WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания на клеточной ...»

-- [ Страница 1 ] --

007985

Настоящее изобретение относится к новым белкам (обозначенным INSP052 и INSP055), идентифицированным в настоящей заявке как молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие

иммуноглобулиновый домен, и к использованию этих белков и последовательностей нуклеиновых кислот генов, кодирующих эти белки, для диагностики, профилактики и лечения заболеваний.

Все процитированные здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Предшествующий уровень техники В настоящее время в области разработки лекарственных средств произошел крутой перелом, который положил начало новой эре функциональной геномики, пришедшей на смену старым методам. Термин "функциональная геномика" применяется к способам использования средств биоинформатики для приписывания функций последовательностям белков, представляющих интерес для специалистов. Такие средства становятся все более необходимыми, и это связано с тем, что оснащение научно-исследовательских лабораторий, занимающихся определением функций последовательностей этих белков, пока не дает возможности быстро обрабатывать все нарастающий поток данных для этих последовательностей.

Поскольку эффективность и точность методов биоинформатики возрастает, то эти методы быстро вытесняют стандартные методы биохимической характеризации. Действительно, современные средства биоинформатики, используемые для идентификации белков настоящего изобретения, позволяют получать окончательные результаты с достаточной высокой степенью достоверности.

Различные институты и коммерческие организации занимаются обработкой непрерывно поступающих данных о последовательностях, и на основе полученных результатов они приходят к важным открытиям. Однако необходимость в идентификации и характеризации других генов и полипептидов, кодируемых этими генами, в целях их дальнейшего исследования и поиска новых лекарственных средств, все еще остается актуальной.

Недавно, заявителем настоящего изобретения был разработан превосходный способ оценки последовательностей с неизвестной функцией. Этот способ представляет собой систему генерирования базы данных, называемую поисковой базой данных Biopendium, которая рассматривается в WO 01/69507. Эта система базы данных состоит из общего источника данных, созданного с использованием запатентованной технологии и содержащего информацию, полученную в результате всестороннего сравнения всех имеющихся последовательностей белков или нуклеиновых кислот.

Помимо объединения данных об этих последовательностях, взятых из отдельных источников, необходимо также объединить как можно больше данных, относящихся как к самим последовательностям, так и к соответствующей информации для каждой последовательности, в один общий источник. Для этого, все имеющиеся данные, относящиеся к каждой последовательности, включая данные о трехмерной структуре кодируемого белка, если они имеются, суммируют в одно целое, что позволяет наилучшим образом использовать данные, имеющиеся для каждой последовательности, и таким образом, дает возможность сделать в высокой степени обоснованный прогноз исходя из сравнения этих последовательностей. Комментарии, которые имеются в указанной базе данных и приводятся для каждой последовательности, позволяют рассматривать информацию о последовательностях в нужном биологическом аспекте.





Такой источник данных дает возможность точно предсказать функцию белка исходя из отдельно взятой последовательности. С использованием стандартной технологии можно проводить оценку лишь тех белков, последовательности которых в высокой степени идентичны (примерно выше 20-30%) последовательностям других белков одного и того же функционального семейства. При этом невозможно точно предсказать функции белков, которые имеют очень низкую степень гомологии последовательностей по отношению к другим родственным белкам с известной функцией.

Белки, содержащие сигнальный пептид Способность клеток продуцировать и секретировать внеклеточные белки является главным фактором во многих биологических процессах. Ферменты, факторы роста, белки внеклеточного матрикса и молекулы, передающие сигналы, секретируются клетками. Это происходит в результате слияния секреторной везикулы с плазматической мембраной. В большинстве случаев, но не всегда, белки транспортируются в эндоплазматический ретикулум и в секреторные везикулы посредством сигнального пептида.

Сигнальные пептиды представляют собой цис-активные последовательности, которые влияют на транспорт полипептидных цепей из цитоплазмы в мембрано-ассоциированный компартмент, такой как секреторная везикула. Полипептиды, которые доставляются в секреторные везикулы, либо секретируются во внеклеточный матрикс, либо удерживаются в плазматической мембране. Полипептиды, которые удерживаются в плазматической мембране, имеют один или несколько трансмембранных доменов. Примерами белков, содержащих сигнальный пептид, которые играют главную роль в функционировании клеток, являются цитокины, гормоны, белки внеклеточного матрикса, адгезивные молекулы, рецепторы, протеазы и факторы роста и дифференцировки.

Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен Было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, играют определенную роль в различных физиологических функциях, и многие из них могут играть определенную роль в паралогических процессах. Изменение их активности влечет за собой -1изменение фенотипа заболевания, а поэтому такая идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, является крайне необходимой, поскольку указанные молекулы могут играть определенную роль во многих заболеваниях, а в частности, в воспалительных, онкологических и в сердечно-сосудистых заболеваниях. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, участвуют в различных биологических процессах, включая эмбриогенез (Martin-Bermudo, M.D. et al., Development 2000 127 (12):2607-15; Chen, L.M., et al., J. Neurosci. 2000 20 (10):3776Zweegman, S., et al., Exp. Hemalol. 2000 28(4):401-10; Darribere, Т., et al., Biol. Cell. 2000 92(l):5-25), сохранение целостности тканей (Eckes, В., et al., J. Cell Sci. 2000 113(Pt 13): 2455-2462; Buckwalter, J.A., et al., Instr. Course Lect. 2000 49:481-9; Frenette, P.S., et al., J. Exp. Med. 2000 191(8) :1413-22; Delmas, V., et al., Dev. Biol. 216(2):491-506; Humphries, M.J., et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000 21(1) :29-32; Miosge, N., et al., Lab Invest. 79(12): 1591-9; Nagaoka T., et al. Am. J. Pathol. 2000 Jul. 157:1 237-47; Nwariaku F.E., et al. J. Trauma 1995 39(2):





285-8; Zhu X., et al. Zhonghua Zheng Xing Shao Shang Wai Ke Za Zhi 1999 15(1): 53-5), экстравазация лейкоцитов/воспаления (Lim, L.H., et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000 22(6):693-701; Johnston, В., et al., Microcirculation. 2000 7(2):109-18; Mertens, A.V., et al., Clin. Exp. Allergy. 1993 23 (10) : 868-73; Chcialowski, A., et al., Pol.

Merkuriusz. Lek. 2000 7(43): 13-7; Rojas, A.I., et al., Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999 10 (3):337-58; MarinovaMutafchieva, L., et al., Arthritis Rheum. 2000 43 (3):638-44; Vijayan, K.V., et al., J. Clin. Invest. 2000 105 (6):793-802;

Currie, A.J., et al., J. Immunol. 2000 164(7):3878-86; Rowin, M.E., et al., Inflammation. 2000 24(2): 157-73; Johnston, В., el al., J. Immunol. 2000 164(6):3337-44; Gerst, J.L., et al., J. Neurosci. Res. 2000 59(5):680-4; Kagawa, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 97 (5):2235-40; Hillan, K.J., et al., Liver. 1999 19(6):509-18; Panes, J., 1999 22 (10):

514-24; Arao, Т., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000 85(1):382-9; Souza, H.S., et al., Gut. 1999 45(6):856-63; Grunstein, M.M., et al., Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000 278(6):L1154-63; Mertens, A.V., et al., Clin. Exp. Allergy. 1993 23 (10): 868-73; Berends, C., et al., Clin. Exp. Allergy. 1993 23 (11): 926-33; Fernvik, E., et al., Inflammation. 2000 24(1):73-87; Bocchino, V., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 2000 105(1 Pt 1):65-70; Jones S.C., et al., Gut 1995 36(5):724-30; Liu C.M., et al., Ann. Allergy Asthma Immunol. 1998 81(2):176-80; McMurray R.W. Semin. Arthritis Rheum. 1996 25(4):215-33; Takahashi H., et al. Eur. J. Immunol. 1992 22(11): 2879-85; Carlos T., et al. J. Heart Lung Transplant. 1992 11(6): 1103-8; Fabrega E., et al., Transplantation 2000 69(4): 569-73; Zohrens G., et al., Hepatology 1993 18(4): 798-802; Montefort S., et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994 149(5): 1149-52), онкогенез (Orr, F.W., et al., Cancer. 2000 88 (S12):2912-2918; Zeller, W., et al., J. Hematother. Stem. Cell Res. 1999 8 (5):539-46; Okada, Т., et al., Clin. Exp. Metastasis. 1999 17(7):623-9; Mateo, V., et al., Nat. Med. 1999 5(11): 1277-84; Yamaguchi, K., et al., J.

Exp. Clin. Cancer Res. 2000 19 (1): 113-20; Maeshima, Y., et al., J. Biol. Chem. 2000 275 (28):21340-8; Van Waes, C., et al., Int. J. Oncol. 2000 16(6): 1189-95; Damiano, J.S., et al., Leuk. Lymphoma. 2000 38(1-2):71-81; Seftor, R.E., et al., Cancer Metastasis Rev. 1999 18 (3):359-75; Shaw, L.M., J. Mammary Gland Biol. Neoplasia. 1999 4(4):367-76; Weyant, M.J., et al., Clin. Cancer Res. 2000 6(3):949-56), ангиогенез (Koch A.E., et al., Nature 1995 376 (6540): 517-9;

Wagener С. & Ergun S. Exp. Cell Res. 2000 261(1): 19-24; Ergun S., et al., Mol. Cell 2000 5(2): 311-20), резорбция кости (Hartman G.D., & Duggan M.E. Expert Opin. Investig. Drugs 2000 9(6): 1281-91; Tanaka Y., et al. J. Bone Miner.

Res. 1995 10(10): 1462-9; Lark M.W., et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999 291(2): 612-7; Raynal C., et al. Endocrinology 1996 137(6):2347-54; Ilvesaro J.M., et al. Exp. Cell Res. 1998 242(1): 75-83), неврологическая дисфункция (Ossege L.M., et al., Int. Immunopharmacol. 2001 1:1085-100; Bitsch A., et al., Stroke 1998 29:2129-35; Iadecola С. & Alexander M. Curr. Opin. Neurol. 2001 14:89-94; Becker K., et al., Stroke 2001 32(1): 206-11; Relton J.K., et al. Stroke 2001 32(1): 199-205; Hamada Y., et al., J. Neurochem. 1996 66:1525-31), тромбогенез (Wang, Y.G., et al., J. Physiol.

(Lond). 2000 526(Pt 1):57-68; Matsuno, H., et al., Nippon Yakurigaku Zasshi. 2000 115 (3):143-50; Eliceiri, B.P., et al., Cancer J. Sci. Am. 2000 6 (Suppl. 3):S245-9; von Beckerath, N., et al., Blood. 2000 95(11):3297-301; Topol, E.J., et al., Am. Heart J. 2000 139 (6):927-33; Kroll, H., et al., Thromb Haemost. 2000 83(3):392-6), и инвазия бактериальных патогенов в клетку-хозяина/адгезия бактериальных патогенов к клетке-хозяину (Dersch P., et al. EMBO J. 18(5): 1199-1213).

Детальная характеризация структуры и функции нескольких семейств молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, послужила стимулом для создания различными фармацевтическими компаниями программ по разработке модуляторов, которые могут быть использованы в целях лечения заболеваний, включая воспалительные, онкологические, нервные, иммунные и сердечнососудистые заболевания. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, участвуют фактически в каждой биологической функции, начиная с эмбриогенеза и кончая апоптозом. Они играют важную роль в обеспечении структурной целостности и гомеостаза большинства тканей. Поэтому не удивительно, что дефекты в молекулах распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, приводят к развитию заболевания, и что при многих заболеваниях наблюдается модуляция функции молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен.

Члены этого семейства описаны ниже в табл. 1.

Действительно, семейство молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, включает несколько отдельных семейств. Некоторые из этих семейств представляют особый фармацевтический интерес, который обусловлен тем, что малые молекулы легко поддаются модуляции. Эти семейства включают 1. Адгезивные молекулы иммуноглобулина, представляющие собой контррецепторы для интегринов, например внеклеточные адгезивные молекулы (ICAM) и васкулярные клеточно-адгезивные молекулы (VCAM).

-2Члены этого семейства состоят из различного числа глобулярных, иммуноглобулин-подобных, внеклеточных доменов. Некоторые члены этого семейства, например РЕСАМ-1 (CD31) и NCAM, опосредуют гомотипическую адгезию. Другие члены этого семейства, например ICAM-1 и VCAM-1, опосредуют адгезию посредством взаимодействия с интегринами.

2. Рецепторы клеточной поверхности для факторов роста. Факторы роста являются внеклеточными молекулами и они взаимодействуют со специфическими высокоаффинными рецепторами, локализованными на плазматических мембранах клеток-мишеней, с продуцированием биологического эффекта. Молекулярная характеризация различных рецепторов факторов роста показала, что они принадлежат к определенным семействам, а именно к семейству тирозинкиназных рецепторов, к ассоциированным с G-белком трансмембранным рецепторам, состоящим из семи доменов, и к серин/треонинкиназным рецепторам. Тирозинкиназные рецепторы характерезуются внеклеточным доменом, трансмембранным доменом и внутриклеточным доменом, обладающим тирозинкиназной активностью. Примерами тирозинкиназных рецепторов фактора роста являются VEGFR, PDGFR, FGFR, CSF-1R и c-KIT, которые также содержат иммуноглобулиновые домены во внеклеточной части.

Dys-регуляция функции факторов роста приводит ко многим различным фенотипам патологий, включая, но не ограничиваясь ими, онкологию (Bartucci M. et al. (2001) Cancer Res. Sep. 15;61(18):6747-54, Dias S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA Sep. 11; 98 (19):10857-62, Djavan B. et al. (2001) World J. Urol. 19(4): 225-33), воспаление (Fiocchi С (2001) J. Clin. Invest. Aug. 108(4):523-6, Hodge S. et al., (2001) Respirology Sep.; 6(3): 205-211, Fenwick S.A. et al. (2001) J. Anat. Sep.; 199(Pt3):231-40), нервные заболевания (Cooper J.D. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 98(18): 10439-44, Fahnestock M. et al. (2001) Mol. Cell. Neurosci. 18(2):210-20) и метаболизм (Vickers M.H. et al. (2001) Endocrinology 142(9):3964-73).

Таблица 1. Молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен -3Таким образом, было показано, что молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, играют определенную роль в различных физиологических функциях, многие из которых могут играть определенную роль в различных патологических процессах. Изменение их активности влечет за собой изменение патологического фенотипа, а поэтому идентификация новых молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, является в высокой степени необходимой, поскольку эти молекулы могут играть определенную роль в развитии многих заболеваний, а особенно, иммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, онкологических заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, расстройств центральной нервной системы и инфекций.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что белки INSP052 и INSP055 функционируют как молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен. Примеры молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, приводятся в табл. 1.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (i) содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 или внеклеточный домен INSP052, либо состоит из указанных аминокислотных последовательностей или указанного внеклеточного домена;

(ii) представляет собой фрагмент указанной последовательности, который обладает активностью полипептида (i), или имеет общую антигенную детерминанту с полипептидом (i), или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Используемый авторами термин "активность полипептида по п.(i)" означает активность молекулы распознавания, расположенной на клеточной поверхности и содержащей иммуноглобулиновый домен.

Используемый авторами термин "активность молекулы распознавания, расположенной на клеточной поверхности и содержащей иммуноглобулиновый домен," относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность или структурные особенности, которые могут быть идентифицированы как консервативные признаки, присущие семейству молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен.

Полипептид, имеющий последовательность, указанную в SEQ ID NО:2, будет далее называться "полипептидом экзона 1 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NО:4, будет далее называться "полипептид экзона 2 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:6, будет далее называться "полипептидом экзона 3 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:8, будет далее называться "полипептидом экзона 4 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:10, будет далее называться "полипептидом экзона 5 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:12, будет далее называться "полипептидом экзона 6 INSP052". Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:14, будет далее называться "полипептидом экзона 7 INSP052". В результате объединения последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14 получают последовательность, обозначенную SEQ ID NO:16. Полипептид, имеющий последовательность, представленную SEQ ID NO:16, будет далее называться "полипептидом INSP052".

Используемый здесь термин "полипептиды экзонов INSP052" означает полипептиды, содержащие, или состоящие из них, полипептид экзона 1 INSP052, полипептид экзона 2 INSP052, полипептид экзона INSP052, полипептид экзона 4 INSP052, полипептид экзона 5 INSP052, полипептид экзона 6 INSP052, полипептид экзона 7 INSP052, полипептид INSP052 и внеклеточный домен INSP052.

В одном из вариантов осуществления изобретения полипептид этого варианта состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:16, либо он представляет собой его фрагмент или функциональный эквивалент. В другом варианте полипептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:14, или ее варианта.

В одном из вариантов своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности внеклеточного домена INSP052;

(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида (i), или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом (i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Внеклеточный домен INSP052 соответствует аминокислотам 1-240 (см. раздел "Примеры"). См.

также фиг. 7, относящуюся к внеклеточному домену INSP052.

Во втором варианте своего первого аспекта настоящее изобретение относится к полипептиду, который (i) содержит аминокислотную последовательность или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18;

(ii) представляет собой ее фрагмент, обладающий активностью полипептида по п. (i), или содержащий общую антигенную детерминанту с полипептидом по п.(i); или (iii) представляет собой функциональный эквивалент (i) или (ii).

Используемый авторами термин "активность полипептида (i)" означает активность молекулы распознавания, расположенной на клеточной поверхности и содержащей иммуноглобулиновый домен.

В соответствии с этим вариантом указанный полипептид, предпочтительно, состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:18, или ее фрагмента или ее функционального эквивалента.

Полипептид, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO:18, будет далее называться "полипептидом INSP055".

Во втором своем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид первого аспекта настоящего изобретения.

Указанная очищенная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит, или состоит из них, последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:1 (кодирующую полипептид экзона 1 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:3 (кодирующую полипептид экзона 2 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:5 (кодирующую полипептид экзона 3 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:7 (кодирующую полипептид экзона 4 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:9 (кодирующую полипептид экзона 5 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:11 (кодирующую полипептид экзона 6 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:13 (кодирующую полипептид экзона 7 INSP052);

последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:15 (кодирующую полипептид INSP052); или последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO:17 (кодирующую полипептид INSP055), либо она представляет собой избыточный эквивалент или фрагмент любой из этих последовательностей.

При объединении последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:13, продуцируется последовательность, представленная в SEQ ID NO:15.

В одном из вариантов своего второго аспекта настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который включает внеклеточный домен INSP052 или состоит из этого домена. Указанная молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно содержит, или состоит из нее, последовательность нуклеиновой кислоты, представленную на фиг. 7, или кодирующую часть последовательности нуклеиновой кислоты, представленную на фиг. 7.

В своем третьем аспекте настоящее изобретение относится к очищенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях высокой жесткости с молекулой нуклеиновой кислоты второго аспекта настоящего изобретения.

В своем четвертом аспекте настоящее изобретение относится к вектору, такому как экспрессирующий вектор, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения.

В своем пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному вектором четвертого аспекта настоящего изобретения.

В своем шестом аспекте настоящее изобретение относится к лиганду, который специфически связывается с полипептидом первого аспекта настоящего изобретения, и который предпочтительно ингибирует активность указанного полипептида.

Используемый авторами термин "активность полипептида настоящего изобретения" и аналогичные понятия означают активность, присущую молекулам распознавания на клеточной поверхности, содержащим иммуноглобулиновый домен.

В своем седьмом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, которое является эффективным в отношении изменения экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или в отношении регуляции активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения.

Соединение седьмого аспекта настоящего изобретения может либо повышать (служить агонистом), либо снижать (служить антагонистом) уровень экспрессии гена или активности полипептида.

Важно отметить, что идентификация функции полипептидов INSP052 и INSP055 дает возможность и/или диагностики заболеваний. Лиганды и соединения шестого и седьмого аспектов настоящего изобретения могут быть идентифицированы с использованием таких способов. Эти способы также являются аспектами настоящего изобретения.

В своем восьмом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для лечения или диагностики. Эти молекулы могут быть также использованы в целях получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечно-сосудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. Такими заболеваниями предпочтительно являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение, раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, коронарная болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия, болезнь легких, ХОЗЛ (хроническое обструктивное заболевание легких), астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит, болезнь печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона" (общее название группы заболеваний, характеризующихся поражением периферических мотонейронов), нервномышечное заболевание, ВИЧ-инфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния, в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен. Указанные молекулы первого, второго, третьего, четвертого, шестого или седьмого аспектов настоящего изобретения могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного средства для лечения указанных заболеваний.

В своем девятом аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики заболеваний у пациента, предусматривающему оценку уровня экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или оценку уровня активности полипептида первого аспекта настоящего изобретения в ткани указанного пациента и сравнение указанного уровня экспрессии или активности с контрольным уровнем, где уровень, который отличается от указанного контрольного уровня, является показателем заболевания. Такой способ предпочтительно осуществляют in vitro. Аналогичные способы могут быть использованы для мониторинга терапевтического лечения заболевания у пациента, где изменение уровня экспрессии или активности полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты в течение определенного периода времени по сравнению с контрольным уровнем служит показателем регрессирования заболевания.

Предпочтительный способ детекции полипептидов первого аспекта настоящего изобретения включает стадии: (а) контактирования лиганда шестого аспекта настоящего изобретения, такого как антитело, с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплекса лиганд-полипептид; и (b) детекции указанного комплекса.

Что касается девятого аспекта настоящего изобретения, то каждому читателю известно, что для детекции аномальных уровней белка существуют различные методы, такие как методы гибридизации нуклеиновой кислоты с короткими зондами, методы анализа на точковую мутацию, метод амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и методы, в которых используются антитела. Аналогичные методы могут быть использованы в течение коротких или продолжительных промежутков времени, что позволяет наблюдать за терапевтическим лечением заболевания у пациента. Настоящее изобретение также относится к набору, который может быть использован в указанных методах диагностики заболевания.

Заболеванием, диагностируемым способом в соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, предпочтительно, является заболевание, которое ассоциировано с описанными выше молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащими иммуноглобулиновый домен.

В своем десятом аспекте настоящее изобретение относится к использованию полипептидов первого аспекта настоящего изобретения в качестве молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен. Важная роль Ig-доменов в рецепторах клеточной поверхности описана Lokker N.A. et al., "Functional importance of platelet-derived growth factor (PDGF) receptor extracellular immunoglobulin-like domains. Identification of PDGF binding site and neutralizing monoclonal antibodies", Настоящее изобретение также относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспектов настоящего изобретения для экспрессии белка, обладающего активностью молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен. Настоящее изобретение также относится к способу воздействия на активность молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, где указанный способ предусматривает использование полипептида первого аспекта настоящего изобретения.

В своем одиннадцатом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид первого аспекта настоящего изобретения или молекулу нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектор четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетку-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганд шестого аспекта настоящего изобретения, или соединение седьмого аспекта настоящего изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.

В своем двенадцатом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, или к молекуле нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или к вектору четвертого аспекта настоящего изобретения, или к клетке-хозяину пятого аспекта настоящего изобретения, или к лиганду шестого аспекта настоящего изобретения, или к соединению седьмого аспекта настоящего изобретения, которые могут быть использованы для диагностики или лечения заболеваний. Эти молекулы могут быть также использованы в целях изготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, клеточно-пролиферативные расстройства, аутоиммунные/воспалительные заболевания, сердечнососудистые заболевания, неврологические и психические расстройства, нарушения развития, генетические нарушения, метаболические расстройства, инфекции и другие патологические состояния. Такими заболеваниями, предпочтительно, являются неоплазма, рак, опухоль головного мозга, глиома, опухоль кости, опухоль легких, опухоль молочной железы, опухоль предстательной железы, опухоль толстой кишки, гемангиома, миелопролиферативное расстройство, лейкоз, гематологическое заболевание, нейтропения, тромбоцитопения, нарушения ангиогенеза, кожное заболевание, старение, раны, ожоги, фиброз, сердечно-сосудистые заболевания, рестеноз, болезнь сердца, заболевание периферических сосудов, коронарная болезнь сердца, отеки, тромбоэмболия, дисменорея, эндометриоз, преэклампсия, болезнь легких, ХОЗЛ, астма, заболевание костей, почечное заболевание, гломерулонефрит, болезнь печени, болезнь Крона, гастрит, язвенный колит, язва, иммунное расстройство, аутоиммунное заболевание, артрит, ревматоидный артрит, псориаз, буллезный эпидермолиз, системная красная волчанка, анкилозирующий спондилит, болезнь Лайма, рассеянный склероз, нейродегенеративное расстройство, инсульт, повреждение головного мозга/спинного мозга, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, "болезни мотонейрона", нервномышечное заболевание, ВИЧ-инфекции, СПИД, цитомегаловирусные инфекции, грибковые инфекции, глазные болезни, дегенерация желтого пятна, глаукома, диабетическая ретинопатия, повышенное глазное давление и другие состояния, в которых участвуют молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен.

В своем тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания у пациента, предусматривающему введение указанному пациенту полипептида первого аспекта настоящего изобретения, или молекулы нуклеиновой кислоты второго или третьего аспекта настоящего изобретения, или вектора четвертого аспекта настоящего изобретения, или клетки-хозяина пятого аспекта настоящего изобретения, или лиганда шестого аспекта настоящего изобретения или соединения седьмого аспекта настоящего изобретения.

В случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения ниже, чем уровень экспрессии или активность у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединение, вводимые указанному пациенту, должны обладать агонистическими свойствами. И наоборот, в случае заболеваний, при которых у данного пациента уровень экспрессии природного гена, кодирующего полипептид первого аспекта настоящего изобретения, или активность полипептида первого аспекта настоящего изобретения выше, чем уровень экспрессии или активность у здорового пациента, полипептид, молекула нуклеиновой кислоты, лиганд или соединения, вводимые указанному пациенту, должны обладать антагонистическими свойствами.

Примерами таких антагонистов являются молекулы антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозимы и лиганды, такие как антитела.

В своем четырнадцатом аспекте настоящее изобретение относится к трансгенным животным или к животным, дефицитным по полипептиду первого аспекта настоящего изобретения, которые не являются человеком и которые были трансформированы так, что они экспрессируют более высокие или более низкие уровни такого полипептида или вообще не экспрессируют указанный полипептид. Такие трансгенные животные являются наиболее подходящими моделями для исследования заболеваний и могут быть также использованы в способах скрининга в целях идентификации соединений, которые являются эффективными для лечения или диагностики такого заболевания.

-7Таким заболеванием, предпочтительно, является заболевание, которое ассоциировано с описанными выше молекулами распознавания на клеточной поверхности, содержащими иммуноглобулиновый домен.

При этом следует отметить, что объем охраны для рассматриваемых полипептидов и нуклеиновых кислот настоящего изобретения не распространяется на нуклеиновые кислоты или полипептиды, присутствующие в их природных источниках. Точнее говоря, полипептиды и нуклеиновые кислоты, заявленные в настоящем изобретении, могут рассматриваться как "выделенные" или "очищенные". Используемые здесь термины "выделенный" и "очищенный" относятся к нуклеиновой кислоте или полипептиду, отделенным по крайней мере от одного другого компонента (например, нуклеиновой кислоты или полипептида), присутствующего вместе с нуклеиновой кислотой или с полипептидом в их природном источнике.

Так, например, "выделенным" или "очищенным" полипептидом может быть полипептид, содержащийся в экстракте ткани, а также синтетически или рекомбинантно продуцированный полипептид. В одном из вариантов нуклеиновая кислота или полипептид присутствуют (если вообще присутствуют) только в растворителе, буфере, вместе с ионами или с другим соединением, обычно присутствующем в растворе указанных соединений.

При этом следует отметить, что термины "выделенный" и "очищенный" не означают метод, с помощью которого были получены указанный полипептид или нуклеиновая кислота, или уровень чистоты этого препарата. Так, например, такие выделенные или очищенные молекулы могут быть продуцированы рекомбинантным способом, могут быть выделены непосредственно из нужной клетки или ткани, либо они могут быть продуцированы путем синтеза на основе определенных последовательностей.

Краткое описание стандартных способов и процедур, которые могут быть использованы для осуществления настоящего изобретения, приводится ниже. Следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными способами, протоколами, клеточными линиями, векторами и реагентами. Следует также отметить, что используемая здесь терминология приводится лишь в целях описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не должна рассматриваться как ограничение объема настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.

В этом описании используются стандартные сокращения, принятые для обозначения нуклеотидов и аминокислот.

Если это не оговорено особо, то для осуществления настоящего изобретения могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии и микробиологии, методы рекомбинантных ДНК и методы иммунологии, которые хорошо известны специалистам в этой области.

Более полное описание таких методов можно найти в литературе. Так, например, наиболее подходящее описание, которое может быть использовано в качестве консультации, приводится в следующих работах: Sambrook Molecular Cloning; А Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D.N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984);

Animal Cell Culture (R.I. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the Methods in Enzymology series (Academic Press, Inc.), especially volumes 154 & 155; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds. 1987, Academic Press, London); Scopes, (1987) Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer Verlag, N.Y.); and Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and С.С Blackwell eds. 1986).

Используемый здесь термин "полипептид" включает любой пептид или белок, содержащий две или более аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, то есть пептидными изостерами. Этот термин относится как к коротким цепям (пептидам и полипептидам), так и к более длинным цепям (белкам).

Полипептид настоящего изобретения может присутствовать в форме зрелого белка, либо он может присутствовать в виде пре-, про- или препробелка, который может быть активирован путем отщепления пре-, про- или препрочасти этого белка с продуцированием активного зрелого полипептида. В таких полипептидах, пре-, про- или препропоследовательность может представлять собой лидерную или секреторную последовательность, либо она может представлять собой последовательность, используемую для очистки зрелой полипептидной последовательности.

Полипептид первого аспекта настоящего изобретения может образовывать часть гибридного белка.

Так, например, часто оказывается предпочтительным, чтобы данный полипептид включал одну или несколько дополнительных аминокислотных последовательностей, которые могут содержать секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, облегчающие очистку, или последовательности, сообщающие белку более высокую стабильность, например, во время рекомбинантного продуцирования. Альтернативно или дополнительно, зрелый полипептид может быть присоединен к другому соединению, например к соединению, увеличивающему время полужизни указанного полипептида (например, к полиэтиленгликолю).

-8Полипептиды могут содержать аминокислоты, которые отличаются от 20 аминокислот, кодируемых генами, и которые являются модифицированными либо в результате природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, либо в результате применения химических методов модификации, хорошо известных специалистам. Примерами известных модификаций, которые могут быть осуществлены в полипептидах настоящего изобретения, являются гликозилирование, присоединение липида, сульфирование, гамма-карбоксилирование, например, остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и ADP-рибозилирование. Другими возможными модификациями являются ацетилирование, ацилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение молекулы гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, образование GPI-якоря, иодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, селеноилирование, присоединение аминокислот к белкам, опосредуемое т-РНК, такое как аргинилирование; и убихитинизация.

Модификации могут присутствовать в любом участке полипептида, включая пептидный остов, аминокислотные боковые цепи и амино- или карбоксиконцы. Действительно, блокирование амино- или карбоксиконца в полипептиде, либо того и другого, посредством ковалентной модификации является обычным процессом, происходящим в природных и синтетических полипептидах, и такие модификации могут присутствовать в полипептидах настоящего изобретения.

Модификации, которые присутствуют в полипептиде, в большинстве случаев, будут зависеть от способа получения данного полипептида. Для полипептидов, полученных рекомбинантным методом, природа и степень модификации, по большей части, будет определяться способностью к посттрансляционной модификации конкретной клетки-хозяина и присутствием сигналов модификации в аминокислотной последовательности рассматриваемого полипептида. Так, например, характер гликозилирования может варьироваться у клеток-хозяев различного типа.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены любым подходящим способом. Такими полипептидами являются выделенные природные полипептиды (например, выделенные из клеточной культуры), полипептиды, продуцированные рекомбинантным методом (включая гибридные белки), синтетические полипептиды или полипептиды, продуцированные с использованием комбинации этих методов.

Функционально эквивалентные полипептиды первого аспекта настоящего изобретения могут представлять собой полипептиды, гомологичные полипептидам INSP052 и INSP055. Два полипептида могут быть определены используемым здесь термином "гомологичные", если последовательность одного из этих полипептидов имеет достаточно высокую степень идентичности или сходства с последовательностью другого полипептида. Термин "идентичность" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют идентичные аминокислотные остатки. Термин "сходство" означает, что в любом конкретном положении сопоставляемых последовательностей, эти две последовательности имеют аминокислотные остатки аналогичного типа. Степень идентичности и сходства может быть легко определена (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

Поэтому гомологичными полипептидами являются природные биологические варианты (например, аллельные варианты или варианты полипептидов, образовавшиеся в результате географических изменений видов, от которых они происходят), и мутанты (такие как мутанты, содержащие аминокислотные замены, инсерции или делеции) полипептидов INSP052 и INSP055. Такими мутантами могут быть полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков заменены консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно, консервативным аминокислотным остатком), и такой замененный аминокислотный остаток может быть, а может и не быть, остатком, кодируемым генетическим кодом. Обычно такие замены происходят между Ala, Val, Leu и Ilе; между Ser и Thr;

между кислотными остатками Asp и Glu; между Asn и Gln; между основными остатками Lys и Arg; или между ароматическими остатками Phe и Туr. Особенно предпочтительными являются варианты, в которых несколько, то есть от 5 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3, от 1 до 2 аминокислот или только одна аминокислота являются замененными, делетированными или добавленными в любой комбинации. Особенно предпочтительными являются "молчащие" замены, добавления и делеции, которые не влияют на свойства и активность указанного белка. Также предпочтительными являются консервативные замены. Такими мутантами также являются полипептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков включают группу-заместитель.

Обычно считается, что два полипептида, имеющие более чем 30% идентичность, являются функционально эквивалентными. Предпочтительно, чтобы последовательности функционально эквивалентных полипептидов первого аспекта настоящего изобретения были более, чем на 80% идентичны последовательностям полипептидов INSP052 и INSP055 или их активных фрагментов. Более предпочтительными являются полипептиды, имеющие степень идентичности более чем 85, 90, 95, 98, 99% или более, соответственно.

Функционально эквивалентными полипептидами первого аспекта настоящего изобретения могут быть также полипептиды, которые были идентифицированы с применением одного или нескольких методов сопоставления первичных последовательностей путем их выравнивания. Так, например, технология информационной обработки потока данных для генома (Inpharmatica. Genome Threader™), которая составляет один из аспектов способа поиска, используемых для генерирования базы данных поиска Biopendium, может быть применена (см. Международную патентную заявку № PCT/GB01/01105, опубликованную как WO 01/69507) для идентификации полипептидов с неизвестными функциями, в отношении которых, несмотря на их низкую степень идентичности по сравнению с полипептидами INSP052 и INSP055, высказывается предположение, что они представляют собой молекулы распознавания на клеточной поверхности, содержащие иммуноглобулиновый домен, где указанный способ предусматривает использование полипептида первого аспекта настоящего изобретения, и где указанное предположение основано на их значительной структурной гомологии с последовательностями полипептидов INSP052 и INSP055. Термин "значительная структурная гомология" означает, что технология Inpharmatica Genome Threader™ позволяет предсказать, с достоверностью по крайней мере 10%, а более предпочтительно по крайней мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% и выше.

Полипептиды первого аспекта настоящего изобретения также включают фрагменты полипептидов INSP052 и INSP055, и фрагменты функциональных эквивалентов полипептидов INSP052 и INSP055, при условии, что эти фрагменты сохраняют активность молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен, или имеют общую антигенную детерминанту с полипептидами INSP052 и INSP055.

Используемый здесь термин "фрагмент" означает полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая является идентичной части, но не всей, аминокислотной последовательности полипептидов INSP052 и INSP055, либо одному из их функциональных эквивалентов. Эти фрагменты должны содержать, по крайней мере, n смежных аминокислот данной последовательности, и в зависимости от конкретной последовательности, n, предпочтительно равно 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, или более). Небольшие фрагменты могут образовывать антигенную детерминанту.

Указанные фрагменты могут присутствовать в "свободной форме" то есть не являться частью другого полипептида или не быть присоединенными к другим аминокислотам или полипептидам, либо они могут входить в состав более крупного полипептида, часть или область которого они образуют. Если фрагмент настоящего изобретения входит в состав более крупного полипептида, то наиболее предпочтительно, чтобы такой фрагмент образовывал одну непрерывную область. Так, например, некоторые предпочтительные варианты настоящего изобретения относятся к фрагменту, имеющему пре- и/или прополипептидную область, присоединенную к аминоконцу указанного фрагмента, и/или дополнительную область, присоединенную к карбоксильному концу этого фрагмента. Однако несколько фрагментов могут входить в состав одного более крупного полипептида.

Полипептиды настоящего изобретения или их иммуногенные фрагменты (содержащие, по крайней мере, одну антигенную детерминанту) могут быть использованы для генерирования лигандов, таких как поликлональные или моноклональные антитела, которые обладают иммуноспецифичностью к таким полипептидам. Указанные антитела могут быть использованы для выделения или для идентификации клонов, экспрессирующих полипептиды настоящего изобретения, или для очистки данных полипептидов аффинной хроматографией. Как совершенно очевидно для любого читателя, такие антитела, помимо других применений, могут быть также использованы в качестве диагностических или терапевтических средств.

Термин "иммуноспецифический" означает, что данные антитела имеют значительно более высокую аффинность к полипептидам настоящего изобретения, чем к другим родственным полипептидам, описанным ранее. Используемый здесь термин "антитело" означает интактные молекулы, а также их фрагменты, такие как Fab, F(ab')2 и Fv, которые способны связываться с рассматриваемой антигенной детерминантой. Таким образом, такие антитела связываются с полипептидами первого аспекта настоящего изобретения.

Под понятием "значительно более высокая аффинность" авторы подразумевают заметно повышенную аффинность к полипептиду настоящего изобретения по сравнению с аффиностью известных молекул распознавания на клеточной поверхности, содержащих иммуноглобулиновый домен.

При этом предпочтительно, чтобы аффинность по отношению к полипептиду настоящего изобретения, по крайней мере, в 1,5, 2, 5, 10, 100, 103, 104, 105 или 106 раз превышала аффинность по отношению к известным молекулам распознавания на клеточной поверхности, содержащим иммуноглобулиновый домен.

Если желательно использовать поликлональные антитела, то выбранное млекопитающее, такое как мышь, кролик, коза или лошадь, может быть иммунизовано полипептидом первого аспекта настоящего изобретения. Полипептид, используемый для иммунизации животного, может быть получен методами - 10 рекомбинантных ДНК, либо он может быть синтезирован методом химического синтеза. Если необходимо, то данный полипептид может быть конъюгирован с белком-носителем. Обычно используемыми носителями, к которым могут быть химически присоединены данные полипептиды, являются альбумин бычьей сыворотки, тироглобулин и гемоцианин лимфы улитки. Затем связанный полипептид может быть использован для иммунизации животного. Сыворотку, взятую у иммунизованного животного, собирают и обрабатывают известными методами, например, иммуноаффинной хроматографией.

Моноклональные антитела против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения могут быть легко продуцированы любым специалистом. Общая методика получения моноклональных антител с использованием гибридомной техники хорошо известна специалистам (см., например, Kohler G. & Milstein, С.

Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72(1983); Cole et al., 77-96, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985)).

Панели моноклональных антител, продуцированных против полипептидов первого аспекта настоящего изобретения, могут быть скринированы на различные свойства, то есть на изотип, эпитоп, аффинность и т.п. Моноклональные антитела являются особенно подходящими для очистки отдельных полипептидов, против которых они направлены. Альтернативно, гены, кодирующие нужные моноклональные антитела, могут быть выделены из гибридом, например, методами ПЦР, известными специалистам, а также они могут быть клонированы и экспрессированы в соответствующих векторах.

Могут быть также использованы химерные антитела, в которых нечеловеческие вариабельные области соединены или лигированы с человеческими константными областями (см. например, Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3439 (1987)).

Эти антитела могут быть модифицированы так, чтобы они были менее иммуногенными для индивидуума, например, путем их "гуманизации" (см., Jones et al., Nature, 321, 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239, 1534 (1988); Kabat et al., J. Immunol., 147, 1709 (1991); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 10029 (1989); Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 34181 (1991) and Hodgson et al., Bio/Technology, 9, 421 (1991)). Используемый здесь термин "гуманизированное антитело" означает молекулы антитела, в которых аминокислоты CDR и другие выбранные аминокислоты в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей нечеловеческого донорного антитела были заменены эквивалентными аминокислотами человеческого антитела. Таким образом, гуманизированное антитело имеет близкое сходство с человеческим антителом, но при этом оно обладает способностью к связыванию донорного антитела.

В другом альтернативном варианте изобретения, таким антителом может быть "биспецифическое" антитело, то есть антитело, имеющее два различных антигенсвязывающих домена, каждый из которых обладает специфичностью к различным эпитопам.

Для отбора генов, кодирующих антитела, обладающие способностью связываться с полипептидами настоящего изобретения, либо из набора ПЦР-амплифицированных V-генов лимфоцитов людей, скринированных на способность вырабатывать соответствующие антитела, либо из библиотеки "необученных" лимфоцитов, может быть использована техника фагового представления (McCafferty J. et al. (1990), Nature 348, 552-554; Marks J. et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783). Аффинность этих антител может быть также увеличена путем перестановки цепей (Clackson Т. et al. (1991) Nature 352, 624-628).

Антитела, генерированные вышеописанными методами, независимо от того, являются ли они поликлональными или моноклональными, обладают и другими ценными свойствами, то есть они могут быть использованы в качестве реагентов в иммуноанализах, радиоиммуноанализах (РИА) или твердофазных иммуноферментных анализах (ELISA). Для использования в этих целях антитела могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоизотоп, флуоресцентная молекула или фермент.

Предпочтительными молекулами нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения являются молекулы, которые кодируют полипептидные последовательности, представленные в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 и/или SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:18, и функционально эквивалентные полипептиды. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть использованы в способах и в целях, описанных в настоящей заявке. Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения предпочтительно содержат, по крайней мере, n смежных нуклеотидов из описанных здесь последовательностей, где n, в зависимости от конкретной последовательности предпочтительно равно 10 или более (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или более).

Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются последовательности, комплементарные последовательностям молекул нуклеиновой кислоты, описанных выше (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве зондов).

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут присутствовать в форме РНК, такой как мРНК, или в форме ДНК, включая, например, кДНК, синтетическую ДНК или геномную ДНК.

Такие молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами клонирования, химического синтеза или их комбинацией. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены, например, методом химического синтеза, таким как твердофазный фосфорамидитный химический синтез, выделением из геномных или кДНК-библиотек или выделением из микроорганизма. РНК-молекулы могут быть, в основном, генерированы путем in vitro- или in vivo-транскрипции ДНК-последовательностей.

Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. Одноцепочечной ДНК может быть кодирующая цепь, также известная как смысловая цепь, либо некодирующая цепь, также называемая антисмысловой цепью.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты" также охватывает аналоги ДНК и РНК, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы и связанные с пептидом нуклеиновые кислоты (PNA). Используемый здесь термин "PNA" означает антисмысловую молекулу или антиген, который содержит олигонуклеотид, состоящий, по крайней мере, из пяти нуклеотидов, и присоединенный к пептидному остову из аминокислотных остатков, которые, предпочтительно, заканчиваются лизином. Этот концевой лизин сообщает данной композиции растворимость. PNA могут быть ПЭГилированы для продления их времени жизни в клетке, где они предпочтительно, связываются с комплементарной одноцепочечной ДНК и РНК и приостанавливают элонгацию транскрипта (Nielsen P.E. et al. (1993) Anticancer Drug Des. 8:53-63).

Эти молекулы могут также иметь различные последовательности, которые, вследствие вырожденности генетического кода, кодируют полипептид SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14 и/или SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:18. Такими молекулами могут быть, но не ограничиваются ими, кодирующая последовательность для отдельного зрелого полипептида; кодирующая последовательность для зрелого полипептида и дополнительные кодирующие последовательности, такие как последовательности, кодирующие лидерную или секреторную последовательность, такую как про-, пре- или препрополипептидную последовательность; кодирующая последовательность зрелого полипептида с вышеупомянутыми дополнительными кодирующими последовательностями, или без них, вместе с дополнительными некодирующими последовательностями, включая некодирующие 5'- и 3'-последовательности, такие как транскрибируемые нетранслируемые последовательности, которые играют определенную роль в транскрипции (включая сигналы терминации), в связывании с рибосомой и в обеспечении стабильности мРНК. Молекулами нуклеиновой кислоты могут быть также вспомогательные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, такие как аминокислоты, обладающие дополнительными функциональными свойствами.

Молекулы нуклеиновой кислоты второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут также кодировать фрагменты или функциональные эквиваленты полипептидов и фрагментов первого аспекта настоящего изобретения. Такая молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой природный вариант, такой как природный аллельный вариант, либо указанной молекулой может быть вариант, не встречающийся в природе. Указанные неприродные варианты молекулы нуклеиновой кислоты могут быть получены методами мутагенеза, включая методы, применяемые к молекулам нуклеиновой кислоты, к клеткам или к целым организмам.

Среди рассматриваемых вариантов имеются варианты, которые отличаются от вышеупомянутых молекул нуклеиновой кислоты тем, что они имеют нуклеотидные замены, делеции или инсерции. Такие замены, делеции или инсерции могут быть сделаны в одном или нескольких нуклеотидах. Указанные варианты могут быть модифицированы в кодирующей или в некодирующей области или в той и другой области. Альтерации в кодирующих областях могут приводить к консервативным или неконсервативным аминокислотным заменам, делециям или инсерциям.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также сконструированы методами, в основном, известными специалистам, включая, в зависимости от различных целей, модификацию клонирования, процессинга и/или экспрессии генного продукта (полипептида). Перестановка ДНК путем рандомизированной фрагментации и повторной сборки генных фрагментов и синтетических олигонуклеотидов с помощью ПЦР представляет собой технологию, которая может быть использована для конструирования нуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез может быть использован для введения новых рестрикционных сайтов, изменения характера гликозилирования, изменения предпочтительности кодонов, продуцирования вариантов сплайсинга, введения мутаций и т.п.

Молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полипептид первого аспекта настоящего изобретения, могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью так, чтобы полученная комбинированная молекула нуклеиновой кислоты кодировала гибридный белок. Такие комбинированные молекулы нуклеиновой кислоты входят во второй или третий аспект настоящего изобретения. Так, например, для скрининга пептидных библиотек на ингибиторы активности указанного полипептида с использованием такой комбинированной молекулы нуклеиновой кислоты может оказаться полезным экспрессировать гибридный белок, который будет распознаваться коммерчески доступным антителом. Гибридный белок может быть также сконструирован так, чтобы он содержал сайт расщепления, расположенный между последовательностью полипептида настоящего изобретения и последовательностью гетерологичного белка, и чтобы такой полипептид мог быть отщеплен и выделен из указанного гетерологичного белка.

Молекулами нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть также антисмысловые молекулы, которые являются частично комплементарными молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим полипептиды настоящего изобретения, а поэтому они гибридизуются с кодирующими молекулами нуклеиновой кислоты (гибридизация). В соответствии с методами, хорошо известными специалистам, указанные антисмысловые молекулы, такие как олигонуклеотиды, могут быть сконструированы так, чтобы специфически связывались с этой нуклеиновой кислотой и предупреждали ее транскрипцию (см., например, Cohen J.S., Trends in Pharm. Sci., 10, 435 (1989), Okano, J. Neurochem. 56, 560 (1991); O'Connor, J.

Neurochem 56, 560 (1991); Lee et al., Nucleic Acids Res. 6, 3073 (1979); Cooney et al., Science 241, (1988); Dervan et al., Science 251, 1360 (1991)).

Используемый здесь термин "гибридизация" означает присоединение двух молекул нуклеиновой кислоты друг к другу посредством водородных связей. Обычно одна молекула может быть фиксирована на твердом носителе, а другая молекула может находиться в растворе в свободном состоянии. Затем эти две молекулы могут быть подвергнуты контакту друг с другом в условиях, благоприятствующих образованию водородной связи. Факторами, влияющими на образование таких связей, являются: тип и объем растворителя; температура реакции; время гибридизации; перемешивание; присутствие агентов, блокирующих неспецифическое связывание молекулы в жидкой фазе с твердым носителем (реагент Денхардта или BLOTTO); концентрация молекул; использование соединений, повышающих скорость ассоциации молекул (сульфата декстрана или полиэтиленгликоля); и жесткость условий промывки после гибридизации (Sambrook et al., [см. выше]).

Ингибирование гибридизации полностью комплементарной молекулы с молекулой-мишенью может быть оценено с использованием гибридизационного анализа, известного специалистам (Sambrook et al. [см.выше]). По существу гомологичная молекула будет затем конкурировать с полностью гомологичной молекулой за связывание с молекулой-мишенью и ингибировать это связывание в различных условиях жесткости, как описано у Wahl G.M. и S.L. Berger (1987; Methods Enzymol. 152:399-407) и Kimmel A.R. (1987; Methods Enzymol. 152:507-511).

Термин "жесткость" означает условия реакции гибридизации, которые способствуют ассоциации молекул с большим сходством, но не ассоциации отличающихся молекул. Условия гибридизации высокой жесткости определяют как условия инкубирования в течение ночи при 42°С в растворе, содержащем 50% формамид, 5XSSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 50 мМ фосфат натрия (рН 7,6), 5х раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующей промывкой фильтров в 0,1X SSC приблизительно при 65°С. Условия низкой жесткости предусматривают реакцию гибридизации, осуществляемую при 35°С (Sambrook et al. [см.выше]).

Предпочтительными условиями гибридизации являются условия гибридизации высокой жесткости.

В предпочтительных вариантах этого аспекта настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые по всей своей длине по крайней мере на 70% идентичны молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды INSP052 или INSP055 (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 и/или SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:17), и к молекулам нуклеиновой кислоты, которые, по существ, комплементарны указанным молекулам нуклеиновой кислоты. В соответствии с этим аспектом настоящего изобретения предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала область, которая по всей своей длине по крайней мере на 80% идентична кодирующей SEQ ID NO:2 последовательности, представленной в SEQ ID NO:1; кодирующей SEQ ID NO:4 последовательности, представленной в SEQ ID NO:3; кодирующей SEQ ID NO: последовательности, представленной в SEQ ID NO:5; кодирующей SEQ ID NO:8 последовательности, представленной в SEQ ID NO:7; кодирующей SEQ ID NO:10 последовательности, представленной в SEQ ID NO:9; кодирующей SEQ ID NO:12 последовательности, представленной в SEQ ID NO:11; кодирующей SEQ ID NO:14 последовательности, представленной в SEQ ID NO:13; кодирующей SEQ ID NO: последовательности, представленной в SEQ ID NO:15; кодирующей SEQ ID NO:18 последовательности, представленной в SEQ ID NO:17; либо, чтобы эта молекула представляла собой комплементарную им молекулу нуклеиновой кислоты. При этом особенно предпочтительно, чтобы молекулы нуклеиновой кислоты по всей своей длине были по крайней мере на 90%, более предпочтительно по крайней мере на 95%, а особенно предпочтительно по крайней мере на 98 или 99% были идентичны указанным последовательностям. Предпочтительными вариантами этого аспекта являются молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды, которые обладают по существу такой же биологической функцией или активностью, как и полипептиды INSP052 и INSP055.

Настоящее изобретение также относится к способу детекции молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, включающему стадии: (а) контактирования нуклеотидного зонда настоящего изобретения с биологическим образцом в условиях гибридизации, способствующих образованию дуплексов;

и (b) детекции любого из таких образованных дуплексов.

Как будет дополнительно обсуждаться ниже в связи с анализами, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, описанная выше, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для РНК, кДНК или геномной ДНК в целях выделения полноразмерных кДНК и геномных клонов, кодирующих полипептиды INSP052 и INSP055, и в целях выделения кДНК и геномных клонов гомологичных и ортологичных генов, имеющих высокую степень сходства с генами, кодирующими этот полипептид.

В этой связи, наряду с другими известными методами, могут быть использованы описанные и обсуждаемые методы, которые приводятся ниже в качестве иллюстрации. Методы секвенирования и анализа ДНК хорошо известны и, в основном, доступны специалистам, и могут быть реально использованы для осуществления многих вариантов настоящего изобретения, обсуждаемых в настоящей заявке. В указанных методах могут использоваться ферменты, такие как фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназа (US Biochemical Corp., Cleveland, ОН), полимераза Taq (Perkin Elmer), термостабильная полимераза Т7 (Amersham, Chicago, IL), или комбинация полимераз и корректирующих экзонуклеаз, таких как экзонуклеазы, присутствующие в ELONGASE Amplification System, и поставляемые Gibco/BRL (Gaithersburg, MD). Способ секвенирования может быть, предпочтительно, автоматизирован с использованием устройств, таких как аппарат Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV), термоячейка Peltier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown, MA), катализатор ABI и ДНК-секвенаторы 373 и 377 DNA Sequencers (Perkin Elmer).

Одним из методов выделения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с функцией, эквивалентной функции полипептидов INSP052 и INSP055, является зондирование библиотеки геномных ДНК или кДНК природным или искусственно сконструированным зондом с использованием стандартных процедур, известных специалистам (см., например, "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (eds). Greene Publisching Associates and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992). Особенно подходящими являются зонды, содержащие 15, предпочтительно по крайней мере 30, а более предпочтительно по крайней мере 50 непрерывно следующих друг за другом оснований, которые соответствуют или комплементарны последовательностям нуклеиновой кислоты, происходящей от соответствующего кодирующего гена (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:17). Для облегчения идентификации такие зонды могут быть помечены аналитически детектируемым реагентом. Подходящими реагентами являются, но не ограничиваются ими, радиоизотопы, флуоресцентные красители и ферменты, способные катализировать образование детектируемого продукта. С использованием этих зондов каждый специалист может самостоятельно выделить комплементарные копии полинуклеотидов геномной ДНК, кДНК или РНК, кодирующих представляющие интерес белки, происходящие от различных источников, например человека, млекопитающего или других животных, и скринировать эти источники на присутствие родственных последовательностей, например, дополнительных членов семейства, типа и/или подтипа.

Во многих случаях, выделенные кДНК-последовательности будут неполными, то есть в этих последовательностях область, кодирующая полипептид, будет сильно обрезана, обычно у 5'-конца. Для получения полноразмерных кДНК или для удлинения коротких кДНК существует несколько методов. Такие последовательности можно удлинить с использованием неполной нуклеотидной последовательности и с применением различных известных методов детекции расположенных выше последовательностей, таких как промоторы и регуляторные элементы. Так, например, одним из методов, который может быть использован в данном случае, является метод быстрой амплификации кДНК-концов (RACE; см., например, Frohman et al., PNAS USA 85, 8998-9002, 1998). Недавно разработанные модификации этой технологии, например, проиллюстрированные Marathon T.M. (Clontech Laboratories Inc.), значительно упростили поиск более длинных кДНК. Для поиска неизвестной последовательности нуклеиновой кислоты, которая является смежной с известным локусом, может быть использован слегка модифицированный метод, который называется "сайт-рестрикционной" ПЦР и предусматривает использование универсальных праймеров (Sarkar G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322). Для амплификации или для удлинения последовательностей с использованием различных праймеров, полученных на основе известной области, может быть также использована обратная ПЦР (Triglia Т. et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186). Другим методом, который может быть использован в данном случае, является ПЦР "с захватом", которая представляет собой ПЦР-амплификацию ДНК-фрагментов, смежных с известной последовательностью в искусственной хромосомной ДНК человека и дрожжей (Lagerstrom M. et al., (1991) PCR Methods Applic. 1, 111Другим методом, который может быть использован для поиска неизвестных последовательностей, является метод Parker J.D. et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060). Кроме того, можно использовать ПЦР, "гнездовые" праймеры и библиотеки PromoterFinderTM для "прогулки" по геномной ДНК (Clontech, Palo Alto, CA). Этот способ позволяет избежать необходимости скрининга библиотек и может быть использован для обнаружения участков стыка интрон/экзон.

При скрининге на полноразмерные кДНК предпочтительно использовать библиотеки, которые были отобраны по размерам и содержат более крупные кДНК. Предпочтительными также являются библиотеки рандомизированных праймеров, которые могут включать дополнительные последовательности, содержащие 5'-области генов. Использование библиотеки рандомизированных праймеров может оказаться особенно предпочтительным в том случае, если библиотека oligo-d(T) не дает полноразмерной кДНК. Геномные библиотеки могут быть использованы для удлинения последовательности с получением 5'-нетранскрибируемых регуляторных областей.

В одном из вариантов осуществления изобретения молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть использованы для определения локализации в хромосоме. В этом методе молекула нуклеиновой кислоты может быть нацелена на конкретный участок, либо она может быть гибридизована с конкретным участком на отдельной хромосоме человека. В соответствии с настоящим изобретением картирование релевантных последовательностей в хромосомах является важным звеном в подтверждении корреляции этих последовательностей с геноассоциированным заболеванием. После картирования последовательности с определением ее точной локализации, физическое положение последовательности на хромосоме может быть сопоставлено с данными генетической карты. Эти данные можно найти, например, в работе V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (имеющейся в настоящее время в библиотеке Уэлльского медицинского университета Джона Хопкинса) (John Hopkins University Welch Medical Library). Взаимосвязь между генами, которые могут быть картированы на одной и той же области хромосомы, и заболеваниями, ассоциированными с ними, затем идентифицируют с помощью анализа на сцепление генов (совместное наследование физически смежных генов). Это позволяет исследователям получить ценную информацию, которая может быть использована для поиска генов, ассоциированных с данным заболеванием, с применением метода позиционного клонирования или других методов обнаружения генов. После предварительного определения локализации генов, ассоциированных с данным заболеванием или синдромом, путем анализа на сцепление генов с конкретной областью генома, любое картирование последовательностей на данном участке может дать информацию об ассоциированных или регуляторных генах, которая может быть использована для последующих исследований. Молекула нуклеиновой кислоты может быть также использована для детекции различий в хромосомной локализации, обусловленных транслокацией, инверсией и т.п., у нормальных индивидуумов, индивидуумов-носителей и у индивидуумов с заболеванием.

Молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения также являются ценным материалом для определения локализации в тканях. Такие методы позволяют определять характер экспрессии полипептида в тканях путем детекции мРНК, которая их кодирует. Такими методами являются методы гибридизации in situ и методы амплификации нуклеотидов, такие как ПЦР. Результаты этих исследований позволили получить определенные сведения относительно нормальных функций данного полипептида в организме. Кроме того, в этих исследованиях сравнение нормального характера экспрессии мРНК с экспрессией мРНК, кодируемой мутантным геном, позволяет получить важную информацию о роли мутантных полипептидов в данном заболевании. Такая аномальная экспрессия может иметь кратковременную, пространственную или количественную природу.

Для ингибирования эндогенной экспрессии гена, кодирующего полипептид настоящего изобретения, могут быть также использованы методы "отключения" гена. Одним из методов, который может быть использован для последовательность-специфического посттрансляционного "отключения" гена, является интерференция РНК (RNAi) (Elbashir S.M. et al., Nature 2001, 411, 494-498). Короткие дцРНКолигонуклеотиды синтезируют in vitro и вводят в клетку. Последовательность-специфическое связывание этих дцРНК-олигонуклеотидов запускает процесс деградации мРНК-мишени, что приводит к снижению уровня или к отмене экспрессии целевого белка.

Эффективность методов "отключения" гена, описанных выше, может быть оценена путем определения уровня экспрессии полипептидов (например, с помощью Вестерн-блоттинга), а на РНК-уровне она может быть оценена с помощью методики, основанной на TaqMan.

Векторы настоящего изобретения содержат молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения и могут представлять собой клонирующие или экспрессирующие векторы. Клетки-хозяева настоящего изобретения, которые могут быть трансформированы, трансфицированы или трансдуцированы векторами настоящего изобретения, могут представлять собой прокариотические или эукариотические клетки-хозяева.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены в рекомбинантной форме посредством экспрессии кодирующих эти полипептиды молекул нуклеиновой кислоты в векторах, содержащихся в клетке-хозяине. Такие методы экспрессии хорошо известны специалистам, и многие из них подробно описаны у Sambrook et al. (см. выше) и Fernandez & Hoeffler (1998, eds. "Gene expression systems. Using nature for the art of expression". Academic Press, San Diego, London, Boston, New York, Sydney, Tokyo, Toronto).

Для продуцирования полипептида в нужном хозяине могут быть использованы, в основном, любые системы или любые векторы, подходящие для поддержания, амплификации или экспрессии молекул нуклеиновой кислоты. Подходящая нуклеотидная последовательность может быть встроена в экспрессионную систему любым из хорошо известных и рутинных методов, таких как методы, описанные у Sambrook et al. (см.выше). В общих чертах, кодирующий ген может быть помещен под контроль регуляторного элемента, такого как промотор, сайт связывания рибосомы (для экспрессии в бактериях), и необязательно, оператор, так, чтобы ДНК-последовательность, кодирующая нужный полипептид, транскрибировалась в РНК в трансформированной клетке-хозяине.

Примерами подходящих систем экспрессии являются, например, хромосомная, эписомная и вирусная системы, включая, например, векторы, происходящие от бактериальных плазмид, бактериофага, транспозонов, дрожжевых эписом, инсерционных элементов, дрожжевых хромосомных элементов, вирусов, таких как бакуловирус, паповавирусы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы оспы домашней птицы, псевдорабивирусы и ретровирусы, или их комбинации, а также векторы, происходящие от плазмидных и бактериофаговых генетических элементов, включая космиды и фагмиды. Для доставки более крупных фрагментов ДНК, чем те, которые могут содержаться и экспрессироваться в плазмиде, могут быть также использованы искусственные человеческие хромосомы (НАС).

- 15 Особенно подходящими экспрессионными системами являются микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантным бактериофагом, плазмидными или космидными ДНКэкспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные векторами для экспрессии в дрожжах;

клеточные системы насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирусом); клеточные системы растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты, CaMV; вирусом мозаики табака, TMV) или векторами для экспрессии в бактериях (например, плазмидами Ti или pBR322); или клеточные системы животных. Для продуцирования полипептидов настоящего изобретения могут быть также использованы бесклеточные системы трансляции.

Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептид настоящего изобретения, в клетки-хозяева может быть осуществлено методами, описанными во многих известных лабораторных руководствах, таких как руководство Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и Sambrook et al. [см. выше]. Особенно подходящими методами являются трансфекция с использованием фосфата кальция; трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном; трасвекция; микроинъекция; трансфекция, опосредованная катионным липидом; электропорация; трансдукция; загрузка путем соскоба; введение методом биобаллистики или инфицирование (см., Sambrook et al., 1989, [см. выше], Ausubel et al., [см. выше], Spector, Goldman & Leinwald, 1998). В эукариотических клетках экспрессионные системы, в зависимости от целей их использования, могут быть либо временными (например, эписомными), либо перманентными (хромосомная интергация).

Кодирующая молекула нуклеиновой кислоты может включать, а может и не включать последовательность, кодирующую регуляторную последовательность, такую как сигнальный пептид или лидерная последовательность, если это необходимо, например, для секреции транслируемого полипептида в просвет эндоплазматического ретикулума, в периплазматическое пространство или во внеклеточное пространство. Эти сигналы могут быть эндогенными по отношению к полипептиду, либо они могут быть гетерологичными. Лидерные последовательности могут быть удалены бактериальным хозяином при посттрансляционном процессинге.

Помимо регуляторных последовательностей может оказаться желательным введение регуляторных последовательностей, которые обеспечивают регуляцию экспрессии полипептида в зависимости от роста клетки-хозяина. Примерами регуляторных последовательностей являются последовательности, которые обеспечивают увеличение или снижение уровня экспрессии гена в ответ на химическую или физическую стимуляцию, включая присутствие регуляторного соединения, или в ответ на различные температурные или метаболические условия. Регуляторными последовательностями являются нетранслируемые области вектора, такие как энхансеры, промоторы и 5'- и 3'-нетранслируемые области. Эти последовательности взаимодействуют с клеточными белками хозяина, в результате чего осуществляется транскрипция и трансляция. Такие регуляторные последовательности могут варьироваться по своей длине и специфичности. В зависимости от выбранной векторной системы и выбранного хозяина могут быть использованы любые подходящие транскрипционные и трансляционные элементы, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Так, например, для клонирования в бактериальных системах могут быть использованы индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фагмиды BlueScript (Stratagene, LaJolla, CA) или плазмиды pSportlTM (Gibco BRL) и т.п. В клетках насекомых может использоваться бакуловирусный промотор полиэдрина. Промоторы или энхансеры, происходящие от геномов растительных клеток (например, гена белка теплового шока, RUBISCO и гена запасных белков) или от вирусов растений (например, вирусных промоторов или лидерных последовательностей), могут быть клонированы в указанный вектор. В клеточных системах млекопитающих предпочтительными являются промоторы, происходящие от генов млекопитающих или от вирусов млекопитающих. Если необходимо генерировать клеточную линию, содержащую множество копий данной последовательности, то могут быть использованы векторы на основе SV40 или EBV с соответствующим селективным маркером.

Экспрессирующий вектор конструируют так, чтобы конкретная кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты присутствовала в векторе вместе с соответствующими регуляторными последовательностями, и чтобы положение и ориентация кодирующей последовательности по отношению к регуляторным последовательностям позволяли такой кодирующей последовательности транскрибироваться под "контролем" регуляторных последовательностей, то есть так, чтобы РНК-полимераза, которая связывается с ДНК-молекулой в положении регуляторных последовательностей, осуществляла транскрипцию кодирующей последовательности. В некоторых случаях может оказаться необходимым модифицировать указанную последовательность так, чтобы она могла присоединяться к регуляторным последовательностям в соответствующей ориентации, то есть с сохранением рамки считывания.

Указанные регуляторные последовательности и другие регуляторные последовательности могут быть лигированы с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты перед встраиванием в вектор. Альтернативно, такая кодирующая последовательность может быть клонирована непосредственно в экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные последовательности и соответствующий рестрикционный сайт.

Для длительного высокоэффективного продуцирования рекомбинантного полипептида, предпочтительной является стабильная экспрессия. Так, например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют нужный полипептид, могут быть трансформированы с использованием экспрессирующих векторов, которые могут содержать вирусные сайты инициации репликации и/или эндогенные экспрессионные элементы и выбранный маркерный ген, присутствующий на том же самом или на отдельном векторе. После введения этого вектора, клетки можно оставить на 1-2 дня для роста в обогащенной среде, которую затем заменяют селективной средой. Селективный маркер необходим для сообщения резистентности, используемой в целях отбора, и его присутствие позволяет культивировать и выделять клетки, успешно экспрессирующие введенные последовательности. Резистентные клоны стабильно трансформированных клеток могут быть подвергнуты пролиферации методами культивирования ткани, подходящими для клеток такого типа.

Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны специалистам, и такими клеточными линиями являются многие иммортализованные клеточные линии, имеющиеся в Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS), клетки С127, клетки 3Т3, клетки ВНК, клетки НЕК 293, клетки меланомы Боуэса, клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и ряд других клеточных линий.

В бакуловирусной системе, материалы для получения экспрессионных систем бакуловирус/клетка насекомого являются коммерчески доступными и поставляются в наборах, inter alia, от Invitrogen, San Diego CA (набор "МахВас"). В общих чертах, эти методы известны специалистам и подробно описаны у Summers & Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin № 1555 (1987). Клетками-хозяевами, особенно подходящими для использования в данной системе, являются клетки насекомых, такие как клетки Drosophila S2 и клетки Spodoptera Sf9.

Специалистам известно множество систем экспрессии генов в клеточных культурах растений и в целых растениях. Примерами подходящих систем экспрессии генов в клетках растений являются системы, описанные в патентах США 5693506, 5659122 и 5608143. Другие примеры экспрессии генов в клеточных культурах растений описаны Zenk, Phytochemistry 30, 3861-3863 (1991).

В частности, можно использовать любые растения, из которых могут быть выделены и культивированы протопласты с последующим генерированием из них целых регенерированных растений, которые содержат перенесенный ген. В частности, из культивируемых клеток или тканей могут быть регенерированы все растения, включая, но не ограничиваясь ими, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых, а также овощных растений.

Примерами особенно предпочтительных бактериальных клеток-хозяев являются клетки стрептококков, стафилококков, E.coli, Streptomyces и Bacillus subtilis.

Примерами особенно подходящих клеток-хозяев для экспрессии в грибах являются дрожжевые клетки (например, S. cerevisiae) и клетки Aspergillus.

Любые системы отбора, которые могут быть использованы для выделения трансформированных клеточных линий, известны специалистам. Примерами являются гены тимидинкиназы (Wigler M. et al.

(1977) Cell 11:223-32) и аденин-фосфорибозилтрансферазы вируса простого герпеса (Lowy I. et al. (1980) Cell 22:817-23), которые могут быть использованы в tk- или aprt±-клетках, соответственно.

Кроме того, в качестве основы для отбора могут быть использованы гены резистентности к антиметаболиту, антибиотику или к гербициду, например, ген дигидрофолат-редуктазы (DHFR), который сообщает резистентность к метотрексату (Wigler M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); ген npt, который сообщает резистентность к аминогликозидам, неомицину и к G-418 (Colbere-Garapin F. et al.

(1981) J. Mol. Biol. 150:1-14), и гены als или pat, которые сообщают резистентность к хлорсульфурон- и фосфинотрицинацетилтрансферазе, соответственно. Были описаны и другие селективные гены, примеры которых хорошо известны специалистам.



Pages:   || 2 |
Похожие работы:

«ПРЕДИСЛОВИЕ1 Интернет-версия пособия Информатика состоит из двух разделов: Теория (с задачами и решениями); • Практикум по алгоритмизации и программированию. • Теоретический раздел представляет собой попытку создания на доступном уровне цельной картины курса информатики в фундаментальном его аспекте. В нем рассматриваются такие содержательные линии курса информатики, как информация и информационные процессы, представление информации, компьютер, алгоритмы и исполнители, моделирование и...»

«Современная гуманитарная академия КАЧЕСТВО ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ Под редакцией М.П. Карпенко Москва 2012 УДК 378.01 ББК 74.58 К 30 Качество высшего образования / Под ред. М.П. Карпенко. М.: Изд-во СГУ, 2012. 291 с. ISBN 978-5-8323-0824-1 В данной монографии приведено исследование проблем качества высшего образования с учетом современных кардинальных изменений запросов социума и возможностей, предоставляемых развитием высоких технологий. Это исследование опирается на когнитивнотехнологические...»

«Международный консорциум Электронный университет Московский государственный университет экономики, статистики и информатики Евразийский открытый институт Н.М. Чепурнова Международное право Учебно-методический комплекс Москва, 2008 1 УДК 341 ББК 67.412 Ч 446 Чепурнова Н.М. Международное право: Учебно-методический комплекс. – М.: Изд. центр ЕАОИ, 2008. – 295 с. Чепурнова Н.М., 2008 Евразийский открытый институт, 2008 2 Оглавление Цели и задачи дисциплины Тема 1. Понятие, юридическая природа,...»

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА ФАКУЛЬТЕТ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОЙ МАТЕМАТИКИ И КИБЕРНЕТИКИ А.М. ДЕНИСОВ, А.В. РАЗГУЛИН ОБЫКНОВЕННЫЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ УРАВНЕНИЯ Часть 2 МОСКВА 2009 г. Пособие отражает содержание второй части лекционного курса Обыкновенные дифференциальные уравнения, читаемого студентам факультета вычислительной математики и кибернетики МГУ им. М.В. Ломоносова в соответствии с программой по специальности Прикладная математика и информатика. c Факультет...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет в г. Анжеро-Судженске 1 марта 2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по дисциплине Отечественная история (ГСЭ.Ф.3) для специальности 080116.65 Математические методы в экономике факультет информатики, экономики и математики курс: 1 экзамен: 1 семестр семестр: 1 лекции: 36 часов практические занятия: 18...»

«УДК 37.01:004.9 Рецензенты: кандидат технических наук, доцент кафедры информационных систем факультета компьютерных наук, начальник Управления информатизации и компьютерных технологий Воронежского госуниверситета, А.П. Толстобров кандидат технических наук, доцент, чл. корр. EANH, проректор ЮРГУЭС по заочному, дистанционному и дополнительному профессиональному образованию, А.Э. Попов Андреев А.В., Андреева С.В, Доценко И.Б. Практика электронного обучения с использованием Moodle. – Таганрог:...»

«1 ЭНЦИКЛОПЕДИЯ УЧИТЕЛЯ ИНФОРМАТИКИ II. Теоретические основы информатики Список статей 1. Измерение информации — алфавитный подход 2. Измерение информации — содержательный подход 3. Информационные процессы 4. Информация 5. Кибернетика 6. Кодирование информации 7. Обработка информации 8. Передача информации 9. Представление чисел 10. Системы счисления 11. Хранение информации 12. Языки Основными объектами изучения науки информатики являются информация и информационные процессы. Информатика как...»

«SINCE 1989 (к XXV-летию ЗАО АНАЛИТИКА) Петров Сергей Павлович, к.т.н., ведущий эксперт ЗАО АНАЛИТИКА А началось с того, что исполком Бабушкинского районного совета народных депутатов города Москвы 20 февраля 1989 года зарегистрировал устав научно-производственного кооператива (НПК) Аналитика, созданного группой молодых учёных с целью внедрения в отечественную лабораторную медицину передовых аналитических технологий. Сотрудничество с ГКБ №40 г. Москвы позволило Аналитике поместиться на 9...»

«Международный консорциум Электронный университет Московский государственный университет экономики, статистики и информатики Евразийский открытый институт Е.А. Девяткин ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА КОНКУРЕНЦИИ Учебно-методический комплекс Москва, 2008 1 УДК 339.137 ББК 67.412.2 Д 259 Девяткин Е.А. ТЕОРИЯ И ПРАКТИКА КОНКУРЕНЦИИ: Учебно-методический комплекс. – М.: ЕАОИ, 2008. – 232 с. ISBN 978-5-374-00123-5 © Девяткин Е.А., 2008 © Евразийский открытый институт, 2008 2 Цель и задачи дисциплины, ее место в...»

«Серия ЕстЕствЕнныЕ науки № 2 (8) Издается с 2008 года Выходит 2 раза в год Москва 2011 Scientific Journal natural ScienceS № 2 (8) Published since 2008 Appears Twice a Year Moscow 2011 редакционный совет: Рябов В.В. ректор ГОУ ВПО МГПУ, доктор исторических наук, председатель профессор, член-корреспондент РАО Геворкян Е.Н. проректор по научной работе ГОУ ВПО МГПУ, заместитель председателя доктор экономических наук, профессор, член-корреспондент РАО Атанасян С.Л. проректор по учебной работе ГОУ...»

«Направление подготовки: 010400.68 Прикладная математика и информатика (очная) Объектами профессиональной деятельности магистра прикладной математики и информатики являются научно - исследовательские центры, государственные органы управления, образовательные учреждения и организации различных форм собственности, использующие методы прикладной математики и компьютерные технологии в своей работе. Магистр прикладной математики и информатики подготовлен к деятельности, требующей углубленной...»

«Российская академия наук Cибирское отделение Институт систем информатики имени А.П.Ершова СО РАН Отчет о деятельности в 2007 году Новосибирск 2008 Институт систем информатики имени А.П.Ершова СО РАН 630090, г. Новосибирск, пр. Лаврентьева, 6 e-mail: iis@iis.nsk.su http: www.iis.nsk.su тел: (383) 330-86-52 факс: (383) 332-34-94 Директор д.ф.-м.н. Марчук Александр Гурьевич e-mail: mag@iis.nsk.su http: www.iis.nsk.su тел: (383) 330-86- Заместитель директора по науке д.ф.-м.н. Яхно Татьяна...»

«1 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ.5 2. ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ.15 3. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ И МЕЖДУНАРОДНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ 4. ВНЕУЧЕБНАЯ И ВОСПИТАТЕЛЬНАЯ РАБОТЫ 5. МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ ПРИЛОЖЕНИЯ 2 ВВЕДЕНИЕ Самообследование деятельности Хакасского филиала федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ЭКОНОМИКИ,...»

«Информатика. 11 класс. Вариант ИН10601 2 Инструкция по выполнению работы Тренировочная работа На выполнение работы по информатике и ИКТ отводится 235 минут. Работа состоит из трёх частей, содержащих 32 задания. Рекомендуем не в формате ЕГЭ более полутора часов (90 минут) отвести на выполнение заданий частей 1и 2, а остальное время – на часть 3. Часть 1 содержит 13 заданий (А1–А13). К каждому заданию даётся четыре варианта ответа, из которых только один правильный по ИНФОРМАТИКЕ Часть 2 состоит...»

«ТКП 206 - 2009 (02140) ТЕХНИЧЕСКИЙ КОДЕКС УСТАНОВИВШЕЙСЯ ПРАКТИКИ ПРАВИЛА ТЕХНИЧЕСКОЙ ЭКСПЛУАТАЦИИ ЛИНЕЙНО-КАБЕЛЬНЫХ СООРУЖЕНИЙ АБОНЕНТСКИХ ЛИНИЙ МЕСТНЫХ ТЕЛЕФОННЫХ СЕТЕЙ ПРАВIЛЫ ТЭХНIЧНАЙ ЭКСПЛУАТАЦЫI ЛIНЕЙНА-КАБЕЛЬНЫХ ЗБУДАВАННЯЎ АБАНЕНЦКIХ ЛIНIЙ МЯСЦОВЫХ ТЭЛЕФОННЫХ СЕТАК Издание официальное Минсвязи Минск ТКП 206 – 2009 _ УДК 691.395.74:006.354 МКС 33.040.35 КП 02 Ключевые слова: линейно-кабельные сооружения связи, техническая эксплуатация, абонентские линии, местные телефонные сети...»

«О представлении к защите диссертационных работ в совет Д 212.337.01 при Пензенской государственной технологической академии по защите докторских и кандидатских диссертаций по специальностям 05.13.17 – Теоретические основы информатики (технические наук и), 05.13.18 – Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ (технические науки) Составлено на основе документов: Положение о порядке присуждения ученых степеней, утвержденное Постановлением Правительства РФ от 30 января 2002...»

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОЙ МАТЕМАТИКИ И МАТЕМАТИЧЕСКОЙ ГЕОФИЗИКИ ИЗ ИСТОРИИ КИБЕРНЕТИКИ Ответственный редактор академик А.С. Алексеев Редактор-составитель д.т.н. Я.И. Фет НОВОСИБИРСК 2006 УДК 681.3 ББК 22.18 И32 Из истории кибернетики / Редактор-составитель Я.И. Фет. – Новосибирск: Академическое издательство Гео, 2006.– 339 с. – ISBN 5-9747-0038-4 Герои и авторы публикуемых очерков – выдающиеся ученые разных стран, пионеры кибернетики. Они делятся...»

«Тесты по темам программы предмета Прикладная информатика Тема Основные устройства ПК. Их назначение Вопросы, соответствующие низкому уровню 1. Что из перечисленного не является носителем информации? а) Книга б) Географическая карта в) Дискета с играми г) Звуковая плата 2. Какое имя соответствует жесткому диску? а) А: б) B: в) С: г) Я: 3. Что необходимо делать в перерывах при работе за ЭВМ? а) Почитать книгу б) Посмотреть телевидение в) Гимнастику для глаз 4. Какое устройство оказывает вредное...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины: Экономика для специальности 0808165 Прикладная информатика (по областям) Факультет: агрономический Ведущая кафедра: экономической теории Дневная форма обучения Вид учебной работы Курс, Всего часов семестр Лекции 1 курс, 2семестр Практич. занятия (семинары) 1 курс, 2семестр...»

«Нижегородский государственный Нижегородский областной центр университет им. Н.И. Лобачевского реабилитации инвалидов по зрению Камерата Теория и практика Тифло-IT Сборник статей издан в рамках проекта Создание межрегионального ресурсного центра тифлокомпьютеризации для НКО инвалидов по зрению, поддержанного Министерством экономического развития РФ г. Нижний Новгород 2013 1 УДК 376 ББК 32.81+74.3 Т33 Теория и практика Тифло-IT. Сборник статей. Сост. Рощина М.А. – Нижний Новгород: ООО...»






 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.