WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 

Pages:   || 2 |

«РЕФЕРАТ Отчет 77 с., 1 ч., 7 рис., 3 табл., 75 источников. РАК ЖЕЛУДКА, ПРОТЕОМНЫЕ МАРКЕРЫ, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД, КЛОНИРОВАНИЕ, АНТИТЕЛА ...»

-- [ Страница 1 ] --

РЕФЕРАТ

Отчет 77 с., 1 ч., 7 рис., 3 табл., 75 источников.

РАК ЖЕЛУДКА, ПРОТЕОМНЫЕ МАРКЕРЫ, ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ,

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД, КЛОНИРОВАНИЕ, АНТИТЕЛА

Объектом исследования являются протеомные маркеры злокачественных

опухолей желудка диффузного и интестинального типов.

Идентификация наиболее информативных Цель выполнения НИР.

протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга рака желудка (РЖ) интестинального и диффузного типа; создание высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Цель работы шестого этапа — обобщение и оценка результатов исследований.

Результаты, полученные при проведении 6 этапа работы. Проведено обобщение и анализ результатов работ предыдущих этапов. Проанализирована полнота решения задач и эффективность полученных результатов в сравнительном аспекте с современным научно-техническим уровнем. Научная продукция, полученная при выполнении проекта:

-Новая научная информация об ассоциированных с РЖ белках в популяции Российской Федерации как основа для изучения патогенеза и выявления новых маркеров диагностики и прогноза заболевания, а также терапевтических мишеней.

комплексный подход для дизайна иммуногенных фрагментов -Разработан (мимотопов и полипептидов) для белков AKR1B10, INHBA и PMEPA1;

- Получены хроматографические сорбенты для аффинной очистки IgG из высокоспецифичных поликлональных сывороток крови кролика против AKR1B10, INHBA и PMEPA1;

-Получены специфические поликлональные АТ к AKR1B10, к INHBA и к PMEPA и охарактеризованы по ряду параметров (содержание белка, молекулярно-массовое распределение, подлинность, специфичность).

-Разработан способ прогнозирования вероятности гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка на основе определения белка AKR1B10 в ткани опухоли с использованием оригинальных высокоспецифичных антител методом ИГХ (получено решение о выдаче патента). Собраны необходимые реагенты для создания экспериментального образца тест-системы и оформлена инструкция по ее использованию.

способ прогнозирования гематогенного метастазирования при -Разработан диффузном типе рака желудка на основе определения белка PPIA в клетках опухоли ИГХ методом с использованием коммерческих антител. Подана заявка на изобретение.

-Подготовлен проект новой медицинской технологии.

Проведена оценка возможности создания конкурентно способной продукции.

Предложены рекомендации по использованию результатов НИР, в том числе с учетом возможной коммерциализации.

Представлен научно-технический отчет. Достигнуты заявленные значения программных индикаторов и показателей по подготовке и закреплению в сфере науки молодых научных кадров.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………..............……… ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………..………….............….. 1.Обобщение результатов предыдущих этапов работ. Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем………………………………..................… 1.1 Обобщение результатов предыдущих этапов работ………………....…................…. 1.2 Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем……………

2. Оценка возможности создания конкурентоспособной продукции и услуг и разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР, включая предложения по коммерциализации. ……………………………..............…… 3.Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс…………………………………………………………………….…..............…. 3.1. Участие ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН в совершенствовании образовательного процесса………………………………………………

3.2 Подготовка образовательных программ………………………………............…… 4. Написание проекта новой медицинской технологии……………….............….……... ЗАКЛЮЧЕНИЕ.…………………….……………….………….……………............….. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.………..……….…............………

ВВЕДЕНИЕ

Разработка принципиально новых и совершенствование существующих методов профилактики, диагностики, лечения и реабилитации социально значимых заболеваний человека, основанных на использовании новейших медицинских технологий, является одним из приоритетных направлений научных разработок в области биомедицины. Перед российской научной общественностью стоит задача обеспечения достижения научных результатов мирового уровня, создания условий для эффективного воспроизводства научных и научно-педагогических кадров и закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий.

Доказано, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения онкологических заболеваний. Однако в настоящее время для большинства наиболее распространённых видов опухолей, в том числе для рака желудка, занимающего ведущие позиции в структуре смертности, не идентифицированы достаточно информативные диагностические и прогностические маркеры, вследствие высокой вариативности механизмов канцерогенеза и трудоёмкости методов идентификации опухолевых маркеров.

Известно, что злокачественный фенотип опухоли, ответственный за ее возникновение и прогрессию, определяется, в конечном счете, качественным и количественным изменением профиля белковых молекул, вовлеченных в канцерогенез. Предполагается, что могут быть выявлены белки, избирательно высоко экспрессированные в разных типах РЖ (интестинальном или диффузном), что даст возможность разработать тест-системы для дифференциальной ранней диагностики РЖ и прогноза клинического течения этих типов опухолей. В последние 10 лет были предприняты многочисленные попытки сравнительного транскриптомного анализа опухолей различной локализации (по оценке экспрессии мРНК с использованием технологии ДНК-микроаррей, генных чипов), однако было обнаружено отсутствие четкой корреляции между экспрессией мРНК и канцерогенезом, поскольку часто наблюдаются существенные различия между синтезом мРНК и белка, которые кодируются одним и тем же геном. В этой связи количественные и качественные изменения посттрансляционно модифицированных протеинов, как конечного продукта, рассматриваются как более информативные, по сравнению с мРНК, для изучения молекулярных событий в процессе канцерогенеза.

Известно, что 95% всех опухолей желудка представлены аденокарциномами, которые по гистологическому строению подразделяют на интестинальный и диффузный типы, различающиеся по характеру клинического течения и прогнозу, а, следовательно, и патогенезу. Наличие избирательной активности генов в различных по молекулярному патогенезу гистологических типах РЖ - диффузном и интестинальном, делает актуальной работу по планомерному поиску генов, белковые продукты которых могут служить маркерами ранней диагностики или прогноза клинического течения заболевания.

Для идентификации опухолевых маркеров широко применяются протеомные методы сравнительного анализа белковых профилей нормальных и опухолевых тканей. Такой подход позволяет идентифицировать белковые маркеры, ассоциированные с опухолевой трансформацией. Для разработки потенциальных молекулярных маркеров с диагностической целью необходимо выявление белков, содержание которых существенно повышено в опухоли и биологических жидкостях, что позволило бы осуществлять их детекцию на ранних этапах опухолевого процесса.

Настоящий проект был посвящен идентификации информативных белковых маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга рака желудка и разработке высокочувствительных тест-систем для их детекции в биологических образцах.

Для достижения заявленных целей в процессе выполнения НИР были решены следующие задачи:

1. Идентификация потенциальных протеомных маркеров рака желудка различных гистологических типов.

2. Поиск белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка.

3. Отбор диагностических и прогностических маркеров рака желудка.

4. Оценка эффективности детекции маркеров.

прогнозирования течения заболевания.

В процессе проведения НИР ставились задачи подготовки и закрепления в формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

На основе комплексного подхода, включающего использование известных и оригинальных алгоритмов биоинформатического анализа (по базам данных dbEST, SAGE и Oncomine, содержащих сведения об изменении уровня мРНК и микроРНК при различных патологических состояниях), литературных источников, массспектрометрией, был выявлен ряд белков, ассоциированных с раком желудка.

Потенциальные маркеры отбирались по изменению (повышению или понижению) уровня генной экспрессии в опухолевой ткани по сравнению с парной нормальной слизистой не менее, чем в 2 раза, а также по представленности измененного уровня экспрессии по меньшей мере в 50% исследуемых парных образцов. Подтверждение стабильной дифференциальной экспрессии было получено путем оценки генной экспрессии или синтеза белков в парных образцах опухолевой и нормальной ткани.

Для повышения эффективности детекции потенциальных маркеров получены специфические поликлональные АТ к белкам AKR1B10, INHBA и PMEPA1.

метастазирования при кишечном типе рака желудка на основе определения белка AKR1B10 в ткани опухоли с использованием оригинальных высокоспецифичных антител методом ИГХ. Разработан способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка на основе определения белка PPIA в клетках опухоли ИГХ методом с использованием коммерческих антител.

На заключительном этапе выполнения проекта необходимо провести комплексный анализ полученных результатов, с тем, чтобы оценить значимость фундаментальных и практических достижений и наметить их дальнейшее развитие и возможности использования.

Оценка достижений в области образовательных (педагогических) задач позволит наметить перспективные шаги по совершенствованию образовательного процесса студентов медицинских и биологических специальностей на основе опыта, полученного при проведении НИР.

Ниже представлен перечень работ, проведенных на заключительном этапе:

1.Обобщение результатов предыдущих этапов работ. Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научнотехническим уровнем.

2. Оценка возможности создания конкурентоспособной продукции и услуг и разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР, включая предложения по коммерциализации.

3.Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс.

4. Написание проекта новой медицинской технологии.

Все вышесказанное определило проведение исследований, результаты которых представлены в отчете. В исследованиях активное участие принимали студенты и аспиранты Национального Исследовательского Томского государственного университета и Сибирского государственного медицинского университета.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1.Обобщение результатов предыдущих этапов работ. Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем 1.1 Обобщение результатов предыдущих этапов работ В процессе выполнения первого и второго этапов работы был проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов по теме проекта, выполнены патентные исследования, что позволило обосновать актуальность выбранного направления исследований. На базе клиники НИИ онкологии СО РАМН собраны парные образцы опухолей и нормальных тканей, полученных при хирургическом вмешательстве, от 70 пациентов с диффузным и интестинальным типами первично-диагностированного рака желудка.

Сформирован банк образцов крови (сывороток), а также тканей в парафиновых блоках. Все образцы тканей снабжены полной клинической документацией и охарактеризованы гистологически, диагноз подтвержден. Сформирован банк данных парафиновых блоков от 120 пациентов с прослеженной историей после лечения. Сформированы компьютерные регистры пациентов, с постоянным пополнением выборки и данных по мониторингу пролеченных пациентов. Банк различных образцов биологического материала от больных РЖ, с одной стороны, дал возможность адекватного выбора материала (формирования выборок) для исследований в соответствии с решаемыми задачами, с другой, позволяет продолжить исследования по валидации маркеров и выявлению их диагностической и прогностической значимости.

Использован комплексный подход для поиска ассоциированных с РЖ белков – потенциальных маркеров, включавший в себя: анализ он-лайн баз данных миРНК и генной экспрессии и протеомный анализ.

В результате биоинформатического поиска с помощью баз данных Oncomine, было отобрано восемь не идентифицированных ранее генов dbEST, SAGE потенциальных прогностических маркеров РЖ, кодирующих следующие белки:

GPNMB (трансмембранный потенциал опухолевых клеток); SERPINH1 (мембранный белок ингибирующий активность сериновых протеаз); SPARC (секретируемый белок, регулирующий пролиферацию клеток); SULF1 (внеклеточный фермент отщепляющий сульфатные группы гепарин сульфатов); CLDN4 (участвует в образовании межклеточных контактов, влияет на дифференцировку); KRT6А (белок цитоскелета, экспрессируемый преимущественно в эпителиальных тканях); PMEPA (трансмембранный белок, индуцируемый андрогенами предстательной железы и другими гормонами).

В результате биоинформатического поиска с целью выявления микроРНК, уровень экспрессии которых понижается в опухоли при РЖ, с последующей идентификацией их мРНК-мишеней, было выявлено 15 генов, уровень экспрессии которых в опухоли повышается.

Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с раком желудка белков, для которых установлены выраженные количественные изменения, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволяет получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков. В последние годы используются методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.

Протеомный анализ парных образцов опухолевой и немалигнизированной тканей желудка с использованием 2D-электрофореза позволил выявить восемь потенциальных маркеров рака желудка, которые относятся к группам белков, формирующих цитоскелет, участвующих в фолдинге и деградации белков, а также выполняющих роль регуляторов клеточного цикла (TB10, PPIA, CTSD, TPM3, S100A9, TXN, SOD2, S100A6). Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицировали масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

Для подтверждения измененной генной экспрессии идентифицированных в наших исследованиях потенциальных белковых маркеров проведен анализ уровня экспрессии мРНК в замороженных парных образцах опухолевых и неизмененной тканей желудка методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией.

В результате сравнения уровней экспрессии исследуемых генов в нормальной и опухолевой ткани желудка методом ПЦР с обратной транскрипцией выявлено статистически значимое стабильное повышение в опухоли экспрессии следующих генов: PPIA, SPARC, INHBA, PMEPA 1, GPNMB, CTGF, S100A6, FGF и снижение экспрессии гена AKR1B10 и WNT4. Следует отметить, что несмотря на выраженную дифференциальную экспрессию SPARC, S100А6 в опухолях желудка, эти белки не представляют существенного интереса для сывороточной диагностики по ряду причин. Многочисленные сведения, полученные в последние 3 года, о высокой прогностической значимости белка SPARC при интестинальном типе РЖ, а также белка S100A6, и для диффузного, и для интестинального типов, указывают на нецелесообразность продолжения исследований этих белков [1, 2]. INHBA, циклофилин А и AKR1B10 являются растворимыми белками и потенциально могут детектироваться в биологических жидкостях организма, в том числе в сыворотке, с целью ранней диагностики. Однако речи о диагностической значимости AKR1B не может идти в связи со снижением его экспрессии в опухолях желудка, а повышение циклофилина А показано для целого ряда злокачественных новообразований, что свидетельствует о его неспецифичности. Поскольку повышение экспрессии INHBA в раке желудка наблюдается независимо от стадии, и он является растворимым, актуальны исследования по определению его диагностической значимости.

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка использовали метод вестерн-блот анализа, проведение которого позволяет уточнить результаты, полученные при оценке генной экспрессии, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции. Определение среднего уровня PPIA в 32 парных образцах позволило выявить повышение белковой экспрессии в опухолевой ткани у 63% больных. Повышенный уровень экспрессии GPNMB в опухоли отмечается у 30% больных, в то время как оверэкспрессия TXN лишь у 16%. Следует указать, что при тестировании уровня мРНК в парных образцах опухоли и неизмененной слизистой желудка повышенная генная экспрессия TXN была выявлена в 17%, а GPNMB - в 60% случаев, значимых различий между разными гистотипами РЖ не отмечено.

Детектировать другие белки на материале замороженных парных образцов не представилось возможным, ввиду их низкой копийности, а также низкой чувствительности коммерчески доступных антител.

На третьем и четвертом этапе исследования была проведена оценка прогностической значимости нескольких наиболее перспективных белков по их экспрессии в ткани опухоли in situ иммуногистохимическим методом с использованием коммерческих антител на основе сопоставления уровня экспрессии этих белков с клинико-патологическими параметрами развития опухоли, а также с результатами отдаленного наблюдения после лечения. При этом учитывалось появление рецидивов и отдаленных метастазов, характеризующих опухолевую прогрессию. Экспрессия AKR1B10 оценивалась по процентному содержанию положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли на различной глубине инвазии. В опухолях диффузного типа рака желудка экспрессия AKR1B10 менее выражена в сравнении с экспрессией в цитоплазме клеточных элементов карциномы интестинального типа. Различий в экспрессии белка AKR1B10 у больных с диффузным и интестинальным типами рака желудка в зависимости от глубины инвазии опухоли не обнаружено (без учета гистологического варианта опухолевых структур). В случаях с развитием гематогенной диссеминации процент экспрессии AKR1B10 не изменялся при нарастании глубины инвазии опухолью стенки желудка, в случаях же с отсутствием прогрессирования процент экспрессии маркера снижался по мере погружения новообразования в толщу стенки органа, данные указывают на перспективность тестирования указанного белка в опухолях желудка в качестве дополнительного критерия прогноза.

Не было выявлено отличий в проценте экспрессии PPIA у больных с диффузным и кишечным типами рака желудка в зависимости от глубины инвазии опухоли. У больных с диффузным типом опухоли гематогенные метастазы выявлялись чаще при отсутствии экспрессии PPIA в клетках опухоли, в то время как при кишечном типе рака желудка частота возникновения отдаленных метастазов не была связана с наличием экспрессии PPIA.

Таким образом, для AKR1B10 и PPIА была показана связь с отдаленным метастазированием, что свидетельствует о их прогностическом значении.

которого было отмечено для рака желудка интестинального типа, в связи с его вовлеченностью в патогенетически важные механизмы опухолевой прогрессии, связанные с отдаленным метастазированием, и практическим отсутствием данных в литературе, также представляет интерес для дальнейших исследований.

Практически тотальное повышение уровня экспрессии INHBA в опухолях желудка независимо от стадии процесса делает актуальным исследование его диагностической значимости.

Выявление потенциальных белковых маркеров для ранней диагностики или прогноза клинического течения заболевания требует разработки подходов к повышению чувствительности методов детектирования белков в биоматериале, в частности, с использованием иммунохимического анализа. Несмотря на широкий ассортимент коммерчески доступных антител, предлагаемых известными производителями (Abcam, Novus Biologicals, Santa Cruz, Sigma Aldrich), наш опыт экспериментальной работы показал, что зачастую их специфичность является недостаточной для обнаружения интересующего белка в исследуемом материале.

Особенно, принимая во внимание, что часто такие белки являются минорными. При этом основная масса коммерческих антител предназначена для исследовательских целей. В частности, все обнаруженные нами коммерческие антитела против PMEPA1 протестированы производителями исключительно с использованием рекомбинантного белка, возможность детекции белка в клиническом материале не гарантируется ни одним производителем. Все это делает актуальным разработку технологии получения высокоспецифичных антител к белкам - потенциальным биомаркерам злокачественных новообразований. Для валидации диагностической и прогностической значимости указанных белков в ходе выполнения проекта были получены поликлональные антитела, обладающие высокой авидностью к соответствующим антигенам.

В ходе выполнения 4 этапа проекта было выполнено клонирование нуклеотидной последовательности, соответствующей выбранному фрагменту потенциального протеинового маркера рака желудка (AKR1B10). Дизайн антигена был осуществлен на основе сравнительного биоинформатического анализа аминокислотных последовательностей различных представителей семейства альдокеторедуктаз млекопитающих. Для экспрессии были выбраны векторы систем pQE и pET. Был осуществлен скрининг различных бактериальных штаммов для экспрессии рекомбинантного белка, для выбора оптимального, способного обеспечить наибольший выход и корректный фолдинг целевого полипептидного фрагмента. Первоначально, с использованием полуэмпирического метода, предложенного Kolaskar и Tongaonkar, был выбран теоретически наиболее экспрессионный вектор pET21a. Полученной конструкцией трансформировали компетентные клетки E.coli, штаммы JM106, Rosetta, BL21(DE3), используя метод теплового шока, с последующей селекцией на твердой питательной среде LB c ампициллином. Были проведены работы по оптимизации уровня экспрессии фрагмента AKR1B10 посредством подбора оптимальной среды и условий культивирования, а также условий индукции. Выполнены работы по оптимизации условий гетерологичной экспрессии и очистке рекомбинантного белка AKR1B (фрагмент G214-Y316) в клетках E. coli BL21(DE3). Подобраны условия для рефолдинга целевой биомолекулы из телец включений, с применением методов гель-фильтрации и КД-спектрополяриметрии было установлено, что препарат белка гомогенен, а также имеет околонативную конформацию. Для получения поликлональных антител к потенциальному прогностическому маркеру AKR1B проведена иммунизация лабораторных животных полученным рекомбинантным фрагментом AKR1B10_G214-Y316.

Получение АТ против выявленных в процессе поиска потенциальных маркеров рака желудка PMEPA1 и INHBA осложнилось тем, что один из них представлял мембраносвязанный белок (обладающий низкой растворимостью), а другой обладал сложными пост-трансляционными модификациями, как то, множественные дисульфидные связи. Нами был разработан подход, позволивший получать высоко-специфичные антитела от лабораторных животных, путем иммунизации последних конъюгатами пептидов-миметиков антигенных детерминант с белком-носителем.

Методами твердофазного пептидного синтеза получены пептиды-миметики антигенных детерминант белков PMEPA1 и INHBA, проведена конъюгация с белком-носителем (овальбумином) и иммунизация кроликов с целью получения специфической сыворотки. Иммуноферментный анализ активности полученных кроличьих поликлональных сывороток к коньюгатам (предварительно истощенных против белка-носителя) показал, что получен необходимый уровень иммунного ответа на пептиды-миметики. Получены хроматографические сорбенты на основе NHS-сефарозы с ковалентно-пришитыми пептидами для выделения фракции, обогащенной анти-пептидными антителами. Выполнены эксперименты по очистке (в том числе и в полу-препаративном масштабе), подтвердившие высокую иммуногистохимическим анализом показано сродство иммунных сывороток к пептидам PMEPA1 и INHBA к продуктам в цитоплазме опухолевых клеток и в части элементов воспалительного инфильтрата.

В ходе выполнения 5 этапа проекта были продолжены работы по иммунизации лабораторных животных (кроликов) с целью получения АТ к синтетическим антигенным детерминантам белков INHBA и PMEPA1. Осуществлен ряд экспериментов для подбора оптимального (комбинированного) подхода к выделению фракции АТ из сыворотки крови иммунизированных животных. Были проанализированы следующие методы и их комбинации: преципитация грубой иммуноглобулиновй фракции 45% раствором сульфата аммония, осаждение сывороточных белков каприловой кислотой, аффинная хроматография на белок-Gсефарозе, хроматография на аффинной колонке с иммобилизованным лигандом.

Наилучшие результаты были получены при использовании метода, включавшего в себя две стадии хроматографической очистки IgG фракции. Тотальный пул сывороточных АТ был выделен на белок-G-сефарозе, затем фракции объединяли в пул, концентрировали и наносили на NHS-HiTrap колонку с иммобилизованым лигандом, элюцию вели глицин-фосфатным буфером с рH 2,5. Типичные хроматограммы, представлены на Рисунке 1.

Рисунок 1 – Профили хроматографической элюции фракций Примечание – синим цветом, показана оптическая плотность, при длине волны нм, пунктирной линией обозначена концентрация элюирующего буфера Конечный выход целевого белка составил 0,5-1 мг/мл сыворотки. Контроль качества полученных препаратов IgG был осуществлен с использованием различных методов.

пробоподготовки - получению экстрактов тканей желудка для постановки иммуноблоттинга, с целью оценки уровня экспрессии белка PMEPA1.

Пробоподготовка является важным этапом протеомного анализа, т.к. наличие в пробе различных контаминантов (таких как протеазы, липиды, нуклеиновые кислоты) могут существенно затруднить интерпретацию полученного результата.

Целью гомогенизации ткани является растворение как можно большего количества белков. Эта процедура часто требует использования хаотропных агентов, детергентов, а также редуцирующих реагентов.

Замороженный образец ткани (масса образца в среднем 170 мг) помещали в охлажденную жидким азотом гильзу дисмембратора Mikro-Dismembrator U (Sartorius). Образец гомогенизировали при частоте встряхивания 2000 кГц ( об/мин) в течение 2 минут. Полученный гомогенат переносили в охлажденные жидким азотом пробирки и замораживали при -80°С. В связи с отсутствием описаного в литературе, стандартного протокола приготовления белковых экстрактов из тканей желудка нами был проведен сравнительный анализ четырех буферных систем: 1) RIPA буфер (A): 0,1% ДСН, 0,25% Na-дезоксихолат, 1 мМ ФМСФ, 1 мМ ЭДТА, ФСБ, pH 7.4; 2) RIPA буфер (B): 0,1% ДСН, 0,5% Naдезоксихолат, 1% NP-40, 150 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, pH 8.8; Буфер с мочевиной (C): 0,1% ДСН, 7 M Мочевина, 50 мМ ДТТ, ФСБ, pH 7.4; 4) Буфер с мочевиной (D):

0,1% ДСН, 5 M Мочевина, 2 M Тиомочевина, 100 мМ ДТТ, ФСБ, pH 7.4.

Буферы A и B содержат в основном ионные детергенты и ингибиторы протеаз, в то время как, буферы C и D дополнительно имеют в своем составе хаотропные агенты – мочевину и тиомочевину. Замороженные гомогенизированные образцы опухолевой и нормальной тканей массой мг ресуспендировали в соответствующем буфере и озвучивали. Применялся УЗ-гомогенизатор (ColeParmer 750-Watt Ultrasonic Homogenizer), в режиме 1 мин – 30% от максимальной мощности пульсации (10 секунд с паузами между циклами), в пяти повторах.

Интенсивно встряхивали образцы на вортексе при 3500 оборотах, в течение 2 минут (с 2 минутными паузами между циклами), в пяти повторах. Затем осуществляли встряхивание на шейкере, при +4°С в течение 1 часа. Для удаления не растворившихся частиц образцы центрифугировали, при 13,200 об/мин, при +15°С в течение 1 часа. Супернатанты отбирали для дальнейшей работы, осадки ресуспендировали в 100 мкл PBS, pH 7.4. Результаты скрининга приведены на Рисунке 2.

Рисунок 2 – Результат электрофоретического разделения белковых экстрактов с использованием различных буферных систем.

Примечание – s - супернатант, p - осадок. Показано содержание -актина в каждом из образцов с использованием иммуноблоттинга.

Разработанный нами метод является весьма многообещающим, так как позволяет визуально детектировать количественное изменение интересующего потенциального биомаркера в экстрактах тканей желудка и позволяет иммунохимически подтвердить результаты определения уровней экспрессии мРНК.

Данный подход был успешно применен нами для оценки качества полученных поликлональных антител к PMEPA1.

1.2 Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем Одной из основных научных задач, требующих первоочередного решения в рамках критической технологии «Технологии снижения потерь от социально значимых заболеваний» является разработка методов диагностики ранних стадий развития онкологических заболеваний, прогнозирования метастазирования и послеоперационных рецидивов, оптимизация схем химиотерапии.

В России, как и в большинстве других стран, эффективных программ скрининга РЖ не существует, а для постановки диагноза необходимо проведение гастроскопии с биопсией, при этом отсутствуют достаточно чувствительные методы молекулярной диагностики. В этой связи актуальным является поиск маркеров ранней диагностики и остается актуальным поиск новых прогностических маркеров, использование которых могло бы предсказывать риск прогрессии (рецидивирование и отдаленное метастазирование) заболевания. В настоящее время в клинической практике для послеоперационного мониторинга пациентов c РЖ используется ряд сывороточных маркеров (СА19-9, СА 72-4, РЭА), обладающих умеренной прогностической значимостью примерно лишь для трети всех больных РЖ, однако они имеют высокую перекрестную реактивность и неэффективны для ранней диагностики [3]. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) [4] показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности.

Молекулярные онкомаркеры по своей биологической природе и методам выявления можно разделить на несколько типов: генетические (мутации, изменение копийности генов, экспрессии и профиля мРНК), эпигенетические (изменение профиля метилирования ДНК), протеомные (изменение уровня и профиля белковой экспрессии), метаболомные (изменение уровня и спектра низкомолекулярных метаболитов), изменения профиля и уровня микроРНК [5].

Для поиска потенциальных диагностических онкомаркеров обычно проводится идентификация генных транскриптов или белков, преимущественно синтезируемых в опухолях определенного типа, но не в нормальных тканях. Для обнаружения таких белков, ассоциированных, в частности, с РЖ, могут быть использованы следующие подходы: анализ уже имеющихся в открытом доступе баз данных генной экспрессии в опухоли желудка (которые содержат результаты исследования на микроматрицах и предоставляют данные одновременно о тысячах генов), и анализ генной экспрессии образцов опухолевой и нормальной ткани из собственных коллекций с использованием коммерческих микроматриц [6]. Достаточно продуктивным является исследование экспрессии белков методом сравнительного анализа протеома нормальной и опухолевой ткани с последующей идентификацией дифференциально экспрессирующихся белков методом масс-спектрометрии и подтверждением различий в генной экспрессии (ОТ-ПЦР) или уровне синтеза белка (вестерн-блот) на коллекциях парных образцов опухолей и нормальных тканей от больных раком [7, 8, 9, 10].

При выполнении НИР существенное внимание было уделено поиску ассоциированных с РЖ маркеров с использованием мировых информационных ресурсов – баз данных миРНК и генной экспресси, с учетом различий гистологических типов опухолей – кишечного и диффузного, которые имеют свои клинико-эпидемиологические особенности, разный прогноз и различия в патогенезе.

Выявленные в результате информационного поиска потенциальные маркеры подвергались последующей оценке различий в уровне экспрессии методом ПЦР с обратной транскрипцией на материале собранной в процессе работы коллекции парных образцов нормальной и опухолевой ткани от пациентов с раком желудка.

В процессе информационного поиска на основе баз микроРНК при выборе генов-кандидатов учитывались не только уровни их транкрипции, но и постранскрипционная регуляция, что значительно повышает его надежность и кратно сокращает число выявляемых в итоге генов, в последующем подвергающихся более детальному анализу. МикроРНК – важнейший фактор, определяющий связь уровня синтеза белка и кодирующей его мРНК. Экспрессия микроРНК (в настоящее время у человека идентифицировано более 800 их видов), приводит к посттранскрипционному ингибированию синтеза продуктов целого ряда генов (в среднем около трёхсот на одну микроРНК) в результате гибридизации микроРНК и мРНК-мишеней. Было показано, что, в зависимости от мРНК-мишени, разные микроРНК в опухолевых клетках могут играть как онкогенную, так и супрессорную роль [11]. Учёт изменений уровня синтеза различных микроРНК клетки может послужить своеобразным мостом в применении транскриптомных методов для поиска протеомных маркеров [12].

Для проведения эффективного поиска онкомаркеров, основанного на отборе микроРНК с пониженным уровнем экспрессии в опухолях, необходимо учитывать два обстоятельства. Первое- возможность регуляции одной мРНК несколькими микроРНК: часть микроРНК, для которых данная изоформа мРНК является мишенью, обладают пониженным уровнем экспрессии в опухоли, другая часть микроРНК, непосредственно влияющая на трансляцию с данных мРНК, может быть сверхэкспрессирована и подавлять синтез белка – потенциального онкомаркера.

Второе - необходимость учета изменения не только уровня трансляции с исследуемой мРНК, но и уровня её транскрипции в опухоли по сравнению с нормой.

Использованный в работе подход основан на двойном отборе – идентификации генов, для которых повышение экспрессии происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Также проводится оценка степени влияния микроРНК, как с пониженным, так и с повышенным уровнем экспрессии в опухоли [13].

В качестве окончательных кандидатов отобрано 15 генов, для которых увеличение уровня экспрессии происходит наиболее вероятно, как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции, из которых для дальнейшего транскрипционного анализа были выбраны: WNT4, FGF12, EFEMP1, CTGF, и HSPG2. Эти пять генов участвуют в регуляции таких процессов, как митотическая активность, апоптоз, миграция, генная экспрессия, пролиферация и регенерация.

Кроме того, некоторые из этих генов функционально связаны между собой посредством важных в онкогенезе регуляторных белков: TGF (transforming growth factor beta) и HSPG, - и, ввиду тех функций, которые они выполняют, вовлечены в этиопатогенез злокачественных новообразований, в том числе и РЖ. Мы оценили уровень транскрипции указанных генов в замороженных парных образцах опухолевой и нормальной ткани желудка методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени.

При проведении экспериментальной проверки уровня транскрипции выбранных для исследования генов в опухолях желудка разных гистотипов были выявлены существенные изменения экспрессии трех генов: FGF12, WNT4 и CTGF.

В опухолях диффузного типа средний уровень мРНК гена фактора роста фибробластов FGF12 оказался существенно выше, чем в нормальной слизистой, при этом повышение на индивидуальном уровне отмечено у 62,5% пациентов, подобных данных в мировой литературе нами не найдено. Члены семейства факторов роста фибробластов играют важную роль в процессах эмбрионального развития, вовлечены в регуляцию митоза, клеточной выживаемости, пролиферации, морфогенеза, тканевой регенерации [14]. Специфическая функция FGF12 еще не определена, а тот факт, что при трансфекции гена в клетки млекопитающих белок накапливается в ядре и не секретируется, указывает на его свойства как ядерного сигнального элемента. Есть косвенные данные о его возможном вовлечении в процессы неоангиогенеза способности ингибировать апоптоз, что свидетельствует о потенциальной онкогенной роли FGF12 [16].

Для гена CTGF показан более высокий уровень мРНК в опухолях диффузного типа по сравнению с интестинальными, а также повышение экспрессии в опухолях больных с распространением процесса в региональные лимфоузлы. CTGF, открытый в 90-х годах, как ростовой фактор, секретируемый клетками эндотелия сосудов человека [17], регулирует пролиферацию, миграцию, выживаемость клеток, адгезию и ангиогенез [18]. Полученные в работе данные о повышении экспрессии гена CTGF у больных с наличием метастазов в региональные лимфоузлы указывают на его вовлечение в опухолевую прогрессию, подобные сведения были получены и другими авторами [19]. Это подтверждается наличием функциональной взаимосвязи генов CTGF и TGF в эпителиально-мезенхимальным переходе (ЭМП), который рассматривается в качестве одного из ведущих механизмов, определяющих метастатический потенциал опухоли. TGF, ключевой фактор ЭМП, регулирует экспрессию гена CTGF, в промоторном участке которого имеются элементы связывания TGF и сайт связывания Smad [20, 21]. Для CTGF показана способность ингибировать экспрессию E-кадхерина, что совпадает с основным механизмом TGF-зависимого ЭМП [20]. Принимая во внимание, что снижение экспрессии Eкадхерина является одним из молекулярных механизмов развития наследственного РЖ диффузного типа, можно предположить, что полученные нами данные о повышении экспрессии гена CTGF в опухолях данного гистологического типа отражают его роль в патогенезе РЖ.

целесообразности дальнейших исследований для прояснения роли генов CTGF, FGF12 и WNT4 в патогенезе РЖ различных гистологических типов и оценки возможности их использования в качестве маркеров рака желудка.

Другой использованный биоинформационный подход основывался на отборе мРНК, уровень транскрипции которых наиболее часто возрастает одновременно в интестинальных и диффузных опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями. Поиск осуществляли по базе данных Oncomine (https://www.oncomine.org/ resource/login.htm) [22] в коллекции образцов Чена [23]. Гены-кандидаты для специфической диагностики и прогноза интестинального и диффузного подтипов РЖ отбирали на основе: 1) для дифузных опухолей - присутствие среди 1% генов с наибольшим уровнем транскрипции в диффузных опухолях по сравнению с нормой, при отсутствии изменения уровня экспрессии в интестинальных опухолях желудка или её понижении (P 0.1, использовали стандартный критерий Стьюдента); 2) для интестинальных опухолей применялся зеркальный вариант анализа. Исходный набор генов-кандидатов (91 ген) получили в результате объединения двух полученных выборок. Затем набор был разделён на две части, содержащие гены, кодирующие секретируемые белки (14 генов для поиска диагностических маркеров, секреция которых во внеклеточное пространство или кровоток подтверждалась нижеописанными критериями) и все остальные гены (77 генов, для поиска прогностических маркеров).

Отбор генов, кодирующих белки, секретируемые в кровоток или во внеклеточное пространство проводили с использованием двух критериев: 1) присутствие кодируемого белка в базах, содержащих экспериментально (http://www.biosino.org/bodyfluid/home.jsp) [25] присутствие кодируемого белка как минимум в двух из трёх баз данных секреторных белков, не подтверждённых экспериментально: 1) eSLDB (http://gpcr.biocomp.unibo. it/esldb/index.htm) [26]; 2) LOCATE [27] и Babelomics (http://babelomics.org) [28]. Из набора секретируемых белков были удалены восемь генов, кодирующих различные изоформы коллагенов, низкая информативность которых для диагностики и прогнозирования опухолей была показана ранее.

На втором этапе была проведена элиминация транскриптов, уровень синтеза (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) в клетках костного мозга, белых клетках крови и сосудах более чем вдвое превышает усреднённый уровень синтеза в опухолевых тканях желудка.

На третьем этапе проводили дополнительную оценку изменений уровня транскрипции мРНК, кодирующих потенциальные прогностические онкомаркеры, в нормальных и опухолевых тканях по базе данных dbEST.

На последнем этапе повторяли анализ, выполненный по базе данных dbEST, с использованием базы данных SAGE (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE) по окончании которого элиминировали все гены, ранее описанные в литературе. Таким образом, в результате использования трёх различных методов биоинформатического поиска онкомаркеров РЖ было идентифицировано восемь потенциальных прогностических маркеров опухолей желудка, при этом поиск потенциальных диагностических маркеров и маркеров, специфичных для интестинального или диффузного подтипов РЖ, оказался непродуктивным.

PMEPA1 - трансмембранный белок, показавший повышение генной экспрессии в опухоли по сравнению с нормой. Данный белок относится к группе трансмембранных белков I типа и выполняет важные функции в ряде сигнальных путей [29]. Выявлена явная функциональная связь гена PMEPA1 и ростового фактора TGF при раке молочной железы, раке желудочно-кишечного тракта и других локализациях, при которых уровень его экспрессии возрастает [30, 31, 32, 33]. В свою очередь TGF вовлечен в процессы апоптоза, регуляции роста клеток и их дифференцировки [34]. Клетки под действием TGF претерпевают полный эпителиально-мезенхимальный переход, теряя способность к адгезии, что способствует диссеминации опухолевого процесса. Структура белка PMEPA остается не установленной по сей день, однако известно, что он состоит из одного трансмембранного домена и протяженного цитоплазматического фрагмента (ряд доменов в котором и модулирует каскад реакций, инициируемых TGF). Трудности в его получении, в достаточном для проведения иммунизации количестве (в бактериальном штамме-продуценте) обуславливаются именно структурными особенностями. Все обнаруженные нами коммерческие антитела против PMEPA протестированы производителями исключительно с использованием рекомбинантного белка, а не в клиническом материале. Все сказанное свидетельствует об актуальности создания высокочувствительной системы детекции на основе поликлональных антител к белку PMEPA1, обладающему потенциальной прогностической значимостью при раке желудка.

INHBA – растворимый секретируемый белок, генная экспрессия которого повышена в опухоли в 100% случаев. В перспективе может быть создан подход к его детекции в сыворотке, для оценки возможности ранней сывороточной диагностики. Гены INHBA и INHBB являются членами семейства TGF-beta, и играют роль в репродукции и развитии. Ингибины и активины ингибируют и активируют, соответственно, секрецию фолликулостимулирующего гормона гипофизом. Ингибины/активины в зависимости от состава субъединиц вовлечены в регуляцию гипоталамо-гипофизарной секреции гормонов, гормональной продукции половыми железами, развития половых клеток, эритроидной дифференцировки, секреции инсулина, выживаемости нервных клеток, роста костной ткани. Полагают, что INHBA активируется в ответ на пролиферацию ткани. Патологический темп деления при этом должен быть скомпенсирован активацией апоптоза и инактивацией теломеразы. Однако при необратимых изменениях в клетках опухоли (нарушение апоптоза и активация теломеразы) INHBA может выступать как фактор более высокой агрессивности течения заболевания [35].

Экспрессия INHBA повышена в клеточных линиях рака желудка [36], в опухолях желудка [37, 38, 39]. Повышенная экспрессия INHBA коррелирует с диаметром опухоли и глубиной опухолевой инвазии. Пациенты с высокой экспрессией INHBA характеризуются пониженной безрецидивной выживаемостью [40]. Полагают, что INHBA и некоторые другие гены посредством активации сигналинга трансформирующего фактора роста бета могут запускать процессы инвазии и метастазирования. Кроме того, INHBA может являться одним из главных участников в механизме образования фибробластов, ассоциированных с новообразований различных локализаций гиперэкспрессию этого гена в клетках опухоли на ранних стадиях, в основном, связывают с неблагоприятным прогнозом течения заболевания [35, 42, 43, 44].

Описанные информационные подходы к поиску маркеров, используемые разными исследователями, имеют определенные различия, а полученные результаты часто являются противоречивыми. Полученные в настоящей работе на основе биоинформатического анализа данные о стабильном повышении целого ряда белков в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной слизистой являются основой для исследования их патогенетической значимости при раке желудка различных гистологических типов.

В последние годы используются методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных [45, 46].

озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая исследованиях, что может быть обусловлено как методическими особенностями получения белковых экстрактов из тканей, которые могут сказаться на результатах протеомного анализа, так и популяционными (этническими и расовыми) отличиями обследованных выборок больных. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [46, 47, 48, 49, 50].

С целью повышения эффективности протеомного анализа в настоящей работе предложен оригинальный метод получения растворимой фракции минорных (низкокопийных) белков из тканей, позволяющий увеличить разрешающую способность 2D-электрофореза, за счет удаления высококопийных структурных белков.

Следует отметить, что сравнительный протеомный анализ опухолей желудка в российской европеоидной популяции проведен впервые, при этом выявлены потенциальные белковые маркеры, ассоциированные с раком желудка. Проведение 2D-электрофореза на парных образцах опухолевой и нормальной ткани позволило разделить около 450 белковых пятен в каждом геле. Были выбраны наиболее часто повторяющиеся пятна, интенсивность которых увеличена в опухоли по сравнению с нормой, как минимум в 2 раза, не менее чем в четырёх образцах. В ходе сравнительного анализа электрофореграмм выявлено увеличение синтеза 8 белков:

TB10, PPIA, CTSD, TPM3, S100A9, TXN, SOD2, S100A6.

уровня синтеза белков PPIA и TPM3 в опухолях желудка обнаружено нами впервые, тогда как повышенный уровень синтеза TB10, CTSD, S100A6, S100A9, TXN, SOD подтверждается литературными данными [51, 52, 53]. Сравнение частоты повышения уровня синтеза идентифицированных белков в гистологических типах РЖ показало, что повышение уровня синтеза белков TXN и SOD2 происходит в диффузных опухолях заметно чаще, чем в интестинальных. Преимущественная экспрессия белка TXN в опухолях желудка недифференцированного типа (тип, выделяемый в японской классификации, во многом аналогичный диффузным опухолям) описана ранее [54].

Компьютерный анализ базы данных GeneCards (http://www.genecards.org/) [55] показал, что для большинства белков (TB10, CTSD, TPM3, S100A6, S100A9, TXN, SOD2) характерен средний и высокий уровень экспрессии в нормальных и опухолевых тканях различной природы и, следовательно, эти белки не могут использоваться в качестве специфичных маркеров рака желудка.

перспективным является PPIA, поскольку не показано повышения его экспрессии в представителей семейства иммунофилинов и катализирует реакцию цис-транс изомеризации X-Pro пептидной связи. Показано, что данный белок участвует в регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки [56]. Он вовлечен в регуляцию индуктора матриксных металлопротеиназ EMMPRIN (CD147), стимулируя пролиферацию опухолевых клеток поджелудочной железы [57].

Показана сверхэкспрессия PPIA в опухолях молочной железы, эндометрия, поджелудочной железы, колоректальном раке, мелкоклеточном раке легкого, что указывает на его вовлечение в канцерогенез и возможную значимость в качестве маркера ранней диагностики [58, 59, 60, 61]. При этом выявлены ассоциации его экспрессии с опухолевой прогрессией, свидетельствующие о его возможной прогностической ценности. В мировой литературе практически нет данных об экспрессии PPIA в опухолях желудка.

Этот белок был отобран нами для подтверждения более высокой его генной и белковой экспрессии в опухолях по сравнению с нормальной слизистой методом ОТ-ПЦР и вестерн-блот анализа, а также был протестирован in situ в опухолях желудка иммуногистохимическим методом для оценки его возможной прогностической значимости. Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка использовали метод вестерн-блот анализа, проведение которого позволяет уточнить результаты, полученные при оценке генной экспрессии, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции. Определение среднего уровня PPIA в 32 парных образцах позволило выявить повышение белковой экспрессии в опухолевой ткани у 63% больных.

Проведение вестерн-блот анализа с использованием коммерческих антител к другим идентифицированным белкам не позволило обнаружить специфического связывания в экстрактах нормальных и опухолевых тканей желудка. С одной стороны, это связано с тем, что чувствительность коммерческих антител обычно не превышает 500 нг и недостаточна для детекции низкокопийных белков, с другой – почти все исследуемые нами белки являются низкокопийными, что было подтверждено при исследовании уровня их генной экспрессии по отношению к гену рефери AСTB: уровень экспрессии был в 10-100 раз меньше. Поскольку чувствительности коммерческих антител не достаточно для выявления белков в нормальной и опухолевой тканях методом вестерн-блот анализа, это подтверждает необходимость получения высокспецифичных антител, которые не только позволят провести оценку различий их синтеза в опухолевой и нормальной ткани, но и оценить их прогностическую значимость.

Хотя большинство генетических повреждений являются общими для указанных гистологических субтипов, все более очевидным становится представление о различиях ключевых генетических перестроек, определяющих формирование и прогрессию диффузного и интестинального рака желудка [62, 48].

Злокачественную трансформацию предраковых изменений при интестинальном раке желудка связывают с микросателлитной нестабильностью, мутациями гена опухолевой супресии р53, снижением экспрессии гена р27, сверхэкспрессией циклина Е и транскриптов c-met гена. Опухолевая прогрессия ассоциирована с потерей гетерозиготности 1Q региона, гена-онкосупрессора DСС, p27, снижением экспрессии рецептора к TGF-beta, амплификацией гена HER-2. Для развития диффузного типа РЖ ключевое значение имеет потеря гетерозиготности по 17p хромосоме (р53), мутации или потеря Е-кадхерина, при этом потеря р27, амплификация генов K-sam, c-met ведет к диссеминации процесса.

В последние годы появились сведения, указывающие на потенциальную диагностическую и/или прогностическую значимость некоторых секреторных белков, таких как NF2, NEK6, INHBA, CDH17, PDCD6 при раке желудка, однако необходимы дальнейшие трансляционные исследования для подтверждения их клинической значимости [10, 40].

Согласно сведениям литературы, достаточно широко для оценки прогноза клинического течения РЖ разных гистотипов используется целый ряд иммуногистохимических маркеров (Ki-67, CDX2, MUC-5, MUC-5, p53, bcl-2) однако следует отметить, что данные различных авторов не всегда согласуются между собой [63, 64, 65, 66, 67] и исследования в этом направлении остаются актуальными, также как и поиск новых прогностических маркеров для больных с разными гистотипами рака желудка.

В настоящей работе получены новые данные о снижении экспрессионной способности опухолевых клеток, преимущественно в группе с кишечным типом РЖ, по мере нарастания глубины инвазии в стенку органа в отношении Кi67, CDX2, MUC2, AKR1B10 и CypА. Новацией явилось то, что иммуногистохимически определяемые экспрессионные параметры оценивались не только по отношению к опухоли в целом, но и в клетках, образующих разные структуры паренхиматозного компонента РЖ (железистоподобные, трабекулярные, солидные, криброзные структуры и дискретные группы клеток), располагающиеся на различной глубине инвазии. Это позволяет стандартизовать параметры опухолевого роста, характеризующие прогрессию, оформлено НОУ-ХАУ.

Идентифицированы новые для европеоидной популяции белки, уровень экспрессии которых существенно различается в опухолях диффузного и интестинального типа, что свидетельствует об их патогенетическом значении в формировании опухоли того или иного типа. Впервые показаны различия в экспрессии цитокина из группы иммунофилинов PPIA в опухолях желудка интестинального и диффузного типов и выявлена связь отсутствия его белковой экспрессии в клетках опухоли с гематогенным метастазированием у больных с диффузным типом рака желудка.

Впервые получены данные о существенном снижении экспрессии гена фермента альдо-кеторедуктазы AKR1B10, вовлеченного в метаболизм ретиноевой кислоты, в опухолях желудка по сравнению с немалигнизированной тканью. Ген AKR1B10 кодирует один из членов суперсемейства альдо-кето редуктаз [68, 69].

AKR1B10 участвует в утилизации алифатических и ароматических альдегидов и метаболизме ретиноевой кислоты [70]. Понижение уровня экспрессии этого гена индуцирует пролиферацию клеток, их дифференцировку, и, по некоторым данным, апоптоз [71, 72]. Гиперэкспрессия AKR1B10 ассоциирована с курением [73] и наблюдается при раке лёгкого, в остальных же случаях, в том числе при РЖ, она обычно понижается [71, 74, 75].

Показана прогностическая значимость экспрессии белка AKR1B10 в интестинального типа.

диффузного типа, а AKR1B10 – для кишечного типа РЖ, особенно важны, исходя из того факта, что практически нет «работающих» дифференциальных критериев указанных типов РЖ.

Выше уже говорилось о низкой чувствительности имеющихся коммерческих антител, использование которых не позволяет оценивать синтез низкокопийных белков, это диктует необходимость получения высокоспецифичных антител для детекции маркеров, выявленных в настоящей работе.

В качестве альтернативы, к традиционному получению антигенов - путем экспрессии белков в гетерологичных системах, был применен комплексный подход к дизайну и синтезу пептидов-миметиков антигенных детерминант с учетом области локализации потенциальной детерминанты, и отсутствия перекрестной реактивности выбранных пептидов с иными биомолекулами. Примененный метод специфических анти-пептидных антител из сыворотки иммунизированных животных обладает рядом преимуществ, по сравнению с традиционными подходами к их созданию. Путем подбора условий конъюгации была достигнута 98% эффективность связывания пептидов-миметиков с матрицей сорбента.

показателям: рН, содержание белка, электрофоретическая однородность, молекулярные параметры, фракционный состав, специфическая активность.

Результаты тестирования приведены в Таблице 1.

Таблица 1 - Спецификация препаратов поликлональных антител, полученных в ходе выполнения проекта Содержание белка Электрофоретическая однородность Гель-фильтрация или Мономеры и димеры – не менее Мономеры и димеры- Мономеры и димеры- Мономеры и димерыМолекулярные параметры Фракционный состав Специфическая активность Электрофоретическая однородность препаратов антител – это один из ключевых показателей, позволяющих подтвердить высокое качество полученных препаратов. Произведенные препараты соответствовали предъявляемым международным научным сообществом требованиям к данному типу иммунореагентов (Рисунок 3) Рисунок 3 – Результат электрофоретического анализа конечных Примечание – разделение проводилось в пластинах 12% ДСН-ПААГ, образцы были смешаны с буфером для нанесения не содержащим редуцирующего агента (-DTT) или содержащим таковой (+DTT).

Так как препараты были сконцентрированы после аффинной хроматографии, то в ходе выполнения процесса могла происходить агрегация и образование полимерных форм IgG, что заметно на примере препарата антиAKR1B10. Для количественной оценки степени агрегации в препарате и получения дополнительных данных о качестве полученных препаратов АТ мы прибегли к гель-фильтрации на колонке XK16/90 Sepharose 4FF. Результаты оценки молекулярных параметров полученных препаратов подтвердили доминирующее присутствие мономерных (и димерных) форм молекул IgG в изучаемых препаратах (Рисунок 4).

Рисунок 4 – Молекулярно-массовое распределение в конечных Примечание– разделение проводилось с использованием хроматографической системы AKTA Explorer 100 Air, на колонке XK16/ Sepharose 4FF, при скорости потока 3,5 мл/мин.

Примененные методы физико-химического анализа полученных препаратов антител являются высокоточными и информативными, однако для обнаружения сывороточных белков-кондоминатов (обладающих сходной молекулярной массой и могущих отрицательно повлиять на специфическую активность АТ) применялся метод иммуноэлектрофореза. В качестве антисыворотки был использован препарат полиспецифических АТ козы к сывороточным белкам кролика (Рисунок 5).

Рисунок 5 – Фракционный состав конечных препаратов антител Примечание – 0- цельная сыворотка крови кролика, 1- анти-AKR1B pAb, 2- анти-INHBA pAb, 3- 1- анти-PMEPA1 pAb.

В ходе анализа полученных препаратов было установлено, что присутствующие дополнительные дуги преципитации соответствуют IgM и IgA, которые также, по-видимому, обладают сродством к интересующим нас антигенам.

Однако все выполненные нами физико-химические и иммунохимические методы анализа препаратов были бы бесцельны, если полученные АТ не взаимодействовали бы с нативными АГ в тканях. В ходе проведения иммунизации лабораторных животных проводился мониторинг динамики иммунного ответа в ИФА, однако, наиболее точное представление о специфической активности, т.е. о необходимом уровне качества связывания с иммуногистохимический анализ.

позволяющий определить гистогенез, степень пролиферативной активности и анаплазии опухолевых клеток, результаты которого могут охарактеризовать прогноз и обосновать адекватные методы лечения пациентов. Однако не следует и преувеличивать возможности данного метода при лечении конкретного пациента. ИГХ является только дополнительной методикой исследования, и ее результаты должны быть интерпретированы в контексте с другими данными обследования, включая клинические.

Все полученные нами препараты АТ были протестированы на связывание с антигеном в клиническом материале, результаты в сжатом виде приведены на Рисунке 6.

Рисунок 6 – Иммуногистохимический анализ присутствия белковмаркеров рака желудка в образцах тканей с использованием конечных Примечание – A - Диффузный тип РЖ, ув. 400х умеренно выраженная экспрессия AKR1B10, разведение АТ 1:400; B - Кишечный тип РЖ, низкая степень дифференцировки, ув. 400х, выраженная экспрессия AKR1B разведение АТ 1:400; C - Кишечный тип РЖ, высокая степень дифференцировки, ув. 400х, выраженная экспрессия INHBA, разведение АТ 1:800; D - Кишечный тип РЖ, низкая степень дифференцировки, ув. 400х, выраженная экспрессия INHBA, разведение АТ 1:800; E - Диффузный тип РЖ, ув. 400х, слабая экспрессия PMEPA1 в цитоплазме, разведение АТ 1:800.

Данный рисунок отражает лишь малую часть полученных данных ИГХ анализа тканей, но весьма наглядно и точно демонстрирует возможности полученных антител связываться с целевой молекулой-мишенью в клиническом материале.

Особое внимание в ходе выполнения проекта было уделено разработке стандартизованного метода получения тканевых экстрактов желудка для последующей иммунохимической детекции интересующих АГ в них с применением иммуноблоттинга. Этот подход нашел достойное применение в случае подтверждения полученных в ОТ-ПЦР данных по кратному повышению уровня экспрессии мРНК белка PMEPA1 в опухолевой ткани по сравнению с нормальной.

Оценку специфичности полученных поликлональных антител к PMEPA проводили с помощью детекции белка в клинических образцах методом вестерн-блот анализа. Белковые экстракты, содержащие 20 мкг белка в 10- мкл, подвергали разделению электрофорезом по методу Лэммли в 16% ДСНПААГ. Для количественной оценки тестируемых полипептидов в качестве белкового стандарта использовали АТ к -актину в разведении 1:2500 (Abcam).

После разделения белки подвергали электропереносу на мембрану Immobilon-P (Millipore), используя mini Trans-Blot transfer cell (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Мембраны обрабатывали в течение 2 часов блокирующим буфером (PBS, 1% Tween-20 и 2% обезжиренного сухого молока), затем инкубировали с антителами к белку PMEPA1 (1:1000). После трёхкратной отмывки мембран буфером PBS с 0,01% Tween-20 их инкубировали в течение часа с конъюгатами пероксидазы хрена с вторичными антителами кролика к IgG козы. После трёхкратной отмывки мембран PBS с 0,01% Tween-20, проводили хемилюминесцентную детекцию сигнала с помощью набора ECL (GE Healthcare). Результаты приведены на Рисунке 7.

Рисунок 7 – Результат определения содержания PMEPA1 и -актина в опухолях желудка и нормальных образцах эпителия с помощью Экспериментально подтвердилось, что количество белка PMEPA1 в опухоли значительно выше, по сравнению с нормальными тканями. Также нами обнаружено, то, что в образцах опухолевых лизатов присутствует форма белка, отличающаяся по электрофоретической подвижности, что может быть связано с изменением механизмов пост-трансляционных модификаций (таких как гликозилирование, фосфорилирование и т.п.) в опухолевых клетках. Данный вопрос требует дальнейшего изучения.

2. Оценка возможности создания конкурентоспособной продукции и услуг и разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР, включая предложения по коммерциализации В результате выполнения НИР получены следующие научно-технические результаты:

• Получена новая научная информация об ассоциированных с РЖ белках в популяции Российской Федерации как основа для изучения патогенеза и выявления новых маркеров диагностики и прогноза заболевания, а также терапевтических мишеней.

• Разработан комплексный подход для дизайна иммуногенных фрагментов (мимотопов и полипептидов) для белков AKR1B10, INHBA • Получены хроматографические сорбенты для аффинной очистки IgG из высокоспецифичных поликлональных сывороток крови кролика против AKR1B10, INHBA и PMEPA1;

• Получены специфические поликлональные АТ к AKR1B10 (проверены в ИГХ), к INHBA (проверены в ИГХ, а также в ИФА) и к PMEPA (проверены в ИГХ, WB, а также в ИФА).

• Полученные препараты АТ охарактеризованы по ряду параметров (содержание подлинность, специфичность).

• Разработан способ прогнозирования вероятности гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка на основе определения белка AKR1B10 в ткани опухоли с использованием оригинальных высокоспецифичных антител методом ИГХ (получено решение о выдаче патента). Собраны необходимые реагенты для создания экспериментального образца тест-системы и оформлена инструкция по ее использованию.

• Разработан способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка на основе определения белка PPIA в клетках опухоли ИГХ методом с использованием коммерческих антител. Подана заявка на изобретение.

• Подготовлен проект новой медицинской технологии.

Оформлены документы на регистрацию баз данных «База данных клинико-патологических параметров пациентов с диагнозом рак желудка» и «База данных для прогнозирования течения рака желудка по клиникопатологическим показателям». Указанные базы в перспективе будут использованы для проведения исследований по валидации выявленных в работе потенциальных диагностических и прогностических маркеров.

заболевания при раке желудка», приказ № 30-П от 16.04.2012 г. ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН. Поданы 2 заявки на изобретения: «Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка» (получено решение о выдаче патента) и «Способ прогнозирования гематогенного метастазирования при диффузном типе рака желудка»

(находится на рассмотрении в ФГБУ ФИПС РФ). Это позволяет сделать вывод о высокой значимости и перспективности практического внедрения результатов.

Конечными результатами проекта являются способы прогноза отдаленного метастазирования РЖ интестинального и диффузного типа на основе детекции AKR1B10 и PPIA, соответственно, и высоко-аффинные поликлональные антитела.

Полученные поликлональные антитела к белку AKR1B10, для которого показана взаимосвязь с отдаленным метастазированием у больных с раком желудка интестинального типа, являются основой для создания тестсистемы с целью детекции в опухолях в качестве прогностического маркера.

Способ прогноза отдаленного метастазирования опухолей желудка не имеет аналогов, так как в нем используются оригинальные высокоаффинные антитела к белку AKR1B10, которые являются основой диагностической иммуногистохимическим методом. Кроме того, используется принципиально новый подход к оценке экспрессии белка – иммуногистохимическая оценка экспрессии белка в клетках опухоли, формирующих железисто-подобные структуры, располагающиеся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка (получено решение о выдаче патента).

Создание лабораторного образца тест-системы для определения белка INHBA с помощью «сэндвич» ИФА (на основе пары высокоспецифичных антител) может стать основой для производства оригинальной системы, позволяющей оценивать уровень содержания ингибина в образцах сыворотки крови для оценки фертильности и при экстра-корпоральном оплодотворении.

В перспективе данная тест-система также может быть использована для замещения существующих на рынке импортных аналогов.

идентифицированных в работе белков, ассоциированных с разными типами РЖ в европеоидной популяции, для разработки новых критериев ранней диагностики и прогноза и возможных мишеней для фармакологического воздействия.

Применяемые в процессе выполнения проекта подходы могут быть положены в основу разработки комплексной технологии получения антител против белков, ассоциированных со злокачественными новообразованиями, для создания диагностических систем с целью ранней диагностики и прогноза заболевания. Разрабатываемый принципиальный подход «от белкамишени к антителу» может быть экстраполирован не только на онкологическую проблематику, но и на другие задачи практического здравоохранения.

разрабатываемого теста состоит в продаже неисключительной лицензии.

Основные проблемы в коммерциализации: 1) необходимость проведения двухлетнего цикла работ для определения чувствительности и специфичности теста на разных стадиях заболевания и количества ложноположительных и ложноотрицательных результатов; 2) необходимость проведения клинических испытаний, затраты на которые могут составить несколько миллионов рублей. Необходимые партнеры по реализации теста достаточно крупные инвесторы, который смогут взять на себя расходы и риски проведения клинических испытаний (например, ГК «Роснано», инвестфонд или крупная фармацевтическая компания «НПО «Микроген» МЗ РФ).

Высоко-аффинные поликлональные антитела к белкам INHBA и PMEPA1 могут быть коммерциализованы организациями, работающими в сфере науки и здравоохранения, продающие антитела и иммунологические тесты конечным потребителям. Объем рынка – несколько миллионов рублей.

По результатам выполнения проекта планируется подача патентной заявки «Высоко-аффинные поликлональные антитела к белкам INHBA и PMEPA1»

(правообладатель – НИИО РАМН). Возможной и планируемой конечной неисключительной лицензии заинтересованной компании (после получения патентной заявки).

Возможными объектами коммерциализации являются способ прогноза интестинального типа путем детекции белка AKR1B10 в клетках опухоли иммуногистохимическим методом с помощью тест-систем на основе оригинального высокоаффинного антитела; производство тест-систем для детекции белка- прогностического маркера интестинального типа рака желудка методом ИГХ. Ежегодно в мире регистрируется более миллиона случаев РЖ, в России – 50 тысяч. В связи с отсутствием государственных программ скрининга РЖ ситуация существенно не изменится. Основными потребителями способа прогнозирования отдаленного метастазирования РЖ на основе тест-системы с использованием оригинальных АТ могут быть клинико-диагностические лаборатории онкологических клиник и онкодиспансеров РФ. Ежегодно необходимо проводить не менее ста тысяч анализов. По разным оценкам объем рынка наборов для оценки прогноза в РФ составляет десятки миллионов рублей.

При клинической валидации предлагаемого прогностического маркера тестсистемы будут востребованы в онкологических клиниках, диспансерах, в которых получают лечение больные раком желудка, в количестве десятков тысяч. Выход на зарубежные сегменты рынка может быть связан с ориентацией на страны юговосточной Азии с высоким уровнем заболеваемости РЖ.

Создание способов оценки прогноза отдаленного метастазирования у больных раком желудка после радикального лечения позволит с высокой вероятностью предсказать риск прогрессирования, и на этой основе изменить периодичность мониторинга больных для раннего выявления рецидива заболевания и адекватного лечения. Подтверждение диагностической значимости INHBA позволит создать способ ранней диагностики РЖ, внедрение которого в практическое здравоохранение позволит повысить выявляемость заболевания на ранних стадиях и улучшить результаты лечения, снизить смертность.

3. Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс совершенствовании образовательного процесса ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН имеет договора о сотрудничестве в научно-исследовательской и образовательной сферах с высшими учебными заведениями г.Томска, в которых обучаются студенты по медицинскому и биологическому профилю. Сотрудничество в образовательной области осуществляется в виде привлечения сотрудников ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН к научному руководству исследовательскими работами студентов, магистрантов, аспирантов и докторантов СибГМУ и НИ ТГУ, проводимых в области онкологии и смежных специальностей. НИИ онкологии, в свою очередь, обеспечивает на базе лабораторий института прохождение производственной практики, выполнение квалификационных работ студентами и аспирантами и предоставляет рабочие места при наличии вакансий.

В рамках выполнения темы НИР на базе ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН выполнялись квалификационные студенческие и научные работы (бакалаврские, магистерские, кандидатские диссертации) студентами и аспирантами Национального Томского государственного университета и Сибирского Государственного медицинского университета. Участие студентов и молодых специалистов в выполнении НИР обеспечило эффективное освоение ими научных и методических отечественных и мировых достижений в области фундаментальной медицины, молекулярногенетических исследований в онкологии. Принято в аспирантуру 4 человека, принято на работу в ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН на постоянной основе 4 молодых специалиста. Представлены к защите 6 кандидатских диссертаций молодых сотрудников, принимавших участие в выполнении проекта (4 из них уже защищены), один из аспирантов принят преподавателем в ГБОУ ВПО СибГМУ. Представлено к защите 4 докторских диссертации ( защищены). Защиты диссертаций способствовали карьерному росту специалистов (повышение в должности, получение научных званий).

В проекте принимал участие молодой исследователь Карбышев М. С., м.н.с. лаборатории иммунологии, при его непосредственном участии был разработан оригинальный подход для дизайна пептидов-миметиков, а также получения препаратов высокоспецифичных антител в очищенном виде.

Аспирант Григорьева Е. С. непосредственно осуществляла протеомные исследования по поиску потенциальных белковых маркеров, ею выполнена и представлена к защите кандидатская диссертация. Аспирант Волкоморов В.В. провел большой цикл исследований по подтверждению стабильной дифференциальной экспрессии выявленных генов, защитил магистерскую диссертацию, выполняет кандидатскую диссертацию по тематике проекта.

Новые методические навыки, полученные исполнителями проекта – научными сотрудниками НИИ онкологии будут передаваться студентам при прохождении ими производственной практики, выполнении курсовых, дипломных, бакалаврских, магистерских работ.

приобретенный в ходе выполнения проекта и новая информация об ассоциированных с раком желудка белках в популяции Российской Федерации послужат основой для планирования квалификационных работ по диагностики и прогноза заболевания, а также терапевтических мишеней.

Подготовлены проекты методического пособия по методам выбора сиквенс-специфических последовательностей, клонирования, наработки и очистки белков, получения антител к ним, характеристики их по содержанию белка, молекулярно-массовому распределению, подлинности, специфичности, в качестве дополнительной учебной литературы Полученные студентами и молодыми специалистами знания и навыки полезны не только для выполнения указанной НИР, но имеют ключевое значение для проведения исследований в области фундаментальной и клинической медицины и в выборе профессиональной деятельности.

3.2 Подготовка образовательных программ Участниками проекта, работающими на постоянной основе на кафедре патологической анатомии СибГМУ (проф. Перельмутер В.М., проф.

Завьялова М.В., доцент Вторушин С.В., преподаватель Степанов И.В.) патологической анатомии для студентов 2-3 курсов, интернов, ординаторов, аспирантов первого года обучения ГОУ ВПО СибГМУ МЗСР, в которые включены результаты выполняемой НИР.

Национального исследовательского Томского государственного университета (Институт биологии, экологии, почвоведения, сельского и лесного хозяйства (Биологический институт) по курсу «Современные методы исследования генома и транскриптома». Программа составлена на основе требований Федерального государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования по направлению Министерства образования и науки № 100 от 04 февраля 2010 года. Общий объем курса 72 часа. Из них – лекции 8 ч., лабораторные занятия 36 ч, семинарские занятия – 0 ч, самостоятельная работа студентов – 40 ч. Зачет в 10 семестре. Общая трудоемкость курса 2 зач. ед. Цель курса: представление знаний по современным методам исследования генома и транскриптома, обучение студентов владением навыками основных методов в лабораторных условиях.

профессионального цикла М.3 учебного плана подготовки магистра по направлению подготовки 020400 «Биология». Для изучения курса необходимы знания по генетике, молекулярной биологии, биохимии и английский язык; студенты должны владеть общелабораторными методами, методами приготовления растворов и реактивов, иметь навыки работы с компьютером и интернетом, методами статистической обработки результатов. При составлении курса были использованы сведения об использованных методах и технологиях, а также результаты исследований, полученные при выполнении научно-исследовательских работ в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по Государственному контракту от 12 апреля 2010 г. № 02.740.11.0769 по теме: ИДЕНТИФИКАЦИЯ

БЕЛКОВЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ

РАКА ЖЕЛУДКА (2010-2012 гг.) исследования генома и транскриптома в физиологии» направлено на формирование у обучающихся следующих компетенций:

транскриптомики и использовать фундаментальные генетические представления в сфере профессиональной деятельности для постановки и решения новых задач (ПК-1);

– способности самостоятельно анализировать полученную информацию, выявлять фундаментальные проблемы, ставить задачи и выполнять использованием современных методов, демонстрировать ответственность за качество работ и научную достоверность результатов (ПК-3);

– способности к творчеству и системному мышлению (ОК-1);

– оперировать молекулярно-генетическими знаниями и теоретическими основами методов геномики и транскриптомики (СК-4) – владения средствами молекулярно-генетических исследований (СК-5).

В результате освоения дисциплины обучающийся должен:

• Знать: современные теоретические концепции и принципы методов, которые используются для исследования генома и транскриптома; основные лабораториях ПЦР, методики отбора биомаркеров, принципы методов: ПЦР, электрофореза, масс-спектрометрии, SAGE.

биологическими базами данных, подбирать праймеры для различных производителей и вспомогательном оборудовании, составлять дизайн экспериментов по исследованию генома и транскриптома, находить нужные последовательности ДНК и РНК в биологических базах данных, владеть методами биоинформатического поиска, производить отбор тканевых биомаркеров.

Владеть: методами выделения ДНК и РНК из различного биологического материала, методами постановки полимеразной цепной реакции в различных модификациях, в том числе ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени, методом Western-blot, секвенированием, методами горизонтального, вертикального и электрофореза, основами биоинформатики, навыками работы с биологическими программами для анализа данных.

Содержание курса включает в себя:

1.Методы выделения ДНК и РНК из различных биологических источников.

Принципы выделения ДНК и РНК, основные этапы и их назначение.

Назначение реактивов, особенности выделения ДНК и РНК из суспензий и тканей. Применяемое для выделения НК оборудование. Принципы организации работы.

2.Полимеразная Генотипирование SNP маркеров: аллель-специфическая ПЦР, ПДРФ, delПЦР, ПЦР в режиме реального времени по технологиям Sybr Green, TaqMan Amplifluor, количественная ПЦР в режиме реального времени. Кривая плавления и HRM.

3.Основы биоинформатики, работа с биологическими базами данных NCBI, HUGO, OMIM, EST, и др. Определение первичной последовательности ДНК и РНК, формат Fasta и GeneBank. Определение функций генов. Оценка копийности генов и нахождение промоторных регионов.

Протеомика in silico основана на сравнительном компьютерном анализе клонотек транскриптомов опухолей и нормальных тканей методами биоинформатики (например, с использованием транскриптомных баз данных dbEST) с последующим отбором секреторных белков и получением антител для их иммунологического тестирования (в случае поиска диагностических маркеров) или биоинформатическим отбором генов-кандидатов для прогнозирования развития опухоли.

4. Трехступенчатая методика отбора биомаркеров: 2D электорофорез большого формата на материале замороженных пар образцов нормальной ткани и опухолей. Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии для подтверждения стабильного повышения синтеза белков использование метода оценки экспрессии мРНК (ОТ-ПЦР) и Western-blot (с использованием коммерческих антител), который является «золотым стандартом». Для валидации ассоциированных белков и выяснения их локализации в клетке необходимо их тестирование in situ методом иммуногистохимии.

5.Программа Vector NTI, подбор праймеров, работа с последовательностью НК. Основные правила и принципы подбора праймеров. Требования к праймерам и зондам для SNP генотипирования. Требования к праймерам для количественной ПЦР, представление результатов ПЦР. Программы:

FlexAnalysis 2.0, TotalLab v.2.01, BioTools v.3 DNADynamo (Blue Tractor Software Ltd., Великобритания) 6.Электрофорез НК. Основные реактивы и принципы. Методика проведения горизонтального и вертикального электрофореза. Особенности электрофореза ДНК и РНК.

секвенирования коротких участков кДНК-ярлыков (tags) с последующим выявлением ярлыков индивидуальных генов методами компьютерного анализа. Основы секвенирования, microarray и других молекулярнобиологических методов. Принципы, основные этапы и их назначение.

Реакция терминации и капиллярный электрофорез. Необходимые реактивы и оборудование. Возможности секвенирования и microarray.

4. Написание проекта новой медицинской технологии.

Название предлагаемой новой медицинской технологии «Способ прогнозирования вероятности гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка». Технология подготовлена сотрудниками ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН и ГБОУ ВПО СибГМУ МЗСР РФ. Ниже представлен текст проекта технологии.

В основу метода прогнозирования вероятности гематогенного метастазирования при кишечном типе рака желудка при инвазии не менее чем до мышечного слоя стенки органа положена иммуногистохимическая оценка процента экспрессии протеина AKR1B10 (альдо-кето редуктаза I B семейства) в клетках рака желудка кишечного типа, формирующих железистоподобные структуры, располагающиеся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка, с последующим подсчетом коэффициента регрессии с помощью метода множественной регрессии из пакета программ Statistica 6,0 for Windows. На основании расчета значений коэффициентов регрессии интерпретируется результат прогноза (высокий/низкий риск). Применение медицинской технологии позволяет с высокой степенью вероятности прогнозировать риск развития гематогенных метастазов, что способствует оптимизации назначения адъювантной терапии.

Медицинская технология предназначена для врачей-патологоанатомов и онкологов.

Рекомендуемый уровень использования: лечебно-профилактические учреждения онкологического профиля.

Организации-разработчики: ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России.

Авторы медтехнологии: д-р мед. наук, профессор Перельмутер В.М., д-р мед. наук, доцент Завьялова М.В., Степанов И.В., канд. мед. наук Вторушин С.В., д-р биол. наук, профессор Чердынцева Н.В., канд. биол. наук Литвяков Н.В., д-р мед. наук Афанасьев С.Г., канд. мед. наук Августинович А.В., Григорьева Е.С., Савенкова О.В., д-р биол. наук, профессор Берестень С.Ф.

ВВЕДЕНИЕ

Рак желудка является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований и характеризуется высокими показателями летальности [1, 2, 3]. Одним из принципов гистологической классификации рака желудка является деление опухолей на кишечный и диффузный типы [4]. Данные типы рака желудка имеют существенные отличия по ряду клинических, морфологических и экспрессионных параметров. Рак желудка диффузного типа чаще возникает у молодых пациентов, склонен к более агрессивному течению и более частому метастазированию [5]. При раке желудка кишечного типа чаще, чем при раке диффузного типа, отмечается экспрессия белка опухолевой супрессии р53, одного из ключевых регуляторов процессов репарации ДНК и апоптоза, выше экспрессия маркера пролиферации Ki-67, [6, 7, 8, 9]. В связи со значимыми различиями в характеристике диффузного и кишечного типов рака желудка возникает необходимость в дифференцированном подходе к изучению обсуждаемых гистотипов опухоли. В настоящее время актуальным является поиск новых прогностических маркеров при раке желудка. С этой точки зрения перспективным является изучение AKR1B10 – НАД(Ф)зависимой оксидоредуктазы, участвующей в метаболическом пути ретиноевой кислоты, играющей важную роль в регуляции клеточной дифференцировки и осуществляющей рост-супрессивные эффекты в трансформированных клетках [10]. В наших предыдущих исследованиях при проведении 2D протеомного анализа и биоинформатического поиска были выявлены 2 гена, кодирующие потенциальные белковые маркеры рака желудка: циклофилин А и AKR1B10. При этом впервые были получены сведения о дифференциальной экспрессии указанных генов в злокачественных новообразованиях желудка и нормальной слизистой при использовании парных образцов ткани одного и того же пациента, у больных раком желудка в российской популяции [1].

иммуногистохимическая оценка процента экспрессии протеина AKR1B (альдо-кето редуктаза I B10 семейства) в клетках рака желудка кишечного типа, формирующих железистоподобные структуры, располагающиеся в слизистом, подслизистом, мышечном и серозном слоях стенки желудка, с последующим подсчетом коэффициента регрессии с помощью метода множественной регрессии из пакета программ Statistica 6,0 for Windows.

Клинико-морфологические критерии разделения на прогностические группы получены после оперативного лечения, гистологического и иммуногистохимического исследования операционного материала.

Преимуществом разработанной медицинской технологии является использование доступных результатов анализа гистологических препаратов опухоли, окрашенных гематоксилином и эозином, а также результатов оценки экспрессии опухолевыми клетками рецепторов к AKR1B10.

ПОКАЗАНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НОВОЙ МЕДИЦИНСКОЙ

ТЕХНОЛОГИИ

1. Кишечный тип рака желудка T3-4N0-3M0.

2. Поражение минимум трех слоев стенки желудка (слизистого, подслизистого, мышечного).

ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ МЕДИЦИНСКОЙ

ТЕХНОЛОГИИ

Абсолютные:

1. Диффузный, смешанный или неопределенный типы рака желудка.

2. Поражение менее чем трех слоев стенки органа.

Относительные: нет

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ

ТЕХНОЛОГИИ

1. Медицинское оборудование для гистологической лаборатории (регистрационное удостоверение ФС №2006/997, производитель SLEE Medical GmbH, Германия).

2. Микроскоп биологический (лабораторный) (регистрационное удостоверение ФС № 2005/314, производитель Leica Microsystems Wetzlab GmbH, ФРГ).

3. Высокоаффинные моноклональные антитела, полученные в институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН (НОУ-ХАУ, Протокол № 02.445.11.7354-4 от 25 марта 2008 г.). Чувствительность антител в дот-блоте составила 100 пкг, в Вестерн-блоте – 100 пкг.

Рабочее разведение антител 1 : 300.

4. Дозаторы пипеточные автоклавируемые с фиксированными и производитель ЗАО «Термо Электрон», Россия).

5. Реагенты для иммуногистохимических исследований (регистрационное удостоверение ФСЗ № 2007/00210, производитель Daco Denmark A/S,

ОПИСАНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ

Последовательность выполнения медицинской технологии:

Подготовка гистологических препаратов для исследования Морфологическому исследованию подвергается операционный материал.

Взятые образцы тканей помещаются в нейтральный формалин. Материал проводится по стандартной методике и заливается в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашиваются гематоксилином и эозином. Оценивается состояние ткани макроскопически выявляющейся опухоли и все удаленные лимфатические узлы.

Оценка морфологического строения опухоли при раке желудка Диагноз рака желудка устанавливается согласно классификации Laurn P.



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«Мультиварка RMC-M150 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ www.multivarka.pro УВАЖАЕМЫЙ ПОКУПАТЕЛЬ! Благодарим вас за то, что вы отдали предпочтение бытовой технике REDMOND. REDMOND — это качество, надежность и неизменно внимательное отношение к потребностям наших клиентов. Надеемся, что вам понравится продукция нашей компании, и вы также будете выбирать наши изделия в будущем. Мультиварка REDMOND RMC-M150 — современный много- Чтобы вы могли быстрее освоить технику приготовления в функциональный прибор...»

«Серия ЕстЕствЕнныЕ науки № 1 (5) Издается с 2008 года Выходит 2 раза в год Москва 2010 Scientific Journal natural ScienceS № 1 (5) Published since 2008 Appears Twice a Year Moscow 2010 редакционный совет: Рябов В.В. ректор МГПУ, доктор исторических наук, профессор Председатель Атанасян С.Л. проректор по учебной работе МГПУ, кандидат физико-математических наук, профессор Геворкян Е.Н. проректор по научной работе МГПУ, доктор экономических наук, профессор Русецкая М.Н. проректор по инновационной...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ Декан факультета прикладной информатики, профессор С.А. Курносов 26. 06. 2011 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины: Нечеткая математика и логика для специальности 230201.65 Информационные системы и технологии Факультет Прикладной информатики Ведущая кафедра системного анализа и обработки информации...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА Информационная безопасность дисциплины: для специальности 080801.65 - Прикладная информатика Факультет Прикладной информатики Ведущая кафедра Компьютерных технологий и систем Дневная форма обучения Вид учебной работы Всего часов Курс, семестр Лекции 4 курс, 9 семестр Практические...»

«1. Реут Д.В. Кентавр в интерьере. Кентавр. Методологический и игротехнический альманах, М.: 1991, N 1, с. 2 2. Реут Д.В. К микроанализу мегамашин. Кентавр, 1993, N 2, с. 47-51, 009EUT.ZIP from www.circle.ru 3. Реут Д.В. Ad marginem metodologia. Кентавр, 1995, N 2, с. 41-50. 4. Реут Д.В. Буриданово человечество. Международный конгресс Фундаментальные основы экологии и духовного здоровья человека. 27 сентября – 4 октября 1995 г. Алушта. Крым. Украина. Тезисы докладов. Часть 2, М.: 1996, с. 21 5....»

«Министерство образования и наук и РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Томский государственный педагогический университет Научная библиотека Библиографический информационный центр Физика. Математика. Информатика рекомендательный список литературы Томск 2012 Оглавление От составителя Математика Методика преподавания математики Физика Методика преподавания физики Информатика Методика преподавания информатики 2 От составителя...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ, МЕХАНИКИ И ОПТИКИ Факультет Информационных технологий и программирования Направление Прикладная математика и информатика Специализация : Математическое и программное обеспечение вычислительных машин Академическая степень магистр математики Кафедра Компьютерных технологий Группа 6538 МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ на тему Автоматный подход к реализации элементов графического...»

«УДК 621.37 МАХМАНОВ ОРИФ КУДРАТОВИЧ Алгоритмические и программные средства цифровой обработки изображений на основе вейвлет-функций Специальность: 5А330204– Информационные системы диссертация на соискание академической степени магистра Научный руководитель : к.т.н., доцент Хамдамов У. Р. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СВЯЗИ,...»

«Государственное научное учреждение Институт философии Национальной академии наук Беларуси УДК 1(430)(091)+930.1+141.339.8+101.1:316 ПОЗНЯКОВА Ольга Леонидовна ФИЛОСОФИЯ ИСТОРИИ И. КАНТА: АНТРОПОЛОГИЧЕСКИЕ И СОЦИАЛЬНО-ПОЛИТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата философских наук по специальности 09.00.03 – история философии Минск, 2014 Работа выполнена в Белорусском государственном университете. Научный руководитель – Румянцева Татьяна Герардовна, доктор...»

«Мультимедиа в образовании: контекст информатизации А. В. Осин Мультимедиа в образовании: контекст информатизации © © Осин А.В., 2003 Мультимедиа в образовании: контекст информатизации Оглавление От автора Глава 1. Образовательные электронные издания и ресурсы 1.1. Образование и компьютер 1.2. Издания и ресурсы 1.3. Новые педагогические инструменты 1.4. Компоненты мультимедиа 1.5. Уровень интерактивности 1.6. ЭИР и педагогические технологии 1.7. ЭИР и книга Глава 2. Концепция развития...»

«УДК 546.212: 541.123.11 Низкочастотные движения молекулярного сгустка-12 в картофельном амилопектине в процессе созревания клубня. Влияние белых шумов К. В. Зубов б, А. В. Зубов а, В. А. Зубов б* а Институт Информатики, факультет Компьютерной Науки, университет им. Гумбольда, Д-12489 Берлин,Рудовершоссе 25, дом III, 3-ий коридор, дом Ёохана фон Ноймана, Тел.: 004930 20933181, zubow@informatik.hu-berlin.de б Компания A IST H&C, Отд. НИР, PF 520253, D-12592 Берлин, EС-Германия, тел.: 004930...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования АМУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (ФГБОУ ВПО АмГУ) УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Введение в специальность основной образовательной программы по специальности 230102.65 Автоматизированные системы обработки информации и управления Благовещенск 2012 УМКД разработан к.т.н., доцентом Д.Г. Шевко Рассмотрен и рекомендован на заседании...»

«Областной институт усовершенствования учителей ОО Педагогическая ассоциация ЕАО РФ Лидеры образования ЕАО - 2007 Мастер-класс победителя ПНПО - 2007 для учителей информатики г. Биробиджан, 2007 год -1Лидеры образования ЕАО - 2007. Мастер-класс победителя ПНПО – 2007 для учителей информатики. – Биробиджан: ОблИУУ, 2007, 24 с. Сборник рекомендован к печати и практическому применению в ОУ Еврейской автономной области решением редакционно-издательского совета областного ИУУ от 27.09.2007 года....»

«Министерство образования и наук и России Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Российская Академия Наук Научно методический совет по информатике при Министерстве образования и науки России Совещание Актуальные проблемы информатики в современном российском образовании Москва, июнь 2004 г. 2 Ответственные редакторы: Председатель НМС по информатике, академик РАН Ю.И. Журавлев, ученый секретарь НМС по информатике доцент В.В. Тихомиров 1-ое Всероссийское совещание НМС по...»

«Раздел 3 ПРОБЛЕМЫ ИСТОРИОГРАФИИ И ИСТОЧНИКОВЕДЕНИЯ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ И ВСЕМИРНОЙ ИСТОРИИ А. С. Козлов К ВОПРОСУ ОБ АВТОРСТВЕ И ДАТИРОВКЕ ORIGO CONSTANTINI IMPERATORIS Уникальное по своей информативности позднеантичное анонимное жизнеописание императора Константина I, представляющее из себя первую часть так называемого Анонима Валезия и впервые опубликованное Анри де Валуа в 1636 г. в Париже (вместе с Деяниями Аммиана Марцеллина), с самого начала оказалось загадкой для исследователей, в том числе в...»

«Т.М. Журавлева, Г.И. Анжина, Т.В. Зубович, Л.И. Алексеева АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ СТАТИСТИЧЕСКИЙ МЕТОД ПРОГНОЗА АНОМАЛИИ ТЕМПЕРАТУРЫ ВОЗДУХА НА ЗИМНИЕ МЕСЯЦЫ ПО СТАНЦИЯМ О. САХАЛИН С БОЛЬШОЙ ЗАБЛАГОВРЕМЕННОСТЬЮ Введение Для создания новых и совершенствования существующих методов долгосрочного прогнозирования элементов погоды требуется дальнейшее познание закономерностей развития взаимосвязанных между собой процессов, происходящих в системе атмосфера–гидросфера–литосфера. Найти в большом многообразии...»

«Заведующий кафедрой Информатики и компьютерных технологий Украинской инженерно-педагогической академии, доктор технических наук, профессор АШЕРОВ АКИВА ТОВИЕВИЧ Министерство образования и науки Украины Украинская инженерно-педагогическая академия АКИВА ТОВИЕВИЧ АШЕРОВ К 70-летию со дня рождения БИОБИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ Харьков УИПА, 2008 ББК 74.580.42я1 А 98 Составители: Ерёмина Е. И., Онуфриева Е. Н., Рыбальченко Е. Н., Сажко Г. И. Ответственный редактор Н. Н. Николаенко Акива Товиевич...»

«1 Введение Учебные и производственные практики являются одной из основных форм учебного процесса и направлены на формирование специалистов высшей квалификации. Практика позволяет закрепить теоретические знания, ознакомиться с производственно-хозяйственной деятельностью предприятия, приобрести навыки организаторской работы в производственном коллективе. В данных методических указаниях приводится определенная система действий по организации и проведению практики студентов факультета экономики и...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра общей математики и информатики УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ СОВРЕМЕННЫЕ ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В СОЦИАЛЬНЫХ НАУКАХ Основной образовательной программы по направлению подготовки 040100.62 – Социология Благовещенск 2012 УМКД разработан доцентом, канд. пед. наук Чалкиной Натальей...»

«2 СОДЕРЖАНИЕ 1. ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ 1.1. Цель государственного экзамена 1.2. Процедура проведения государственного экзамена 2. СОДЕРЖАНИЕ ПРОГРАММЫ ГОСУДАРСТВЕННОГО ЭКЗАМЕНА. 7 2.1. Вопросы к государственному экзамену 2.2. Образец экзаменационного билета 3. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ 3 1. ОРГАНИЗАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ 1.1. Цель государственного экзамена Государственный экзамен по специальности 080801.65 Прикладная информатика в...»














 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.