в SEQ ID NO:28 и SEQ ID NO:30 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:28, далее будет называться "зрелым полипептидом экзона 1 INSP124". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:30, далее будет называться "зрелым полипептидом INSP125".

Альтернативно, хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако он предполагает, что первые 22 аминокислоты клонированного полипептида INSP125 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP125, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO: соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:55, далее будет называться "клонированным полипептидом INSP125". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:57, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 1 INSP125".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения он предполагает, что первые 21 аминокислоты клонированного полипептида INSP125 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP125, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:59 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:55, далее будет называться "клонированным полипептидом называться "клонированным зрелым полипептидом 2 INSP125".

Хотя заявитель не имеет намерения ограничиваться этой теорией, однако в альтернативном и предпочтительном варианте своего изобретения он предполагает, что первые 31 аминокислоты клонированного полипептида INSP125 образуют сигнальный пептид. Полноразмерная клонированная полипептидная последовательность INSP125, с сигнальной последовательностью или без сигнальной последовательности, представлена в SEQ ID NO:55 и SEQ ID NO:61 соответственно. Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:55, далее будет называться "клонированным полипептидом INSP125". Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:61, далее будет называться "клонированным зрелым полипептидом 3 INSP125".

Используемый здесь термин "полипептиды экзонов INSP125" включает полипептиды, содержащие полипептид экзона 1 INSP125, зрелый полипептид экзона 1 INSP125, полипептид экзона 2 INSP125, полипептид экзона 3 INSP125, полипептид экзона 4 INSP125, полипептид INSP125, зрелый полипептид 1 INSP125, зрелый полипептид 2 INSP125 или зрелый полипептид 3 INSP125, а также полипептиды, состоящие из полипептида экзона 1 INSP125, зрелого полипептида экзона 1 INSP125, полипептида экзона 2 INSP125, полипептида экзона 3 INSP125, полипептида экзона 4 INSP125, полипептида INSP125 или зрелого полипептида INSP125.

Как уже объяснялось в первом аспекте настоящего изобретения, идентификация новых белков, содержащих домены vWFC, имеет большое практическое значение, поскольку было обнаружено, что такие домены играют важную роль в патогенезе заболеваний широкого спектра, включая заболевания, ассоциированные с процессами развития, такими как развитие хряща и костей скелета.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

Очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:1 (кодирующую полипептид INSP123), SEQ ID NO:3 (кодирующую зрелый полипептид INSP123), SEQ ID NO:5 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP124), SEQ ID NO:7 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP124), SEQ ID NO:9 (кодирующую полипептид экзона 3 INSP124), SEQ ID NO:11 (кодирующую полипептид INSP124), SEQ ID NO:13 (кодирующую зрелый полипептид INSP124), SEQ ID NO:15 (кодирующую зрелый полипептид экзона 1 INSP124), SEQ ID NO:17 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP125), SEQ ID NO:19 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP125), SEQ ID NO:21 (кодирующую полипептид экзона 3 INSP125), SEQ ID NO:23 (кодирующую полипептид экзона 4 INSP125), SEQ ID NO:25 (кодирующую полипептид INSP125), SEQ ID NO:27 (кодирующую зрелый полипептид экзона 1 INSP125), SEQ ID NO:29 (кодирующую зрелый полипептид INSP125), SEQ ID NO:38 (кодирующую клонированный полипептид INSP123), SEQ ID NO:40 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 1 INSP123), SEQ ID NO:42 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 2 INSP123), SEQ ID NO:44 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 3 INSP123), SEQ ID NO:46 (кодирующую клонированный полипептид INSP124), SEQ ID NO:48 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 1 INSP124), SEQ ID NO:50 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 2 INSP124), SEQ ID NO:52 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 3 INSP124), SEQ ID NO:54 (кодирующую клонированный полипептид INSP125), SEQ ID NO:56 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 1 INSP125), SEQ ID NO:58 (кодирующую клонированный зрелый полипептид 2 INSP125) и/или либо является избыточным эквивалентом или фрагментом любой из этих последовательностей.

В настоящем изобретении также предусматривается, что указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO:1 (кодирующей полипептид INSP123), SEQ ID NO:3 (кодирующей зрелый полипептид INSP123), SEQ ID NO:5 (кодирующей полипептид экзона 1 INSP124), SEQ ID NO:7 (кодирующей полипептид экзона 2 INSP124), SEQ ID NO:9 (кодирующей полипептид экзона 3 INSP124), SEQ ID NO:11 (кодирующей полипептид INSP124), SEQ ID NO:13 (кодирующей зрелый полипептид INSP124), SEQ ID NO:15 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 INSP124), SEQ ID NO:17 (кодирующей полипептид экзона 1 INSP125), SEQ ID NO:19 (кодирующей полипептид экзона 2 INSP125), SEQ ID NO:21 (кодирующей полипептид экзона 3 INSP125), SEQ ID NO:23 (кодирующей полипептид экзона 4 INSP125), SEQ ID NO:25 (кодирующей полипептид INSP125), SEQ ID NO:27 (кодирующей зрелый полипептид экзона 1 INSP125), SEQ ID NO:29 (кодирующей зрелый полипептид INSP125), SEQ ID NO:38 (кодирующей клонированный полипептид INSP123), SEQ ID NO:40 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 1 INSP123), SEQ ID NO:42 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 2 INSP123), SEQ ID NO:44 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 3 INSP123), SEQ ID NO:46 (кодирующей клонированный полипептид INSP124), SEQ ID NO:48 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 1 INSP124), SEQ ID NO:50 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 2 INSP124), SEQ ID NO:52 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 3 INSP124), SEQ ID NO:54 (кодирующей клонированный полипептид INSP125), SEQ ID NO:56 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 1 INSP125), SEQ ID NO:58 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 2 INSP125) и/или SEQ ID NO:60 (кодирующей клонированный зрелый полипептид 3 INSP125), либо является избыточным эквивалентом или фрагментом любой из этих последовательностей.

В соответствии с одним из вариантов этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит сигнального пептида, расположенного у старт-кодона полипептида INSP123 (аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:2), полипептида экзона 1 INSP124 (аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:6), полипептида INSP124 (аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:12), полипептида экзона 1 INSP125 (аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:18) или полипептида INSP125 (аминокислоты 1-23 SEQ ID NO:26).

В соответствии с этим вариантом молекула очищенной нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нуклеотиды 70-417 SEQ ID NO:1 (представленные в SEQ ID NO:3 и кодирующие зрелый полипептид INSP123), нуклеотиды 70-390 SEQ ID NO:5 (представленные в SEQ ID NO:13 и кодирующие зрелый полипептид экзона 1 INSP124), нуклеотиды 70-669 SEQ ID NO:11 (представленные в SEQ ID NO:15 и кодирующие зрелый полипептид INSP124), нуклеотиды 70-100 SEQ ID NO:17 (представленные в SEQ ID NO:27 и кодирующие зрелый полипептид экзона 1 INSP125) или нуклеотиды 70-528 SEQ ID NO:25 (представленные в SEQ ID NO:29 и кодирующие зрелый полипептид INSP125).

Альтернативно, в соответствии со вторым вариантом этого аспекта настоящего изобретения, очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит сигнального пептида, расположенного у старткодона полипептида INSP123 (аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:39), полипептида INSP124 (аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:43) или полипептида INSP125 (аминокислоты 1-22 SEQ ID NO:47).

В соответствии с этим вариантом молекула очищенной нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нуклеотиды 67-414 SEQ ID NO:38 (представленные в SEQ ID NO:40 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 1 INSP123), нуклеотиды 67-666 SEQ ID NO:46 (представленные в SEQ ID NO:48 и кодирующие клонированный нуклеотиды 67-525 SEQ ID NO:54 (представленные в SEQ ID NO:56 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 1 INSP125).

Альтернативно и предпочтительно, в соответствии с третьим вариантом этого аспекта настоящего изобретения очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит сигнального пептида, расположенного у старт-кодона полипептида INSP123 (аминокислоты 1-21 SEQ ID NO:39), полипептида INSP124 (аминокислоты 1-21 SEQ ID NO:47) или полипептида INSP125 (аминокислоты 1-21 SEQ ID NO:55).

В соответствии с этим вариантом, молекула очищенной нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нуклеотиды 64-414 SEQ ID NO:38 (представленные в SEQ ID NO:42 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 2 INSP123), нуклеотиды 44-666 SEQ ID NO:46 (представленные в SEQ ID NO:50 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 2 INSP124) или нуклеотиды 64-525 SEQ ID NO:54 (представленные в SEQ ID NO:58 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 2 INSP125).

Альтернативно и предпочтительно, в соответствии с четвертым вариантом этого аспекта настоящего изобретения, очищенная молекула нуклеиновой кислоты не содержит сигнального пептида, расположенного у старт-кодона полипептида INSP123 (аминокислоты 1-31 SEQ ID NO:39), полипептида INSP124 (аминокислоты 1-31 SEQ ID NO:47) или полипептида INSP125 (аминокислоты 1-31 SEQ ID NO:55).

В соответствии с этим вариантом молекула очищенной нуклеиновой кислоты предпочтительно включает нуклеотиды 94-414 SEQ ID NO:38 (представленные в SEQ ID NO:44 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 3 INSP123), нуклеотиды 94-666 SEQ ID NO:46 (представленные в SEQ ID NO:52 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 3 INSP124) или нуклеотиды 94-525 SEQ ID NO:54 (представленные в SEQ ID NO:60 и кодирующие клонированный зрелый полипептид 3 INSP125).

Кроме того, настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, состоящей из нуклеотидов 70-417 SEQ ID NO:1 (представленных в SEQ ID NO:3 и кодирующих зрелый полипептид INSP123), нуклеотидов 70-390 SEQ ID NO:5 (представленных в SEQ ID NO:13 и кодирующих зрелый полипептид экзона 1 INSP124), нуклеотидов 70-669 SEQ ID NO:11 (представленных в SEQ ID NO:15 и кодирующих зрелый полипептид INSP124), нуклеотидов 70-100 SEQ ID NO:17 (представленных в SEQ ID NO:27 и кодирующих зрелый полипептид экзона 1 INSP125), нуклеотидов 70-528 SEQ ID NO:25 (представленных в SEQ ID NO:29 и кодирующих зрелый полипептид INSP125), нуклеотидов 67-414 SEQ ID NO:38 (представленных в SEQ ID NO:40 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 1 INSP123), нуклеотидов 64-414 SEQ ID NO:38 (представленных в SEQ ID NO:42 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 2 INSP123), нуклеотидов 94-414 SEQ ID NO:38 (представленных в SEQ ID NO:44 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 3 INSP123), нуклеотидов 67-666 SEQ ID NO:46 (представленных в SEQ ID NO:48 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 1 INSP124), нуклеотидов 44-666 SEQ ID NO:46 (представленных в SEQ ID NO:50 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 2 INSP124), нуклеотидов 94-666 SEQ ID NO:46 (представленных в SEQ ID NO:52 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 3 INSP124), нуклеотидов 67-525 SEQ ID NO:54 (представленных в SEQ ID NO:56 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 1 INSP125), нуклеотидов 64-525 SEQ ID NO:54 (представленных в SEQ ID NO:58 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 2 INSP125) или нуклеотидов 94-525 SEQ ID NO:54 (представленных в SEQ ID NO:60 и кодирующих клонированный зрелый полипептид 3 INSP125).

- 20 В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты четвертого аспекта настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты четвертого или пятого аспекта настоящего изобретения. Предпочтительными векторами являются следующие экспрессирующие векторы:

pCR4-TOPO-INSP123 (фиг. 9), pDONR (фиг. 10), pEAK12d (фиг. 11), pDEST12.2 (фиг. 12), pENTR-INSP123-6HIS (фиг. 13), pEAK12d-INSP123-6HIS (фиг. 14), pDEST12.2-INSP123-6HIS (фиг. 15), pCR4-BluntII-TOPO-INSP124 (фиг. 19), pDONR 221 (фиг. 20), pEAK12d (фиг. 21), pDEST12.2 (фиг. 22), pENTR_INSP124-6HIS (фиг. 23), pEAK12d_INSP124-6HIS (фиг. 24), pDEST12.2_INSP124-6HIS (фиг. 25), pCR4-TOPO-INSP125 (фиг. 29), pDONR 221 (фиг. 30), pEAK12d (фиг. 31), pDEST12.2 (фиг. 32), pENTR_INSP125-6HIS (фиг. 33), pEAK12d_INSP125-6HIS (фиг. 34) и pDEST12.2_INSP125-6HIS (фиг. 35).

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной вектором шестого аспекта настоящего изобретения.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с членом семейства белков, содержащих домен vWFC, второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным для модификации экспрессии природного гена, кодирующего полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или для регуляции активности полипептида второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

Соединение девятого аспекта настоящего изобретения может либо повышать (действовать как агонист), либо снижать (действовать как антагонист) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125 дает возможность разработать способы скрининга, позволяющие идентифицировать соединения, эффективные для лечения и/или диагностики заболевания. Лиганды и соединения восьмого и девятого аспектов настоящего изобретения могут быть идентифицированы с применением указанных способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду второго или третьего аспекта изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты четвертого, либо пятого аспектов изобретения, или к вектору шестого аспекта изобретения, или к клетке-хозяину седьмого аспекта изобретения, или к лиганду восьмого аспекта изобретения, или к соединению девятого аспекта изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики заболеваний, в патогенезе которых участвуют члены семейства белков, содержащих домен vWFC. Такими заболеваниями могут быть клеточно-пролиферативные расстройства, включая неоплазму, меланому, опухоли легких, толстой кишки, молочной железы, поджелудочной железы, головы и шеи и другие солидные опухоли;

миелопролиферативные расстройства, такие как лейкоз, не-ходжскинская лимфома, лейкопения, тромбоцитопения, нарушение ангиогенеза, саркома Капоши;

аутоиммунные/воспалительные заболевания, включая аллергию, воспалительные заболевания кишечника, артрит, псориаз и воспаления дыхательных путей, астму и отторжение трансплантата;

сердечно-сосудистые расстройства, включая гипертензию, отек, стенокардию, атеросклероз, тромбоз, сепсис, шок, реперфузионные поражения и ишемию;

неврологические расстройства, включая заболевания центральной нервной системы, болезнь Альцгеймера, повреждение головного мозга, амиотрофический боковой склероз и боли;

нарушения развития, такие как нарушение развития хряща и костей скелета, включая остеоартрит;

метаболические расстройства, включая сахарный диабет, остеопороз и ожирение;

СПИД и болезни почек;

инфекции, паразитарные инфекции и другие патологические состояния.

Предпочтительно, чтобы такими заболеваниями были заболевания, в патогенезе которых участвуют белки, содержащие домен vWFC. Эти молекулы могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний. Указанные молекулы могут быть также использованы для контрацепции или для лечения репродуктивных расстройств, включая бесплодие.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, предусматривающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид второго или третьего аспектов изобретения, или активности полипептида второго или третьего аспектов изобретения, в тканях указанного пациента, и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является признаком заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение всего периода времени по сравнению с контрольным уровнем является признаком рецидива заболевания.

Предпочтительный способ детекции полипептидов второго или третьего аспектов изобретения включает стадии (а) контактирования лиганда, такого как антитело восьмого аспекта изобретения, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса "лиганд-полипептид", и (b) детекции указанного комплекса.

Что касается одиннадцатого аспекта изобретения, то каждому читателю известно, что для детекции аномальных уровней белка существует ряд различных методов, таких как гибридизация нуклеиновой кислоты с короткими зондами, анализ на точковую мутацию, амплификация с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет проводить мониторинг терапевтического лечения заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к наборам, которые могут быть использованы в указанных методах диагностики заболевания.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептида второго или третьего аспекта изобретения как белка, содержащего домен vWFC. Подходящим применением полипептидов настоящего изобретения в качестве белков, содержащих домен vWFC, является их использование в качестве регуляторов клеточного роста, метаболизма или дифференцировки; в качестве части пары рецептор/лиганд; а также в качестве диагностического маркера физиологического или патологического состояния.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или молекулу нуклеиновой кислоты четвертого или пятого аспекта настоящего изобретения, или вектор шестого аспекта настоящего изобретения, или клетку-хозяина седьмого аспекта настоящего изобретения, или лиганд восьмого аспекта изобретения, или соединение девятого аспекта настоящего изобретения в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты четвертого или пятого аспекта настоящего изобретения, или к вектору шестого аспекта настоящего изобретения, или к клеткехозяину седьмого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду восьмого аспекта изобретения, или к соединению девятого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы в целях изготовления лекарственного средства для диагностики или лечения заболевания.

В своем пятнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты четвертого или пятого аспекта настоящего изобретения, или вектора шестого аспекта настоящего изобретения, или клетки-хозяина седьмого аспекта настоящего изобретения, или лиганда восьмого аспекта изобретения, или соединения девятого аспекта настоящего изобретения.

Если пациент страдает заболеванием, при котором уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или уровень активности полипептида второго или третьего аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны быть агонистами. И наоборот, если пациент страдает заболеванием, при котором уровень экспрессии природного гена или уровень активности указанного полипептида выше, чем уровень экспрессии или активности у здорового пациента, то полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны быть антагонистами. Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

- 22 В своем шестнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным (за исключением человека) или к животным (за исключением человека), дефицитным по полипептиду второго или третьего аспекта настоящего изобретения, которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни полипептида второго или третьего аспекта изобретения или вообще не экспрессируют указанный полипептид. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга для идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания.

Ниже приводится краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Изобретательский уровень настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

В этом описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и иммунологические методы, которые хорошо известны специалистам в этой области.

Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящее описание, которое может быть использовано в качестве руководства, приводится в следующих работах:

Sambrook Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (1989);

DNA Cloning, Vol. I and II (D.N Glover ed. 1985);

Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984);

Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984);

Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984);

Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986);

Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986);

B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);

the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially vol.154 & 155;

Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);

Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London);

Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.) and Handbook of Experimental Immunology, Vol. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).

Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислоты, связанные друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам и олигопептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препро-белка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препро-части этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препро-последовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность либо она может представлять собой последовательность, используемую для удаления зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка. Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, про-последовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые не входят в ряд из 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPI-якоря, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое переносом РНК, такое как аргинилирование; и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.

Функционально эквивалентные полипептиды третьего аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам INSP123, INSP124 и INSP125. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин "сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена (Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin A.M. & Griffin H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov M. & Devereux, J. eds., M. Stockton Press, New York, 1991).

Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшихся в результате географических изменений видов, от которых они происходят) и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ile; между Ser и Thr; между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; между основными остатками Lys и Arg, или между ароматическими остатками Phe и Tyr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, т.е. от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются "молчащие" замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков включают группу-заместитель.

Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов второго или третьего аспекта настоящего изобретения были более чем на 80% идентичны последовательностями полипептидов INSP123, INSP124 или INSP125 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98 или 99% соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами второго или третьего аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока данных для генома (Inpharmatica Genome Threader), которая составляет один из аспектов способов поиска, используемых для создания базы данных поиска Biopendium™, может быть применена (см. заявку PCT WO 01/69507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами INSP123, INSP124 и INSP125, высказывается предположение, что они представляют собой члены семейства белков, содержащих домен vWFC, и где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептидов INSP123, INSP и INSP125. Термин "значительная структурная гомология" означает, что технология Inpharmatica Genome Threader позволяет предсказать, что два белка имеют общую структурную гомологию с достоверностью 10% и выше.

Полипептиды второго или третьего аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125 и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125 при условии, что эти фрагменты являются членами семейства белков, содержащих vWFC, или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидами INSP123, INSP124 и INSP125.

Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей аминокислотной последовательности полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125, или одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать по крайней мере n смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности n предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Фрагменты полноразмерных полипептидов INSP123, INSP124 и INSP125 могут состоять из комбинаций 2, 3 или 4 соседних последовательностей экзонов в полипептидных последовательностях INSP123, INSP124 и INSP125 соответственно.

Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме", т.е. они могут не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют.

Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако несколько фрагментов могут входить в состав одного более крупного полипептида.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие по крайней мере одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Для любого читателя совершенно очевидно, что такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин "белок" означает полипептиды, включая, но не ограничиваясь ими, полипептиды, которые обладают функциями ферментов. Предпочтительно, чтобы белок или полипептид настоящего изобретения обладал функцией лиганда. В контексте настоящего изобретения термин "лиганд" означает молекулу, которая связывается с другой молекулой, такой как рецептор. Лиганд может служить кофактором для фермента. Термин "иммуноспецифический" означает, что данные антитела имеют в основном более высокую аффинность по отношению к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Такие антитела связываются с полипептидами второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом второго или третьего аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами рекомбинантных ДНК либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если это необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например иммуноаффинной хроматографией.

- 25 Моноклональные антитела против полипептидов второго или третьего аспектов настоящего изобретения могут быть также легко продуцированы любым специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна специалистам (см. например, Kohler G. & Milstein, C. Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов второго или третьего аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, т.е. на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области объединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их "гуманизации" (см., Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl.. Acad. Sci., USA, 88, 34181 (1991) and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин "гуманизованное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизованное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью связываться с донорным антителом.

В другом альтернативном варианте изобретения таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, т.е. антитело, имеющее два различных антиген-связывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, способные связываться с полипептидами настоящего изобретения, либо из репертуара ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов человека, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки генов "необученных" лимфоцитов может быть использована техника фагового представления (McCafferty J. et al. (1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992), Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (Clackson T. et al. (1991) Nature 352, 624-628).

Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, т.е. они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или в твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для использования в указанных целях эти антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты четвертого и пятого аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59 и SEQ ID NO:61, и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящем изобретении. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения предпочтительно содержат по крайней мере n смежных нуклеотидов в описанных здесь последовательностях, где n, в зависимости от конкретной последовательности, равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК.

Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделение из геномных или кДНК-библиотек или выделение из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть в основном генерированы путем in vitro- или in vivo-транскрипции ДНК-последовательностей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также включает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA). Используемый здесь термин "PNA" означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из пяти нуклеотидов и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые предпочтительно заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. Для продления их времени жизни в клетке PNA могут быть ПЭГилированы, где они предпочтительно связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК, что приводит к прекращению элонгации транскрипта (Nielsen P.E. et al. (1993), Anticancer Drug Des.

8:53-63).

Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид настоящего изобретения, может быть идентична кодирующей последовательности одной или нескольких описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты.

Эти молекулы могут также иметь другую последовательность, которая, в результате вырожденности генетического кода, кодирует полипептид SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59 и/или SEQ ID NO:61. Такими молекулами нуклеиновой кислоты могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препро-полипептидную последовательность;

кодирующая последовательность зрелого полипептида с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями или без них либо вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибированные нетранслированные последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.

Молекулы нуклеиновой кислоты четвертого и пятого аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов второго или третьего аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.

Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также сконструированы методами, в основном известными специалистам, включая, в зависимости от преследуемых целей, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть применен для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид второго или третьего аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят в четвертый или пятый аспекты настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который может распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида настоящего изобретения и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.

- 27 Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются антисмысловые молекулы, которые частично комплементарны молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, а поэтому, они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, хорошо известными специалистам, указанные антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы они распознавали нужную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид настоящего изобретения, специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию (см. например, Cohen J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J.

Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991).

Используемый здесь термин "гибридизация" означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или BLOTTO); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля) и жесткость условий промывки после гибридизации [Sambrook et al. (см. выше)].

Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам [Sambrook et al. (см. выше)]. В основном гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и будет ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у Wahl G.M. и S.L. Berger, 1987; Methods Enzymol. 152:399-407 и Kimmel A.R. 1987; Methods Enzymol. 152:507-511.

Термин "жесткость" означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации очень схожих молекул, но не способствуют ассоциации значительно отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°C в растворе, содержащем 50% формамид, 5SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1SSC приблизительно при 65°C. Условия низкой жесткости предусматривают проведение реакции гибридизации, осуществляемой при 35°C [Sambrook et al. (см. выше)]. Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.

В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды INSP123, INSP124 или INSP125, и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые в основном комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по крайней мере на 80% идентична таким кодирующим последовательностям, либо чтобы эта молекула представляла собой молекулу нуклеиновой кислоты, комплементарную таким последовательностям. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, а особенно предпочтительно по крайней мере на 98, 99% или более были идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают в основном такой же биологической функцией или активностью, как и полипептиды INSP123, INSP124 и INSP125.

Настоящее изобретение относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, включающему стадии (а) контактирования нуклеотидного зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов; и (b) детекции любого из таких образованных дуплексов.

Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды INSP123, INSP124 и INSP125, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных или ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.

В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и в основном доступны специалистам, и могут быть реально использованы для методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (US Biochemical Corp., Cleveland, ОН), полимераза Taq (Perkin Elmer), термостабильная полимераза T (Amersham, Chicago, IL), или комбинация таких полимераз, и корректирующие экзонуклеазы, такие как экзонуклеазы, присутствующие в системе ELONGASE Amplification System, поставляемой Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), термоячейка Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA), катализатор ABI и ДНК-секвенаторы 373 и 377, DNA Sequencers (Perkin Elmer).



Pages:   || 2 | 3 |
Похожие работы:

«PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com 2007 году МОУ Гимназия отмечает 20-летний юбилей. За эти годы в гимназии сформировался опытный, творческий педагогический коллектив единомышленников, увлеченных общим делом. Наши педагоги находятся в постоянном поиске нового. Идти вперед, жить завтрашним днем, новыми идеями, стремиться к новым вершинам, быть тем огнем, который зажигает звезды своих учеников, – этими словами можно выразить педагогическую концепцию коллектива гимназии....»

«О представлении к защите диссертационных работ в совет Д 212.337.01 при Пензенской государственной технологической академии по защите докторских и кандидатских диссертаций по специальностям 05.13.17 – Теоретические основы информатики (технические наук и), 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ (технические науки) Составлено на основе документов: Положение о порядке присуждения ученых степеней, утвержденное Постановлением Правительства РФ от 30 января 2002...»

«ПРОЕКТ Публичный доклад федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сахалинский государственный университет О состоянии и перспективах развития Сахалинского государственного университета 2012–2013 уч. г. 1. Общая характеристика вуза 1.1. Тип, вид, статус учреждения Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Сахалинский государственный университет (далее – Университет или...»

«Учредитель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский университет) Основной целью издания является пропаганда научных исследований в следующих областях: Вычислительная математика и численные методы • Информатика • Математическое программирование • Математическое и программное обеспечение • Распознавание образов высокопроизводительных вычислительных систем •...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тюменский государственный нефтегазовый университет УТВЕРЖДАЮ Проректор по УМР и ИР Майер В.В. _ 2013 г. ОТЧЕТ О САМООБСЛЕДОВАНИИ ОСНОВНОЙ ПРОФЕССИОНАЛЬНОЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ ПО ПРОФЕССИИ 220703.03 Электромонтер охранно-пожарной сигнализации Директор института кибернетики, информатики и связи _ Паутов Д.Н. Заведующий отделением...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное агентство по образованию Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского В.Е. АЛЕКСЕЕВ, В.А. ТАЛАНОВ ГРАФЫ. МОДЕЛИ ВЫЧИСЛЕНИЙ. СТРУКТУРЫ ДАННЫХ Учебник Рекомендовано Научно-методическим советом по прикладной математике и информатике УМО университетов РФ в качестве учебника для студентов, обучающихся по специальности 010200 – Прикладная математика и информатика и по направлению 510200 – Прикладная математика и...»

«Правительство Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Национальный исследовательский университет Высшая школа экономики Факультет бизнес-информатики Программа дисциплины Алгебра для направления 231000.62 Программная инженерия подготовки бакалавра Авторы программы: А.П. Иванов, к.ф.-м.н., ординарный профессор, IvanovAP@hse.perm.ru А.В. Морозова, ст. преподаватель, MorozovaAV@hse.perm.ru Одобрена на заседании...»

«:гентство овязи Федора_ттьное € еверо -1{авказский филиа_тт государственного образовательного бтодкетного г{рех(дения федера-тльного вь1с1пего профоссионального образования ]!1осковского технического университота связи и информатики смк_о-1.02-01-14 скФ мтуси смк_о_1.02-01'!4 Фтчёт о самообследовании утввРкдА!о мтуси Аир9крр скФ мецко отчвт самообследовании скФ мтуси смк_о_1.02-0|- Берсия 1. Ростов-на-Аону ]- / Фамшлия/|1одппсь Аата.(олэкность [.[1.Беленький щ }Р ?а/4а. €оставил }ам....»

«План издания учебной и научной литературы на 1 полугодие 2014 г 2 16 Институт информационных технологий и автоматизации..... Институт менеджмента и внешнеэкономической деятельности Кафедра интеллектуальных систем и защиты информации 2 Кафедра бухгалтерского учета и аудита 16 Кафедра сопротивления материалов 6 Кафедра менеджмента 16 Кафедра машиноведения 6 Институт прикладного искусства Кафедра автоматизации пpоизводственных процессов 7 Кафедра технологии художественной обработки материалов...»

«Билл Гейтс Дорога в будущее Билл Гейтс Билл Гейтс, глава корпорации Microsoft, размышляет об удивительных возможностях и непростых проблемах наступающего информационного века. Он раскрывает перед читателем свое видение будущего, рассказывает об основах информатики, развитии мировой компьютерной индустрии, о влиянии вычислительной техники на все стороны жизни общества, в том числе на бизнес и образование. Уделяет много внимания прошлому, настоящему и будущему глобальной сети Internet. Читатели...»

«МИНОБРНАУКИ РОССИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ НОВОСИБИРСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ, НГУ) Кафедра систем информатики Иван Валентинович Гурлев Пространственный анализ амплитуд отраженных продольных волн в азимутально-анизотропных средах МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ по направлению высшего профессионального образования 230100.68 ИНФОРМАТИКА И...»

«Правительство Российской Федерации Санкт-Петербургский государственный университет РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В АДМИНИСТРАТИВНОМ УПРАВЛЕНИИ INFORMATION TECHNOLOGIES IN ADMINISTRATION Язык(и) обучения Русский Трудомкость (границы трудомкости) в зачетных единицах: _2_ Регистрационный номер рабочей программы: 022664 Санкт-Петербург 2014 2 Раздел 1. Характеристики учебных занятий Цели и задачи учебных занятий 1.1. Курс Информационные технологии в административном...»

«МЕЖДУНАРОДНЫЙ КОНГРЕСС ПО ИНФОРМАТИКЕ: ИНФОРМАЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ И ТЕХНОЛОГИИ Материалы международного научного конгресса Республика Беларусь, Минск, 31 октября – 3 ноября 2011 года INTERNATIONAL CONGRESS ON COMPUTER SCIENCE: INFORMATION SYSTEMS AND TECHNOLOGIES Proceedings of the International Congress Republic of Belarus, Minsk, October' 31 – November' 3, 2011 В ДВУХ ЧАСТЯХ Часть 2 МИНСК БГУ УДК 37:004(06) ББК 74р.я М Р е д а к ц и о н н а я к о л л е г и я: С. В. Абламейко (отв. редактор), В....»

«Математическая биология и биоинформатика. 2013. Т. 8. № 1. С. 135–160. URL: http://www.matbio.org/2013/Ponomarev_8_135.pdf ================== МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ================= УДК: 538.9, 51-76 Дырочная проводимость в неоднородных фрагментах ДНК * **1 ©2013 Пономарев О.А. 1, Шигаев А.С., Жуков А.И. 2, Лахно В.Д. 1 Институт математических проблем биологии, Российская академия наук, Пущино, 1 Московская область, 142290, Россия Московский государственный университет дизайна и...»

«Кирикчи Василий Павлович Эволюция развития, организация и экономические аспекты внедрения IPTV Специальность: 5А522104 – Цифровое телевидение и радиовещание Диссертация на соискание академической степени магистра Работа рассмотрена Научный руководитель и допускается к защите к.т.н., доцент Абдуазизов А.А. зав. кафедрой ТВ и РВ к.т.н., доцент В.А. Губенко (подпись) (подпись) _ 2012...»

«Направление подготовки: 010300.68 Фундаментальная информатика и информационные технологии (очная, очно-заочная) Объектами профессиональной деятельности магистра фундаментальной информатики и информационных технологий являются научно-исследовательские и опытноконструкторские проекты, математические, информационные, имитационные модели систем и процессов; программное и информационное обеспечение компьютерных средств, информационных систем; языки программирования, языки описания информационных...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет в г. Анжеро-Судженске 1 марта 2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по дисциплине Отечественная история (ГСЭ.Ф.3) для направления 080800.62 Прикладная информатика факультет информатики, экономики и математики курс: 1 экзамен: 1 семестр семестр: 1 лекции: 18 часов практические занятия: 18 часов...»

«Федеральное государственное образовательное бюджетное учреждение высшего профессионального образования ПОВОЛЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТЕЛЕКОММУНИКАЦИЙ И ИНФОРМАТИКИ РУКОВОДЯЩИЙ РД ПГУТИ 2.35.7 – 2013 (версия 2) ДОКУМЕНТ Система управления качеством образования РЕЙТИНГОВАЯ ОЦЕНКА ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ПРОФЕССОРСКО-ПРЕПОДАВАТЕЛЬСКОГО СОСТАВА Положение Самара РД ПГУТИ 2.35.7 – 2013 (версия 2) Рейтинговая оценка деятельности профессорско-преподавательского состава. Положение Предисловие 1 РАЗРАБОТАН...»

«взаимодействующие поеледрвателш процессы Prentice-Hall InfernaHoB^il Series in Compuler Science Coitimtihicating Sequential Processes C. A. R. Hoare Professor of Computation Oxford University Prentice-Hall Englewood Cliffs, New Jersey London Mexico New Delhi Rio de Janeiro Singapore Sydney Tokyo Toronto Wellington Ч-Хоар Взаимодействующие последовательные процессы Перевод с английского А. А. Бульонковой под редакцией А. П. Ершова Москва Мир 1989 Б Б К 22.18 Х68 УДК 681.3 Хоар Ч. 'Х68...»

«Международный консорциум Электронный университет Московский государственный университет экономики, статистики и информатики Евразийский открытый институт И.А. Киселева Моделирование рисковых ситуаций Учебно-практическое пособие Москва 2007 1 519.86 УДК 65.050 ББК 44 К Киселева И.А. МОДЕЛИРОВАНИЕ РИСКОВЫХ СИТУАЦИЙ: Учебно-практическое пособие / Евразийский открытый институт. – М.: МЭСИ, 2007. – 102 с. Данное пособие предназначено для студентов экономических вузов. Большое внимание в нем уделено...»






 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.