WWW.KNIGA.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА - Книги, пособия, учебники, издания, публикации

 


Pages:   || 2 |

«Реферат Отчет 26 с., 1 ч., 1 рис., 4 табл., 91 источник. РАК ЖЕЛУДКА, ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРОТЕОМНЫЕ МАРКЕРЫ, 2D ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ. ...»

-- [ Страница 1 ] --

Реферат

Отчет 26 с., 1 ч., 1 рис., 4 табл., 91 источник.

РАК ЖЕЛУДКА, ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРОТЕОМНЫЕ

МАРКЕРЫ, 2D ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, БИОИНФОРМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ.

Объектом исследования являются протеомные маркеры злокачественных опухолей

желудка диффузного и интестинального типов.

Идентификация наиболее информативных Цель выполнения НИР.

протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга рака желудка (РЖ) интестинального и диффузного типа; создание высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Цель работы 1 этапа — идентификация потенциальных протеомных маркеров рака желудка на основе анализа научно-технической литературы, мировых баз данных и проведения 2D протеомного анализа образцов опухолей и нормальной ткани от больных.

В процессе работы проводились экспериментальные исследования по поиску белков, интенсивность синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто повышается в опухолях желудка обоих типов по сравнению с нормой с использованием 2D протеомного анализа и биоинформатического поиска по мировым базам данных dbEST, SAGE и Oncomine. Протеомные исследования были проведены с использованием 2D электорофореза большого формата на материале замороженных пар образцов нормальной ткани и опухолей слизистой желудка.

Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицированы масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

Результаты, полученные при проведении 1 этапа работы: 1.Научнотехнический отчет. Обоснование выбора направления исследований и способов решения задач. Перечень потенциальных протеомных диагностических и прогностических маркеров рака желудка. Отчет о патентных исследованиях по ГОСТ База данных биологического клинического материала.

15.011-96.

Компьютерный регистр биологического клинического материала. Достигнуты заявленные значения программных индикаторов и показателей по подготовке и закреплении в сфере науки молодых научных кадров.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………….............. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ.…… ……………………........……..…………



1 Анализ научно-технической литературы и нормативно-технической документации ……………….……………….………….………..………………... 1.1 Характеристика клинико-морфологических особенностей различных гистологических типов карцином желудка …………..………..……. 1.2 Молекулярно-генетические аспекты рака желудка…………………….……. 1.3 Критерии прогноза при раке желудка.……………….…………………….... 2 Выбор и обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач. ………….……………….………….…………… 2.1 Диагностические и прогностические маркеры опухолей желудка:

принципы их идентификации.……………….……………….………….……...... 2.2 Транскриптомные методы идентификации маркеров.…………..…….……. 2.3 Протеомные методы идентификации маркеров …….…………….……….... 2.4 Обоснование принятого направления исследований………………………. 2.5 Обоснование способов решения задач исследования……………………... 3 Идентификация потенциальных диагностических и прогностических маркеров рака желудка методами биоинформатики.………….… …….……… 4 Проведение 2-D протеомного анализа, выявление белковых пятен с высокой экспрессией, идентификация белков масс-спектрометрией.………………….... 4.1 Экстракция белков и 2D анализ экстрактов.……………….……….….……. 4.2 Идентификация белковых пятен.……………….……………….………….... 4.3. Выбор белков, синтез которых повышен в опухолях, методом 2D электрофореза.……………….……………….………….………………………... 4.4 Сравнение результатов двумерного электрофореза и биоинформационного поиска.…………….……………….………….………………………………….... 5 Создание банка образцов биопсийного и операционного материала, крови больных и образцов крови здоровых лиц с клинико-морфологической характеристикой. ……….……………….………….…………………………….. 6 Создание компьютерного регистра клинического биологического материала.……………….……………….………….…………………………….. 7 Выполнение показателей программного мероприятия Программы в рамках данной работы …………………………………………………………. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.…………………….……………….………….……………….. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.………..……….…………..

ВВЕДЕНИЕ

Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности на планете, составляя более 25% случаев всех смертей в развитых странах. Рак желудка (РЖ) являлся основной причиной смертности от раковых заболеваний на протяжении всего ХХ в. и остается одним из лидеров по показателям смертности среди больных со злокачественными новообразованиями во всем мире. В наши дни ежегодно в мире регистрируется более миллиона новых случаев заболевания РЖ, более 50 тысяч которых диагностируется в РФ. Пятилетний уровень выживания при раке желудка варьирует от 5% до 15%, повторное возникновение опухоли отмечается у 80% пациентов. В течение первого года после постановки диагноза 56% больных умирают, что объясняется отсутствием выраженной симптоматики на ранних стадиях заболевания и высокой запущенностью в связи с этим, а также отсутствием достаточно чувствительных методов молекулярной диагностики [1]. Известно, что ранняя первичная диагностика любых типов злокачественных опухолей и точное прогнозирование их развития существенно повышают вероятность эффективного лечения раковых заболеваний. Однако для большинства наиболее распространённых видов опухолей не идентифицированы достаточно информативные диагностические и прогностические белковые маркеры опухолей, вследствие высокой вариативности механизмов канцерогенеза и трудоёмкости методов идентификации опухолевых маркеров. В настоящее время в клинической практике ограниченно применяется лишь несколько тестов по диагностике и прогнозированию течения рака желудка.





Часть из них основана на определении поверхностных белковых маркеров опухолевых клеток (например, CA 19.9 и DR70), однако такие тесты имеют низкую специфичность и селективность. Один тест позволяет идентифицировать метастатические клетки в перитонеальной жидкости с использованием ПЦР на поздних стадиях заболевания [2]. Большинство опухолей желудка относится к карциномам и подразделяется на два основных гистологических подтипа:

интестинальные и диффузные опухоли [3]. Эти подтипы характеризуются разным молекулярным патогенезом и различаются по агрессивности клинического течения и, соответственно, прогнозу. Однако результаты исследований, проводимых различными авторами, с целью выявления маркеров ранней диагностики и прогноза, часто являются противоречивыми, а информативность предлагаемых маркеров низка, при этом практически нет «работающих» дифференциальных критериев указанных типов РЖ. Данные международной патентной базы США (http://www.uspto.gov) показывают, что за последние 10 лет заявлено всего несколько патентов по диагностике РЖ на основе идентификации новых молекулярных маркеров, однако в клинической практике запатентованные инновации не применяются, вследствие их низкой эффективности.

Актуальность предлагаемого проекта обусловлена немногочисленностью и неоднозначностью имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии рака желудка различных гистологических типов, отсутствием внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания.

Главные цели проекта: Идентификация наиболее информативных протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Достижение заявленных целей потребует решения следующих задач.

Идентификации потенциальных протеомных маркеров рака желудка различных гистологических типов на основе модификации метода сравнительного анализа протеомов.

2. Поиск и идентификация белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка.

3. Отбор диагностических и прогностических маркеров рака желудка. Оценка эффективности детекции маркеров в собранной коллекции пар образцов (нормаопухоль) и сывороток крови онкопациентов и здоровых доноров.

4. Создание и тестирование наборов для ранней диагностики, прогнозирования течения заболевания и послеоперационного мониторинга больных с опухолями желудка с использованием разработанных нами высокочувствительных методов иммуно-анализа.

В настоящей работе используются методы сравнительной протеомики, открывающие возможность идентификации белковых онкомаркеров, уровень синтеза которых наиболее заметно и наиболее часто различается в опухолях и нормальных тканях. Этот подход основан на фракционировании белков нормальных и опухолевых тканей, идентификации белков с заметно изменённым уровнем экспрессии в опухолях с использованием масс-спектрометрии и последующем отборе секреторных белков по имеющимся базам данных.

На первом этапе выполнения работы по Госконтракту № 02.740.11.0769. от «12» апреля 2010 г. осуществлена идентификация потенциальных протеомных маркеров рака желудка на основе анализа научно-технической литературы, мировых баз данных и проведения 2D протеомного анализа образцов опухолей и нормальной ткани от больных. Проведён сравнительный анализ протеомов опухолей желудка интестинального и диффузного типа и нормальных тканей с использованием разработанной нами модификации метода двумерного гель-электрофореза [4], а также осуществлено сравнение эффективности поиска белковых маркеров РЖ методами 2D анализа и биоинформационного поиска в транскриптомной базе данных Oncomine.

Полученные данные служат основанием для проведения следующего этапа работы по подтверждению стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка методами оценки генной экспрессии (ОТ-ПЦР), Вестернблоттинга в замороженных образцах ткани и иммуногистохимии на срезах тканей из парафиновых блоков. Обнаружение белков с избирательно повышенным уровнем синтеза в интестинальном или диффузном типах опухолей откроет возможность создания тест-систем для дифференциальной диагностики РЖ.

Прогностический потенциал идентифицированных в работе маркеров будет оценен в коллекциях опухолей желудка интестинального и диффузного типа, различающихся по агрессивности злокачественного процесса, на следующих этапах НИР. На основе идентифицированных белковых молекул, ассоциированных с раком желудка, должна быть создана тест-система для прогнозирования течения заболевания, с учетом различных гистологических типов опухоли.

В данном проекте интегрирован целый ряд инноваций для решения поставленных проблем, включающий увеличение чувствительности и специфичности методов поиска маркеров опухолей, получение высокоаффинных антител для увеличения чувствительности и специфичности детекции маркеров в биологических образцах, что свидетельствует о высокой перспективности запланированной НИР. Современный методический уровень исследований с использованием высокотехнологичных методов протеомного и транскриптомного (2D-электрофорез, биоинформатический анализ, клонирование белков, продукция высокоаффинных антител) подтверждает высокий уровень разработки.

Известно, что злокачественный фенотип формируется в результате изменения экспрессии патогенетически значимых белков, поэтому выявление ассоциированных с раком желудка белков, для которых установлены выраженные количественные изменения, их идентификация в опухолевых клетках, с учетом внутриклеточной локализации и взаимодействий друг с другом, позволит получить новые знания о процессах регуляции на разных этапах злокачественной трансформации и опухолевой прогрессии. При этом возможно как выявление новых протеиновых молекул, вовлеченных в канцерогенез желудка, так и получение новых сведений о функциональной значимости известных белков.

Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли, при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров, прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.

Полученные новые сведения будут включены в образовательные программы постдипломного образования ординаторов и аспирантов, выполняющих квалификационные работы по онкологии, патофизиологии, биохимии, иммунологии, программы научно-практических семинаров и конференций для молодых ученых и специалистов практического здравоохранения региона Сибири и Дальнего Востока.

В число исполнителей настоящего проекта включены студенты и аспиранты Томского Государственного Университета, Сибирского Государственного Медицинского Университета, которые выполняют квалификационные работы по онкологической тематике на базе НИИ онкологии. В каждый последующий год будут привлечены дополнительно один или более студентов для выполнения бакалаврских или магистерских диссертаций (или дипломных работ), которые в настоящее время проходят практику, осваивают методики или выполняют фрагменты научно-поисковых работ на базе экспериментальных лабораторий института.

Привлечение студентов, аспирантов и молодых специалистов для выполнения работ по направлению НИР обеспечит подготовку квалифицированных кадров для выполнения исследований в области фундаментальной медицины, поможет в выборе рода их дальнейшей профессиональной деятельности.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 Анализ научно-технической литературы и нормативно-технической документации злокачественных новообразований. Ежегодно в мире регистрируется около 800 тыс.

новых случаев и 628 тыс. смертей от этой патологии. Наиболее высокая заболеваемость РЖ наблюдается в Японии, России, Чили, Корее, Китае, Коста-Рике, Филиппинах [5]. В структуре онкологической заболеваемости РЖ устойчиво занимает 2-е ранговое место у мужчин и 3-е у женщин [6]. В России в 2008 г. было зарегистрировано более 132 тыс. больных РЖ. При этом ежегодно диагностируется около 45–49 тысяч первичных случаев РЖ. В последние десятилетия в России отмечается снижение заболеваемости РЖ, однако показатель летальности увеличивается, за год умирает около 43 тысяч человек [7]. Самая высокая выживаемость при РЖ в мире зарегистрирована в Японии – 53 %, тогда как в других странах – не более 15–20 % [8]. Таким успехам в улучшении выживаемости Япония обязана массовому скринингу населения и принятым национальным программам по борьбе с раком, в этой стране доля раннего рака в общей структуре больных РЖ наивысшая и составляет более половины всех случаев, тогда как в большинстве государств мира этот показатель не превышает 20 % [9].

1.1 Характеристика клинико-морфологических особенностей различных гистологических типов карцином желудка При целенаправленном эндоскопическом скрининге населения ранний рак желудка обнаруживается в среднем на 10 лет раньше, чем местно-распространенные опухоли. К сожалению, скрининговые мероприятия в России, подобные опыту Японии, в государственном масштабе практически не проводятся. Рутинные методы обследования больных РЖ практически не позволяют распознать заболевание на ранних стадиях [8, 10]. Это делает актуальным поиск чувствительных и специфичных методов диагностики, базирующихся на выявлении вовлеченных в Мультифакториальная природа РЖ, как и большинства злокачественных новообразований, обеспечивает высокую гетерогенность его клиникоморфологических проявлений, что существенно затрудняет оценку прогноза заболевания, а, следовательно, выбор тактики лечения. В основе такой гетерогенности лежат молекулярно-биологические различия опухолей, позволяющие дискриминировать гистотипы и подтипы заболевания внутри гистотипов, выявляя группы со схожими опухолевыми фенотипами и поведением.

Существует несколько гистологических классификаций РЖ, из них наиболее часто используются классификация японского общества гастроэнтерологической гастроэнтерологической эндоскопии с 1963 г. постоянно усовершенствует свою классификацию рака желудка, в которой уделяет особое значение так называемому раннему раку желудка (РРЖ). Этот термин был введен для обозначения поверхностных опухолей желудка небольшого размера, к РРЖ относят опухоли, ограниченные слизистой оболочкой и подслизистым слоем, независимо от наличия или отсутствия метастазов в регионарные лимфоузлы [10, 11]. P.A. Lauren в 1965 г.

выделил кишечный, диффузный и смешанный гистологические типы рака желудка, предположив зависимость агрессивности опухоли от её гистотипа [12].

Кишечный и диффузный типы РЖ имеют связь с хелибактерной инфекцией, этиологическая роль которой в злокачественном перерождении слизистой желудка сегодня не подлежит сомнению. У большинства пациентов с кишечным типом РЖ, перенесших гастрэктомию, в неизмененной слизистой желудка обнаруживалась H.

pylori [13]. При диффузном типе H. pylori выявляется гораздо реже, однако это не позволяет полностью исключить её роль в процессе канцерогенеза этого гистологического типа РЖ [14]. Результаты серологических исследований также доказывают связь инфицирования H. pylori с обоими гистологическими подтипами РЖ.

Результаты исследований, проведенных в Японии и Великобритании, свидетельствуют о том, что среди пациентов моложе 40 лет 45–55 % всех случаев рака желудка ассоциированы с инфицированием H. pylori (HP). Вне опухолевой ткани у 89 % пациентов с раком желудка кишечного типа обнаруживалась НР, при диффузном типе РЖ – в 32 % случаев. Необходимо отметить, что имеются варианты рака желудка, не ассоциированные с H. pylori. К ним можно отнести карциному проксимального отдела желудка и РЖ, характеризующийся диффузной атрофией фундальной слизистой оболочки, ассоциированной с пернициозной анемией [15].

Не исключено, что в этиологии РЖ играет роль специфический штамм H.

pylori. Следует отметить, что значительную роль в возникновении гипохлоргидрии, обусловленной НР-инфекцией, и РЖ играет повышенное образование провоспалительного цитокина IL-1, который обладает способностью ингибировать желудочную секрецию и моторику, причем эта способность различна у разных индивидуумов вследствие кластерного полиморфизма гена IL-1. Нельзя исключить также определенную роль IL-6, IL-8 и фактора некроза опухоли-альфа (TNF-), продукция которых стимулируется H. pylori, в возникновении гипохлоргидрии.

Генетические факторы, влияющие на уровень экспрессии IL-1, лежат в основе того факта, что рак желудка развивается далеко не у всех больных гастритом, ассоциированным с хеликобактерной инфекцией [16].

Кишечный тип рака желудка во многом связан с кишечной метаплазией, сутью которой представляется замещение дифференцированного желудочного эпителия кишечным и изменение клеточного фенотипа слизистой оболочки желудка, что является исходом длительно существующего хронического воспаления [17, 18, 19].

При хроническом гастрите обнаруживаются дисрегенераторные изменения, которые, в свою очередь, провоцируют ускоренное перемещение клеток из генеративной зоны без полноценной дифференцировки в зоны расположения зрелых высокодифференцированных эпителиоцитов. В результате, желудочные железы становятся функционально неполноценными. Таким образом, в метаплазированных железах происходит реорганизация эпителия со смещением зоны пролиферативного компартмента от перешейка желез к основанию и модификация стромальных клеток собственной пластинки слизистой, окружающих измененные железы, по кишечному типу [20].

Принято различать три различных типа кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка [21, 22]. Полная кишечная метаплазия – I тип, для неё характерно наличие клеток Панета, абсорбирующих клеток и бокаловидных клеток с сиаломуцинами. Для неполной кишечной метаплазии свойственны бокаловидные клетки и столбчатые мукоциты, в которых гистохимически выявляется сиаломуцин (II тип кишечной метаплазии), или сульфомуцин (III тип). II, а в особенности III тип неполной кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка ассоциирован с высоким риском возникновения рака желудка кишечного типа [22, 23].

1.2 Молекулярно-генетические аспекты рака желудка Трансформация клеток в раковые и опухолевая прогрессия связаны с накоплением изменений в геноме, возникающих в результате нарушения нормального его функционирования под действием наследуемых мутаций и влияния канцерогенных факторов. Трансформированные клетки получают возможность выживать в организме за счет изменения сигнальных путей, обеспечивающих приобретение: независимых или автономных сигналов к росту; нечувствительности неограниченного потенциала к пролиферации; способности поддерживать ангиогенез; способности к инвазии и метастазированию [24]. Молекулярные изменения, ответственные за приобретение вышеуказанных свойств, могут использоваться в качестве онкомаркеров. Исследования механизмов канцерогенеза потенциальных молекулярных маркеров, пригодных для ранней диагностики и/или прогнозирования течения заболевания.

Около 5–10 % больных имеют отягощенный семейный анамнез по раку желудка, а именно генетическую предрасположенность к развитию различных типов (кишечный, диффузный) этого заболевания. Молекулярно-генетические факторы, лежащие в основе развития рака желудка кишечного и диффузного типа, различны.

Хотя большинство аденокарцином желудка встречается спорадически, небольшая их часть возникает в рамках явной наследственной предрасположенности к развитию рака желудка. Это дало основание выделить синдром наследственного рака желудка диффузного типа, а так же синдром наследственного неполипозного рака толстой кишки (СННРТК), которые вызываются мутациями в одном из генов, участвующих в репарации ДНК (MLH1, MSH2, MSH6, PMS1, PMS2). Эти синдромы характеризуются предрасположенностью к раку толстой кишки, желудка и ряду других раков, таких как рак эндометрия, яичника, тонкой кишки, поджелудочной железы, уроэпителиальных раков и мозга. Форма нестабильности генома, названная микросателлитной неустойчивостью генома (MSI) характерна для всех опухолей, которые возникают совместно с синдромом наследственного неполипозного рака толстой кишки. РЖ возникает в 11 % при этом синдроме и встречается в семействах с MLH1 MSH2, или MSH6 мутациями. Большая часть РЖ в рамках СННРТК (79 %) представлена кишечным типом. Синдром наследственного диффузного РЖ характеризуется аутосомно-доминантным типом наследования и возникает благодаря мутациям в CDH1 (Е-кадхерин) и имеет связь с повышенным риском развития рака молочной железы, преимущественно долькового типа (40 %) и рака толстой кишки. Пенетрантность гена составляет 70%, то есть носители имеют 70 % риск развития рака желудка. На результатах скрининга пробандов из 42 семейств с диффузным раком желудка, было выделено ряд признаков, позволяющих диагностировать синдром наследственного диффузного рака желудка. К ним относятся наличие двух и более документированных случаев диффузного рака желудка среди родственников первой/второй степени родства, из которых, по меньшей мере, один диагностирован в возрасте до 50 лет, также трех и более документированных случаев диффузного рака желудка среди родственников первой/второй степени родства независимо от возраста [25].

Возникновение семейных и спорадических случаев рака желудка – это результат генетических и эпигенетических нарушений в ключевых онкогенах и онкосупрессорных генах, контролирующих клеточный гомеостаз, приводящих к злокачественной трансформации нормальных клеток слизистой оболочки желудка.

Молекулярные события, происходящие при формировании как интестинального, так и диффузного типов РЖ включают в себя мутации в гене-супрессоре р53, потерю гетерозиготности, генетическую нестабильность и ряд других общих генетических изменений. В раках желудка обоих гистологических типов, показан целый ряд нарушений генов опухолевых супрессоров, таких как CDKN2A, GSTP1, APC, MGMT, и MLH1, DAPK,THBS-1, RUNX3, и т.д., которые могут считаться потенциальными молекулярными маркерами, тем более, что некоторые нарушения этих генов могут выявляться уже на ранних стадиях желудочного онкогенеза [26, 27].

Для интестинального типа РЖ показаны также мутации в гене APC, повышенная экспрессия онкогена бета-катенина, инактивация гастроспецифического pS2 гена, гиперметилирование супрессорного гена RAR. При диффузной карциноме наблюдается потеря гетерозиготности в 17 хромосоме, инактивация RUNX3, мутация или потеря E-кадгерина, экспрессия hTERT с активацией теломеразы. Мутации онкогенов при раке желудка включают в себя точечные мутации, как в случае с KRAS2 и генные амплификации, которые обнаруживаются в локусе, кодирующем рецептор к эпидермальному фактору роста HER2 [28]. Процессы амплификации ведут к увеличению числа копий и повышенной экспрессии трех генов в локусе 17q21, а именно, HER2/NEU, TOP2A, и DARPP32 в первичных раках желудка. Хотя все эти гены имеют определенную связь, уровни их экспрессии, как правило, независимы друг от друга, что позволило предположить наличие других важных механизмов транскрипции, регулирующих их экспрессию. Наличие различных генетических дефектов в опухолевой ткани кишечного и диффузного типов рака желудка подтвердилось в ряде исследований.

Так, повышенная экспрессия HER2/NEU наблюдалась только в кишечных типах опухолей, тогда как экспрессия TOP2A была повышенной также и при диффузном типе. Напротив, амплификация и повышение экспрессии DARPP32 фиксировались в обоих гистологические подтипах, и при всех стадиях опухолевого процесса [29].

Изменение гена из семейства рецепторов фактора роста фибробластов FGFR2/KSAM обнаруживалось при диффузных типах рака желудка примерно в что послужило дифференциально-диагностическим признаком, %случаев, позволяющим исключать кишечный фенотип опухоли [28].

Белок p53 является фактором транскрипции, который регулирует клеточный цикл, апоптоз, ответ на стрессорные воздействия, в том числе генотоксические (ДНК-повреждающие) и целый ряд других важных клеточных процессов, обеспечивая стабильность генома [30]. В карциномах желудка соматические мутации в гене онкосупрессоре р53 являются наиболее общими генетическими изменениями и обнаруживаются у 60 % больных [31]. Однако данные о встречаемости их в опухолях интестинального и диффузного типов неоднозначны.

Для недифференцированных опухолей (диффузный тип) отмечена низкая частота мутирования независимо от стадии, в то время как в дифференцированных (кишечный тип) ген р53 часто мутирован, и частота мутаций не имеет стадийных различий [26, 28, 32, 33]. Независимо от гистологического варианта на поздних стадиях опухолевого процесса не менее 40 % новообразований содержат соматические мутации, в частности, в опухолях обоих гистотипов обнаружены мутации в кодоне 249, который является «горячей точкой» («хот спот») мутационных изменений в гене р53 при разных новообразованиях при экспозиции с экзомутагенами, что подтверждает существенную роль канцерогенных воздействий в патогенезе РЖ обоих типов [34].

Мутации приводят либо к потере функции белка р53 как онкосупрессора, либо к приобретению им онкогенных свойств (так называемые «gain of function»

мутации). Опухолевые клетки с такими мутациями часто более автономны и агрессивны, менее восприимчивы к стрессорным стимулам и терапевтическому воздействию, чем опухоли, в которых р53 либо полностью инактивирован, либо его синтез заблокирован за счет мутаций со «сдвигом рамки считывания» (делеции или вставки) [31].

Молекулярное объяснение различий в морфологии и поведении кишечного и диффузного типов рака желудка может быть, по крайней мере, частично, приписано различиям в экспрессии Е-кадхерина в этих типах рака. Е-кадхерин, известный так же как CDH1 – это кальций-зависимый фактор адгезии, относящийся к классу поверхностных клеточных белков, которые организуют межклеточные связи и поддерживают структуру эпителиальных тканей. Изменения или инактивация CDH встречаются при злокачественных новообразованиях различных локализаций, включая раки молочной железы, щитовидной железы, простаты, толстой кишки и желудка. В начале 1990-х гг. были выявлены соматические мутации CDH1 в 40–83 % спорадических случаев рака желудка диффузного типа, при отсутствии таковых у лиц со спорадическими случаями рака желудка кишечного типа [35, 36]. Мутации Е-кадхерина в экзонах 8 или 9 вызывают рассеянный рост опухоли, снижение количества межклеточных связей и повышают подвижность опухолевых клеток при диффузном типе рака желудка. Мутации в генах бета- и гамма-катенина, которые функционально связаны с Е-кадгерином, по-видимому, также играют роль в развитии и прогрессии скирроподобного и диффузного типа рака желудка [37].

инактивации гена, встречаются при наследственных и спорадических случаях рака желудка и присутствуют приблизительно в 50 % наследственных диффузных раках желудка и 83 % спорадических случаев [35]. Таким образом, выявление нарушений гена CDH1 можно расценивать как фактор риска для развития диффузного типа РЖ.

В опухолях смешанного типа мутации и отсутствие экспрессии E-cadherin отмечаются только в диффузном компоненте опухоли, что дает основание делать выводы о том, что потеря экспрессии E-cadherin – это вероятное генетическое основание для разграничения диффузного типа опухоли от кишечного.

CDX2 (Caudal type homeobox transcription factor 2) – это транскрипционный фактор, имеющий отношение к кишечному органогенезу. CDX1 вовлечен в процесс пролиферации, а CDX2 – в дифференцировку эпителия в кишечнике, поджелудочной железе и желчных путях. CDX2 взаимодействует с генами опухолевой супрессии APC и E-cadherin, а так же с bcl-2. Показано, что CDX выступает в роли фактора транскрипции многих кишечных генов, в частности MUC2, MUC5AC, MUC6. CDX2 и MUC2 обнаруживались в 80 % случаев в ткани с признаками кишечной метаплазии и в раках желудка. CDX2 и MUC2 играют важную роль в дифференцировке как нормальной, так и патологически измененной ткани желудка. Потеря CDX2 может быть сигналом прогрессии опухоли в случаях раннего РЖ и рака с кишечным фенотипом. Снижение экспрессии CDX2 при полной кишечной метаплазии, при желудочной дисплазии и раке желудка позволило предположить, что CDX2 играет антиканцерогенную роль [38]. В кишечнике (от двенадцатиперстной кишки до прямой кишки) CDX2 экспрессируется в ядрах эпителиоцитов и обнаруживается во всех типах эпителиальных клеток, однако не выявлялся образцах нормальной слизистой оболочки желудка. В поджелудочной железе и желчных путях белок CDX2 встречается в эпителиоцитах протоков, в желудке и пищеводе только в случае кишечной метаплазии или при интестинальном РЖ [39].

Циклины D-типа достигают максимальных уровней экспрессии и формируют функциональные комплексы с CDK4 (Cyclin-dependent kinase 4) во время середины G1 фазы митоза. Поэтому биологическая роль D3-циклина двояка, он участвует в клеточной пролиферации, а так же играет роль в дифференцировке. В раках желудка повышенную экспрессию циклина D1 связывают с кишечным фенотипом опухоли в одних исследованиях, с неизмененной тканью в других исследованиях ис диффузным типом рака желудка и низкой дифференцировкой в третьем случае [40].

Известно, что злокачественный фенотип опухоли, ответственный за ее возникновение и прогрессию, определяется, в конечном счете, качественным и количественным изменением профиля белковых молекул, вовлеченных в канцерогенез. Предполагается, что могут быть выявлены белки, избирательно высоко экспрессированные в разных типах РЖ (интестинальном или диффузном), что даст возможность разработать тест-системы для дифференциальной ранней диагностики РЖ и прогноза клинического течения этих типов опухолей. В последние 10 лет были предприняты многочисленные попытки сравнительного транскриптомного анализа опухолей различной локализации (по оценке экспрессии мРНК с использованием технологии ДНК-микроаррей, генных чипов), однако было обнаружено отсутствие четкой корреляции между экспрессией мРНК и канцерогенезом, поскольку часто наблюдаются существенные различия между синтезом мРНК и белка, которые кодируются одним и тем же геном. В этой связи количественные и качественные изменения посттрансляционно модифицированных протеинов, как конечного продукта, рассматриваются как более информативные, по сравнению с мРНК, для изучения молекулярных событий в процессе канцерогенеза.

Для идентификации опухолевых маркеров широко применяются протеомные методы сравнительного анализа белковых профилей нормальных и опухолевых тканей [41, 42]. Такой подход позволяет идентифицировать белковые маркеры, ассоциированные с опухолевой трансформацией. Для разработки потенциальных молекулярных маркеров с диагностической целью необходимо выявление белков, содержание которых существенно повышено в опухоли и биологических жидкостях (сыворотка крови), что позволило бы осуществлять их детекцию на ранних этапах опухолевого процесса.

озлокачествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях. В целом картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ [43, 44]. В мире практически нет данных о протеомном профиле интестинальных и диффузных опухолей, единичные работы посвящены характеристике качественных и количественных различий белковых молекул в ткани опухоли по сравнению с нормальной тканью, для аденокарциномы желудка вообще, при этом большинство из них касаются РЖ у пациентов азиатской, но не европеоидной популяции. Нами проведен сравнительный протеомный анализ опухолевой и нормальной ткани желудка для идентификации белков, синтез которых значительно повышен в опухоли по сравнению с нормой. Для увеличения предварительная экстракция растворимой фракции белков, для удаления мажорных структурных белков [4]. В ходе сравнительного анализа белковых профилей опухолевой и нормальной тканей с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии выявлено увеличение синтеза 15 белков, для ряда из них показана разная экспрессия в диффузном и кишечном типах РЖ, что делает перспективными дальнейшие исследования для оценки их диагностической и прогностической значимости [45].

1.3 Критерии прогноза при раке желудка Для прогнозирования клинического течения РЖ широко используются гистологических параметров прогноза при раке желудка наибольшее значение придают делению опухолей на кишечный и диффузный типы рака, последний считается более агрессивным и имеет худший прогноз. Однако следует отметить, что течение заболевания в пределах одного гистологического типа также существенно варьирует у разных индивидуумов, что требует поиска информативных маркеров, позволяющих прогнозировать клиническое течение заболевания [9].

Имеются сведения о зависимости лимфогенного метастазирования от размера новообразования при раке желудка [46]. Риск метастатического поражения перигастральных лимфоузлов существенно возрастает при размере опухолевого узла более 4 см. Локализация опухоли не рассматривается как фактор, влияющий на частоту возникновения регионарных метастазов на путях лимфооттока, однако вовлечение в опухолевый процесс пищевода явилось важным критерием, повышающим риск лимфогенного метастазирования [47]. Получены данные о том, дифференцировки опухоли, лимфатическая и венозная инвазия ассоциированы с увеличением количества пораженных метастазами лимфоузлов. Мультицентричный характер роста опухоли и тип рака желудка по классификации Lauren не оказывали влияния на частоту лимфогенного метастазирования [48].

микроциркуляторного русла в опухоли напрямую влияет на вероятность гематогенного метастазирования. Активация неоангиогенеза связана с рядом факторов, среди которых особая роль принадлежит эндотелиальному сосудистому фактору роста – VEGF, который, активируя коллагеназу и урокиназу, приводит к лизису матрикса эндотелия. В результате данного каскада реакций повышается способность эндотелиальных клеток к миграции. Клетки опухоли также способны к метастазирования. Было установлено, что у пациентов с VEGF-положительными раками желудка обнаруживается большее количество новообразованных микроциркуляторных сосудов. В результате прогноз у больных раком желудка с VEGF-негативным статусом был значительно лучше, чем у пациентов с VEGFположительной экспрессией. Распространенность гематогенных метастазов увеличивалась с повышением количества новообразованных сосудов, экспрессирующих маркер эндотелиальных клеток CD34, что дает основание считать оценку васкуляризации опухоли ценным инструментом для идентификации пациентов с высоким риском развития гематогенных метастазов. Однако необходимо сказать, что используемые в онкологической практике клинико-морфологические критерии прогнозирования РЖ далеко не всегда способны адекватно оценить вероятность лимфогенного и гематогенного метастазирования, что указывает на высокую актуальность поиска и оценки информативности молекулярнобиологических критериев, выявленных на основе исследования ассоциации патогенетически значимых для РЖ молекулярных факторов с клиническими проявлениями опухолевой прогрессии. Молекулярные онкомаркеры по своей биологической природе и методам выявления можно разделить на несколько типов:

генетические (мутации, изменение копийности генов, экспрессии и профиля мРНК), эпигенетические (изменение профиля метилирования ДНК), протеомные (изменение уровня и профиля белковой экспрессии), метаболомные (изменение уровня и спектра низкомолекулярных метаболитов), изменения профиля и уровня микроРНК [24].

иммуногистохимические методики количественного и качественного определения экспрессии ассоциированных с опухолевыми клетками белков, которые определяют опухолевый фенотип и в той или иной мере ответственны за поведение опухоли, а, следовательно, являются потенциальными онкомаркерами. Известно, что пролиферативная активность опухолевых клеток во многом определяет опухолевую прогрессию. Ki-67 и PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), два самых часто используемых маркера клеточной пролиферации, являются ядерными антигенами и связаны со всеми фазами клеточного цикла, кроме G0. В середине фазы G1 митоза начинается синтез белка Ki-67, постепенно нарастая, его уровень достигает максимума в метафазе, затем резко снижаясь в анафазе. Уровень ядерного антигена клеточной пролиферации PCNA увеличивается в ядре, достигая максимального уровня во время фазы S (перед началом синтеза ДНК). Традиционный подсчет митотической активности не отражает пролиферативный потенциал опухоли, так как собственно митоз занимает несколько часов, а подготовка к нему – около часов. Изучение негистонового протеина Ki-67, экспрессирующегося во всех клетках, вышедших из G0 и ранней G1 фазы митоза, позволяет определить именно «скрытый» пролиферативный потенциал опухоли.

В ряде исследований было показано, что повышение уровня экспрессии Ki- и PCNA коррелирует с наличием метастазов в лимфатических узлах. В РЖ кишечного типа экспрессия Ki-67 обнаруживалась чаще, чем при диффузных формах. Однако эти исследования не выявили какой-либо корреляции между пролиферативной активностью, глубиной инвазии, поражением лимфатических узлов и степенью дифференцировки опухоли. Для РЖ с положительной экспрессией PCNA характерны такие клинические признаки как старший возраст заболевших раком желудка, мужской пол, большой размер опухоли, высокодифференцированная гистологическая структура. В кишечном типе рака желудка экспрессия PCNA обнаруживалась чаще, чем при диффузном типе [49]. Установлено, что у больных раком желудка с глубиной инвазии опухоли в мышечный слой и глубже уровень PCNA был значительно выше, чем у больных с инвазией в пределах слизистой оболочки желудка или до подслизистой основы. Уровень экспрессии PCNA возрастал с увеличением гистологической стадии рака желудка и в опухолях с наличием метастазов в лимфатических узлах [50]. Эти результаты дают основание полагать, что высокие уровни экспрессии Ki-67 и PCNA можно связывать не только с гистологическим типом рака желудка по Lauren, но и со степенью злокачественности рака желудка, вовлечением лимфатических узлов и степенью дифференцировки опухоли.

Определение экспрессии белков CDX1 и CDX2 в опухолях желудка иммуногистохимическим методом началось сравнительно недавно. Экспрессия CDX2 прогрессивно снижалась в ряду состояний кишечная метаплазия, дисплазия и РЖ [52]. CDX2 продемонстрировал высокую чувствительность и специфичность для аденокарцином желудка кишечного типа [52]. Многофакторный анализ общей демонстрировали более высокую продолжительность жизни, чем CDX2-негативные пациенты. Экспрессия CDH17 (Cadherin-17) – печеночно-кишечного кадхерина также регулируется геном CDX2. Исследования показали, что экспрессия CDH обнаруживалась не только при кишечной метаплазии слизистой оболочки желудка, но и при раке желудка кишечного типа. Прогноз пациентов с положительной экспрессией CDH17 был неблагоприятным по сравнению с прогнозом у пациентов с отрицательным CDH17 статусом. В большинстве случаев с положительной экспрессией CDX2 также выявлялась и экспрессия CDH17, что свидетельствует о связи этих маркеров с ранним раком желудка кишечного типа и неблагоприятным прогнозом [53].

Ряд исследователей выявили, что экспрессия фермента циклооксигеназы COXзначительно коррелировала с глубиной инвазии опухоли, но не было обнаружено никакой связи между уровнем COX-2 экспрессии и выживаемостью [55, 56].

Экспрессия COX-2 выявлялась у больных, как с кишечным, так и с диффузным типом рака желудка, однако ряд авторов выявляли иммунореактивность COX- только при кишечном типе рака желудка [54]. Таким образом, экспрессия COX- является одним из общих свойств различных подтипов рака желудка, что дает основание предполагать наличие связи COX-2 с ранними этапами желудочного канцерогенеза. Поскольку было обнаружено повышение уровня COX-2 мРНК, у пациентов не только с раком желудка, но и с тяжелой дисплазией, его выявление у больных с предраковыми изменениями слизистой может служить инструментом ранней диагностики РЖ.

Несмотря на большое число исследований роли гена онкосупрессора ТР при РЖ, его прогностическая значимость все еще остается спорной. Поскольку мутантный белок p53 часто более устойчив, чем его дикий тип, считают, что иммуногистохимическая положительная реакция на р53 обусловлена детекцией исключительно мутантного типа p53. В p53 позитивных раках желудка отмечена не только высокая активность апоптоза, но также и активность пролиферации, оцененная с помощью Ki-67. В ряде исследований показано, что экспрессия p значительно коррелировала с глубиной инвазии опухоли, но не было выявлено связи между экспрессией p53 и выживаемостью [55]. Хотя есть предположения об отношении между экспрессией p53 и худшим прогнозом, остается до конца неясным, является ли p53 независимым прогностическим фактором. Старший возраст, мужской пол, больший размер опухоли и высокодифференцированная гистологическая структура опухоли положительно коррелируют с экспрессией p53.

При этом, положительная экспрессия p53 более характерна для кишечного типа рака желудка, чем для диффузного [49].

Одним из потенциально важных маркеров, вовлеченных в процессы клеточной пролиферации, дифференцировки и контроля метастазирования при раке желудка, является белок nm23 (non-metastatic cells protein) [49]. Экспрессия nm23 связана с высокодифференцированной гистологической структурой. Согласно классификации Lauren, кишечный тип рака желудка чаще давал положительную nm23 экспрессию, чем диффузный тип. Также экспрессия nm23 положительно коррелировала с обнаружением p53 [55].

Белок HER-2/neu принимает непосредственное участие в пролиферации и росте нормальных клеток посредством рецепции EGF (Epidermal Growth Factor).

Амплификация или экспрессия гена HER-2/neu встречается при раке молочной железы, опухолях легких, желудочно-кишечного тракта, женской половой системы и других новообразованиях и связана с неблагоприятным прогнозом течения этих заболеваний. Выявлена высокая корреляция между экспрессией HERneu и кишечным гистологическим типом рака желудка, при этом усиление экспрессии HER2/neu связано с низкой выживаемостью больных [56]. Однако в целом не получено убедительных доказательств связи экспрессии белкового продукта c-erbB-2 с гистологическим типом рака желудка, глубиной инвазии, размером опухоли или метастазами в лимфатические узлы.

Раковые клетки желудка экспрессируют множество факторов роста и цитокинов, которые осуществляют свои эффекты через аутокринные, паракринные и юкстакринные механизмы. Экспрессия этих факторов и медиаторов зависит от гистологического подтипа рака желудка. Эпидермальный фактор роста (EGF) объединяет в себе семейство факторов, к которым относят EGF, TGF-, IGF и bFGF, они, как правило, продуцируются раком желудка кишечного типа, в диффузном типе рака преобладает продукция трансформирующего фактора роста бета (TGF-).

Показано, что TGF-1 увеличивает метастатический и инвазивный потенциал опухолевых клеток, стимулируя эпителиально-мезенхимальный переход, приводящий к приобретению ими способности проникать через базальную мембрану, увеличению адгезивной и локомоторной активности. Поэтому блокировка TGF- или его сигнальных путей может препятствовать вступлению клеток опухоли в процесс метастазирования. Мутации молекул клеточной адгезии, таких как E-cadherin, как уже упоминалось, избирательно обнаруживаются в 50 % рака желудка диффузного типа. Е-кадхерин связывается с актином цитоскелета через ряд белков катенинов. Поэтому, изменения уровней экспрессии Е-кадхерина прямо влияет на клеточную адгезию и играет важную роль в развитии рака [57].

Молекула CD44 – поверхностный клеточный гликопротеин, играющий важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Это рецептор гиалуроновой кислоты, а также некоторых других лигандов, таких как остеопонтин, коллаген и металлопротеиназы матрикса. Аномальная транскрипция CD44 часто связана с раком желудка и его метастазированием. Патологическая транскрипция CD44 в интроне 9 характерна для всех типов рака желудка, подобные изменения обнаруживаются в большинстве образцов с кишечной метаплазией слизистой оболочки желудка и полностью отсутствуют в неизмененной слизистой.

Остеопонтин (OPN) – белковый лиганд CD44, он повышенно продуцируется в 73 % случаев РЖ. При анализе его ко-экспрессии с CD44v9 была обнаружена положительная корреляция с инвазивностью и лимфогенным метастазированием.

Таким образом, на настоящее время существует множество прогностических факторов при раке желудка. Однако их трактовка для оценки риска прогрессирования заболевания в большинстве случаев не однозначна, что требует как продолжения независимых исследований для валидации уже имеющихся маркеров, так и поиска новых биологических маркеров на основе современных технологий молекулярно-генетического анализа.

2 Выбор и обоснование принятого направления исследований и способов решения поставленных задач 2.1 Диагностические и прогностические маркеры опухолей желудка:

принципы их идентификации Успех лечения онкологических больных в значительной степени определяется возможностью ранней диагностики заболевания. Поэтому на протяжении десятилетий значительные усилия были направлены на обнаружение онкомаркеров, специфичных для клеток, находящихся в стадии перехода от доброкачественного к злокачественному состоянию [58]. Важную роль в определении оптимального курса лечения играют и прогностические маркеры, позволяющие предсказать ход развития заболевания и определить вероятный ответ опухоли на терапевтические воздействия.

В последние два десятилетия был разработан целый ряд принципиально новых технологий для серийного поиска маркеров различных видов рака, основанных на сравнительном анализе транскриптома или протеома нормальных и опухолевых тканей. Оценка средней величины изменения уровня синтеза идентифицированных генов-кандидатов и частоты этих изменений в больших коллекциях образцов открывает возможность создания новых диагностических и прогностических тестов раковых заболеваний.

Поиск диагностических и прогностических маркеров рака желудка (РЖ) с использованием новых технологий пока не привёл к заметным результатам, однако успехи их применения для других типов опухолей позволяют надеяться на то, что в будущем будут обнаружены достаточно информативные маркеры и для диагностики и прогнозирования РЖ. В настоящее время, в клинической практике применяется только один диагностический тест рака желудка, основанный на ПЦР детекции микрометастазирования в перитонеальной жидкости [2]. Хотя этот тест включен в программу здравоохранения правительства Японии, тест может применяться лишь на очень поздних стадиях заболевания, когда терапевтическое воздействие практически неэффективно. В тоже время, прогностические тесты РЖ пока совсем не разработаны. За неимением лучшего, широкое применение получили два клинических теста РЖ, основанные на: 1) количественном определении уровня пепсиногена в крови (используется в Японии); 2) присутствии в кровотоке антител против патогенной бактерии Helicobacter pylori, поражающей клеточный эпителий, используемый для массового скрининга в Бельгии (в настоящее время разработан неинвазийный тест, анализирующий состав выдоха пациента). Последние два теста не применимы для диагностирования рака желудка, поскольку они лишь позволяют выявить пациентов с повышеным риском возникновения опухоли [59]. Кроме того, специфичность этих тестов весьма низка (в зависимости от страны 40%-80% населения дают позитивный ответ).

Наконец, существует несколько диагностических тестов рака желудка, основанных на определении поверхностных маркеров опухолевых клеток (например, белков CA 19.9 и DR70) методами иммуно-анализа. Эти тесты (хотя и распространяемые на коммерческой основе) используются весьма редко из-за их низкой селективности (дают позитивный ответ для многих видов рака) и специфичности (большое количество псевдоположительных и псевдоотрицательных результатов). Таким образом, в настоящее время не существует эффективных диагностических и прогностических маркеров опухолей желудка.

Для поиска потенциальных диагностических онкомаркеров обычно проводится идентификация генных транскриптов или белков, преимущественно синтезируемых в опухолях определённого типа, но не в нормальных тканях.

Последующий отбор белков секретируемых опухолями в кровоток открывает возможность сывороточной диагностики раковых заболеваний методами иммуноанализа. Поиск прогностических маркеров опухолей основан на сравнении транскриптома или протеома различных подтипов опухолей, поражающих один и тот же орган. Наиболее часто проводится сравнение опухолей разной степени агрессивности, например, опухолей метастазирующих в другие органы в течение короткого времени после операции и опухолей которые не обнаруживаются в течение нескольких лет после операции стандартными методами послеоперационного мониторинга [60]. Также могут сравниваться подтипы опухолей со стабильным или нестабильным геномом, различные гистологические подтипы опухолей (например, интестинальные и диффузные подтипы опухолей желудка), доброкачественные и злокачественные опухоли, опухоли по-разному отвечающие на действие терапевтических препаратов и т.п. В результате, удаётся идентифицировать набор генов, анализ уровня экспрессии которых в биопсийном или хирургическом материале с использованием микрочип анализа или иммуногистохимических методов позволяет хотя бы грубо предсказать течение заболевания и определить оптимальный метод лечения.

2.2 Транскриптомные методы идентификации маркеров В настоящее время эти методы используется наиболее часто. Их можно подразделить на четыре категории: 1) Методы, основанные на сравнении результатов гибридизации тотальной кДНК нормальных и опухолевых тканей (или их подтипов), последовательности, комплементарные большей части генов человека (16-20 тыс.

генов). Методы микрочип анализа весьма технологичны, однако основная сложность их использования состоит в том, что разница в концентрациях гибридизуемых на микрочип кДНК составляет от нескольких транскриптов на клетку до 5 тыс.

Поэтому экспрессия большей части низкокопийных генов не может быть достоверно оценена, так как не отличается от «фона» (порог чувствительности данного метода составляет около 100 транскриптов на клетку, т.е. лишь около 40-60% общего клеточного транскриптома). Кроме того, этот тип анализа осложняется наличием большого количества семейств гомологичных генов перекрёстно гибридизующихся друг с другом [61].

2) Методы, основанные на сравнении результатов прямого секвенирования десятков тысяч кДНК из образцов опухолей (или их подтипов) и нормальных тканей. Дальнейший отбор проб проводится с использованием методов биоинформатики (анализ баз данных GeneNote, GeneCards, SAGE, Oncomine).

Использование данной технологии для анализа опухолей в настоящее время довольно малопродуктивно вследствие явно недостаточного количества секвенированных клонов (несколько сотен тыс.). Это связано с тем, что подавляющая часть изменений экспрессии генов в опухолях является следствием многочисленных случайных нарушений в регуляции транскрипции, и лишь очень непосредственно влияющих на процесс злокачественной трансформации, происходит в опухолях достаточно часто. Расчеты показывают, что надежная, статистически достоверная идентификация набора информативных диагностических и прогностических маркеров нормальных тканей и опухолей (или их подтипов) потребует секвенирования нескольких миллионов клонов в 5-10 парах сравниваемых образцов для каждого типа опухоли.

выявлением ярлыков индивидуальных генов методами компьютерного анализа.

идентификации лишь нескольких новых маркеров опухолей, которые прошли все стадии подтверждения информативности [62].

4) Недавно разработанный метод, основанный на глобальном анализе экспрессии микро-РНК, определяющих уровень дифференцировки клеток [63].

Эволюция раковых клеток основана на элиминации негативного контроля клеточной пролиферации, клеточного цикла, репарации и т.д. в результате дедифференцировки и возврата к «эмбриональному» (плюрипотентному) состоянию. Важную роль в этом процессе играют микроРНК, подавляющие экспрессию многочисленных генов на уровне трансляции. Экспрессия каждой микроРНК (в настоящее время в геноме посттранскрипционному ингибированию синтеза продуктов целого ряда генов (в среднем около четырёхсот на одну микроРНК), при этом гены, регулируемые различными микроРНК, частично перекрываются. По различным оценкам, микроРНК регулируют экспрессию как минимум одной трети генома человека (около 10 тыс. генов), а возможно и более. Показано, что ингибирование синтеза микроРНК в опухолевых клетках (подавляющих экспрессию ряда мРНК-мишеней) приводит к активации онкогенов, тогда как активация синтеза микроРНК позволяет блокировать экспрессию генов, супрессирующих развитие опухоли.

Результаты применения этого подхода для анализа процесса злокачественной широкомасштабный анализ подавления экспрессии микроРНК в образцах костного мозга пациентов с острой лимфобластоидной лейкемией (ALL) позволил четко выявить три их основных молекулярных подкласса: образцы с Филадельфийской хромосомой t(9;22), образцы с TEL/AML транслокацией t(12;21) или другими перестройками гена MLL и образцы, не содержащие вышеуказанные хромосомные перестройки.

В последние годы был идентифицирован целый ряд микроРНК, анализ уровня синтеза которых позволяет прогнозировать развитие опухолей различного типа, оценить вероятность их метастазирования и повторного роста после операции, а также определить эффективность терапевтического воздействия. Данный подход пока не применялся для идентификации маркеров рака желудка. Основной его трудностью является отсутствие надёжных алгоритмов отбора мРНК-мишеней, тогда как анализ уровня экспрессии самих микроРНК весьма осложняется наличием большого количества родственных молекул, последовательности которых могут различаться всего на один нуклеотид.

2.3 Протеомные методы идентификации маркеров Существует три основных подхода к идентификации диагностических и прогностических маркеров опухолей на основе сравнительного анализа протеомов:

1) Протеомика in silico основана на сравнительном компьютерном анализе клонотек транскриптомов опухолей и нормальных тканей (полученных как описано выше) методами биоинформатики (например, с использованием транскриптомных баз данных dbEST) с последующим отбором секреторных белков и получением антител для их иммунологического тестирования (в случае поиска диагностических маркеров) или биоинформатическим отбором генов-кандидатов, изменения уровня синтеза которых (по данным компьютерного анализа сигнальных путей) могут служить основой для прогнозирования развития опухоли. Наличие громадного избытка белков, изменение уровня синтеза которых непосредственно не связано с канцерогенезом, делает идентификацию информативных диагностических и прогностических протеомных маркеров опухолей крайне трудоемкой.

Дополнительная сложность состоит в том, что надежная идентификация секреторных белков методами биоинформатики (необходимая для идентификации диагностических маркеров) возможна лишь в 50% случаев.

2) Второй подход (протеомика in vivo) основан на фракционировании тканевых протеомов в норме и патологии, идентификации белков с пониженным или повышенным уровнем экспрессии с использованием масс-спектрометрических подходов и последующем отборе потенциальных онкомаркеров методами биоинформатики. Для фракционирования тканевых протеомов наиболее часто используются: 1) двумерный гель-электрофорез (методы 2DE и DIGE); 2) анионообменная хроматография в капиллярах для разделения белков по заряду, а также хроматография в обратной фазе для разделения по гидрофобности (метод MudPIT); 3) селективная иммобилизация белков образца на белковые микрочипы с гидрофобной, гидрофильной или заряженной поверхностью (метод SELDI-TOFMS). Первый метод используется наиболее часто, однако весьма трудоёмок и имеет низкую чувствительность (детектируется лишь 1-3 тыс. наиболее высококопийных белков). Два последних метода, строго говоря, не являются количественными. На этом основании они подвергались критике, как непригодные для сравнительной протеомики (в одной из рецензий SELDI-TOF-MS даже сравнивался с «гаданием на кофейной гуще»). Тем не менее, использование дополнительных технических усовершенствований (например, «изобарической» изотопной метки) позволяет заметно улучшить достоверность количественного сравнения интенсивности пиков в масс-спектрах сравниваемых образцов при использовании MudPIT и SELDI-TOFMS, хотя чувствительность этих подходов пока оставляет желать лучшего.

Вследствие целого ряда нерешенных технических проблем использование этих технологий пока не привело к обнаружению достаточно информативных маркеров ни одного типа опухоли.

3) Третий подход (обратная протеомика: методы SEREX, Proteomex и AMIDA) используется для поиска диагностических онкомаркеров. Подход основан на идентификации антигенов, способных связываться с аутоиммунными антителами, присутствующими в сыворотках крови пациентов, но не в крови здоровых доноров.

Однако, анализ базы данных Института рака им. Людвига, содержащей несколько тысяч потенциальных диагностических белковых маркеров опухолей различного типа (http://www2.licr.org/CancerImmunimeDB), полученных с использованием данного подхода показывает, что подавляющее большинство антигенов не являются секреторными белками, а экспериментальное подтверждение их присутствия в сыворотках приводит к отрицательному результату или не проводилось вообще.

2.4 Обоснование принятого направления исследований Таким образом, представленные выше данные свидетельствуют, что в настоящее время практически нет информативных методов молекулярной диагностики РЖ на ранних стадиях и прогноза развития заболевания, которые бы удовлетворяли потребностям клинической практики. Немногочисленность и неоднозначность имеющихся в мировой литературе сведений о молекулярных механизмах формирования и прогрессии рака желудка интестинального и диффузного типов, отсутствие внедренных в клиническую практику информативных маркеров ранней диагностики и прогноза течения заболевания обусловливают актуальность выполнения настоящего проекта.

Для поиска потенциальных белковых маркеров опухолей широко используются подходы, основанные на сравнительном анализе протеома и транскриптома нормальных и опухолевых тканей (потенциальные транскриптомные маркеры затем анализируются на белковом уровне). Протеомные методы позволяют сравнивать профили экспрессии белков после их разделения двумерным гель-электрофорезом, выявлять белковые пятна с наиболее заметными и наиболее частыми различиями в уровне синтеза в сравниваемых парах образцов и идентифицировать белки пятен с помощью масс-спектроскопии [89]. Последующий отбор секреторных белков проводится по имеющимся базам данных.

В нашей работе предполагается применение методов сравнительной протеомики, которые дают возможность идентификации потенциальных белковых онкомаркеров, ассоциированных с определенными злокачественными опухолями, в частности, с раком желудка. Большинство протеомных исследований выполняется с использованием тотальных экстрактов тканей, содержащих огромное количество структурных и мембранных белков, что затрудняет выявление растворимых протеинов, концентрация которых на порядки ниже. В предлагаемом проекте использовалась модифицированная методика получения белковых экстрактов путем устранения мажорной фракции структурных белков, что повышает чувствительность обнаружения белков, которые могут секретироваться опухолями в кровоток. Используется 2D электорофорез большого формата на материале замороженных пар образцов нормальной ткани и опухолей слизистой желудка.

Белковые пятна с повышенным уровнем экспрессии в опухоли идентифицируются масс-спектрометрически (MALDI-TOF/TOF).

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных на данном этапе белков в опухолях желудка будет использован метод оценки экспрессии мРНК (ОТ-ПЦР) и Вестерн-блоттинга (с использованием коммерческих антител), который является «золотым стандартом» исследований в данной области, поскольку высокий уровень экспрессии мРНК не всегда соответствует высокому уровню синтеза белка вследствие дополнительной регуляции его экспрессии на уровне трансляции. Для валидации ассоциированных с раком желудка белков и выяснения их локализации в клетке необходимо их тестирование in situ в срезах тканей опухолей (и прилежащей нормальной ткани) методом иммуногистохимии на основе коммерческих антител. Обнаружение белков с избирательно повышенным уровнем синтеза в интестинальном или диффузном типах опухолей откроет возможность создания тест-систем для дифференциальной диагностики РЖ.

Прогностический потенциал идентифицированных в работе маркеров будет оценен иммуногистохимическим анализом обширной коллекции парафиновых блоков опухолей желудка на основе корреляции между повышением уровня синтеза белка и данными о выживаемости пациентов, полученными в результате длительного наблюдения после проведенного специфического противоопухолевого лечения.

В случае если аффинность коммерческих антител к секреторным маркерам будет недостаточной для надёжной детекции маркера, будет осуществлено получение высокоаффинных поликлональных антител к идентифицированным маркерам с использованием оригинальной технологии. Получение антител к секреторным белкам с повышенным уровнем экспрессии в опухолях открывает возможность создания высокочувствительных серологических тестов для диагностики, послеоперационного мониторинга и прогнозирования течения заболевания. На основе идентифицированных белковых молекул предполагается создание тест-системы для диагностики и прогнозирования течения заболевания, с учетом различных гистологических типов опухоли. Применение тест-систем будет онкологического профиля, и для обследования лиц, находящихся на диспансерном учете по поводу заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Очевидно, что повышение надежности диагностических и прогностических тестов может быть достигнуто в результате использования наборов из нескольких белковых маркеров, однако существующие подходы к их идентификации являются малоэффективными и весьма трудоёмкими. Это приводит к необходимости повышения аффинности используемых в процессе тестирования антител и разработки более эффективных способов количественного определения присутствия маркеров в сыворотках крови (например, с использованием иммуно-ПЦР). В данном проекте интегрирован целый ряд инноваций для решения поставленных проблем, включающий увеличение чувствительности и специфичности методов поиска маркеров опухолей, получение высокоаффинных антител для увеличения чувствительности и специфичности детекции маркеров в биологических образцах, что свидетельствует о высокой перспективности запланированной НИР.

Современный уровень исследований с использованием высокотехнологичных методов протеомного и транскриптомного анализа (2D-электрофорез, масс спектрометрия, ОТ-ПЦР, вестерн-блот, биоинформатический анализ, клонирование белков, продукция высокоаффинных антител) подтверждает высокий уровень разработки.

2.5 Обоснование способов решения задач исследования Главные цели проекта: Идентификация наиболее информативных протеомных маркеров для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга высокочувствительных тест-систем для детекции идентифицированных маркеров в биологических образцах. Выполнение НИР должно обеспечивать достижение научных результатов мирового уровня, подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, формирование эффективных и жизнеспособных научных коллективов.

Достижение заявленных целей потребует решения следующих задач.

Идентификации потенциальных протеомных маркеров рака желудка различных гистологических типов на основе модификации метода сравнительного анализа протеомов.

2. Поиск и идентификация белков со стабильным повышением синтеза в опухолях желудка.

3. Отбор диагностических и прогностических маркеров рака желудка. Оценка эффективности детекции маркеров в собранной коллекции пар образцов (нормаопухоль) и сывороток крови онкопациентов и здоровых доноров.

4. Создание и тестирование наборов для ранней диагностики, прогнозирования течения заболевания и послеоперационного мониторинга больных с опухолями желудка с использованием разработанных нами высокочувствительных методов иммуно-анализа.

На первом этапе исследования планировалось проведение сравнительного анализа уровня синтеза белков в парах первичных карцином (по 50% обоих типов опухолей) и нормального эпителия больных РЖ в собраннной нами коллекции биологического материала методом двумерного гель-электрофореза с использованием разработанной нами модификации анализа протеомов. Описание результатов данного исследования приведено в главе 4. Собранная нами коллекция образцов РЖ включает десятки замороженных в жидком азоте образцов биопсий и операционного опухолевого материала, парафиновые блоки опухолей, образцы нормальной слизистой желудка и сыворотки крови пациентов и здоровых доноров.

Для повышения эффективности отбора образцов нами был создан компьютерный регистр, интегрирующий результаты гистопатологического и клинического анализа, которые представлены в таблице 3 в главе 6.

Отбор белковых пятен, интенсивность которых наиболее заметно (не менее, чем в пять раз) и наиболее часто (не менее, чем в половине пар образцов) повышается в опухолях желудка обоих типов по сравнению с нормой проведен с использованием компьютерного анализа. Мажорные белки, содержащиеся в пятнах, идентифицированы с использованием масс-спектрометрии; надёжность идентификации оценивалась по скор-параметру.

Для подтверждения стабильного повышения синтеза отобранных белков в опухолях желудка (задача 2) будет использован метод обратно-транскриптазной ПЦР (оценка экспрессии м-РНК) и Вестерн-блоттинга (с использованием коммерческих антител).

Для решения 3-й задачи на основе результатов ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга будет проведен иммуногистохимический анализ (ИГХ) обширной коллекции парафиновых блоков опухолей с использованием коммерческих антител. Это позволит: 1) определить клеточную локализацию идентифицированных белков; 2) оценить частоту повышения уровня их синтеза в опухолях; 3) определить информативность использования идентифицированных белковых маркеров для диагностирования опухоли и прогнозирования её развития (на основе корреляции между повышением уровня синтеза белка и данными о выживаемости пациентов, полученными в результате долговременного наблюдения); обнаружить корреляции между повышением уровня синтеза белкового маркера и типом опухоли (интестинальный или диффузный), её локализацией и стадией заболевания (локальный метастазирование).

Антитела к идентифицированным маркерам РЖ, секретируемым в кровоток, будут использованы для анализа коллекции полученных нами сывороток крови пациентов с диагнозом рак желудка и образцов крови здоровых доноров. Исходя из предыдущего опыта, мы не исключаем вероятности того, что при положительных результатах Вестерн-блоттинга и ИГХ аффинность коммерческих антител к секреторным маркерам будет недостаточной для надёжной детекции маркера в сыворотках крови. В этом случае будет осуществлено получение высокоаффинных поликлональных антител к идентифицированным маркерам в результате: 1) клонирования маркеров или их фрагментов в бактериях; 2) иммунизации кроликов очищенным антигеном; 3) очистки антител методом аффинной хроматографии.

Участниками проекта была разработана оригинальная технология получения и очистки высокоаффинных антител (патентная заявка РФ «Способ получения высокоаффинных поликлональных антител», регистрационный номер №2009140288, 30.10.2009).

диагностики РЖ в «слепых» экспериментах с использованием сывороток крови, полученных от больных раком желудка и практически здоровых лиц. На парафиновых срезах опухолей будет проведена оценка эффективности полученных антител иммуногистохимическим методом. При этом будет учитываться гистологический тип рака желудка – диффузный или интестинальный, с целью возможного отбора маркеров, специфических для того или иного типа. На образцах отсутствие рецидивирования, отдаленного метастазирования, выявленного на этапах послеоперационного мониторинга), а также имеющихся данных катамнеза (исхода) с целью отбора маркеров, информативных для прогноза клинического течения заболевания.

Предлагаемые в настоящем проекте подходы позволят: 1) выявить белковые (интестинальный и диффузный); 2) создать тест-системы для диагностики, прогнозирования и послеоперационного мониторинга заболевания, основанные на детекции идентифицированных белковых маркеров в сыворотках крови, биопсийном и хирургическом материале с использованием высокочувствительных методов иммуно-анализа. Поскольку аналогов таких наборов в мировой клинической практике не существует, идентифицированные маркеры РЖ и состав тест-систем будут защищены патентами.

Выявление различных белков, вовлеченных в механизмы формирования интестинальной или диффузной форм РЖ, различающихся по тяжести клинического течения, позволит, во-первых, проводить раннюю диагностику у лиц групп «высокого онкологического риска», во-вторых, при диагностике на ранних стадиях, когда макроскопически невозможно определить тип опухоли, при наличии ассоциированных с той или иной формой РЖ белковых маркеров, прогнозировать клиническое течение заболевания, и соответственно, дифференцированно подходить к выбору тактики лечения. При благоприятном прогнозе можно оптимизировать объем операции, что позволит уменьшить уровень хирургического и анестезиологического стресса и обеспечить снижение риска осложнений, связанных с расширенным объемом лимфодиссекции.

3 Идентификация потенциальных диагностических и прогностических маркеров рака желудка методами биоинформатики Первый использованный нами подход основывался на отборе мРНК, уровень транскрипции которых наиболее часто возрастает одновременно в интестинальных и диффузных опухолях желудка по сравнению с нормальными тканями. Поиск осуществляли по базе данных Oncomine (https://www.oncomine.org/ resource/login.htm) [64] в коллекции образцов Чена [65]. Гены-кандидаты для специфической диагностики и прогноза интестинального и диффузного подтипов РЖ отбирали на основе: 1) для дифузных опухолей - присутствие среди 1% генов с наибольшим уровнем транскрипции в диффузных опухолях по сравнению с нормой, при отсутствии изменения уровня экспрессии в интестинальных опухолях желудка или её понижении (P 0.1, использовали стандартный критерий Стьюдента); 2) для интестинальных опухолей применялся зеркальный вариант анализа. Исходный набор генов-кандидатов (91 ген) получили в результате объединения двух полученных выборок. Затем набор был разделён на две части, содержащие гены, кодирующие секретируемые белки (14 генов для поиска диагностических маркеров, секреция которых во внеклеточное пространство или кровоток подтверждалась нижеописанными критериями) и все остальные гены (77 генов, для поиска прогностических маркеров).

Отбор генов, кодирующих белки, секретируемые в кровоток или во внеклеточное пространство проводили с использованием двух критериев: 1) присутствие кодируемого белка в базах, содержащих экспериментально (http://www.biosino.org/bodyfluid/home.jsp) [67] присутствие кодируемого белка как минимум в двух из трёх баз данных секреторных белков, неподтверждённых экспериментально: 1) eSLDB (http://gpcr.biocomp.unibo. it/esldb/index.htm) [68]; 2) LOCATE [69] и Babelomics (http://babelomics.org) [70]. Из набора секретируемых белков были удалены восемь генов кодирующих различные изоформы коллагенов, низкая информативность которых для диагностики и прогнозирования опухолей была показана ранее.

На втором этапе была проведена элиминация транскриптов, уровень синтеза (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/) в клетках костного мозга, белых клетках крови и сосудах более чем вдвое превышает усреднённый уровень синтеза в опухолевых тканях желудка. Данный критерий отбора был введён потому, что значительная концентрация онкомаркера в крови делает невозможной сывороточную диагностику опухолей и заметно понижает чувствительность детекции прогностических маркеров. При этом оказалось, что ни один из секреторных белков не прошёл все критерии отбора. Таким образом, идентификация потенциальных диагностических маркеров РЖ в данном проекте в дальнейшем будет осуществляться методами сравнительного анализа протеома.

На третьем этапе проводили дополнительную оценку изменений уровня транскрипции мРНК, кодирующих потенциальные прогностические онкомаркеры, в нормальных и опухолевых тканях по базе данных dbEST. Оценка проводилась с использованием функции I, сбалансировано характеризующей частоту и уровень повышения синтеза мРНК в опухоли желудка. Для этого на первой стадии вычислений определяли величину где LT и LN – параметры, отражающие уровень транскрипции мРНК в опухолевых и нормальных тканях соответственно. LT вычисляли по формуле (2):

(значение параметра LN вычисляли аналогично), где ET - среднее число EST в клонотеках опухолевых тканей толстой кишки, E0 – среднее число EST на одну мРНК по всем клонотекам нормальных и опухолевых тканей, CT – доля клонотек опухолевых тканей, в которых присутствует хотя бы одна последовательность EST, С0 – усреднённое значение CN и CT для всех мРНК, VE – степень влияния среднего числа EST на конечный результат (принята равной 1), VС – степень влияния доли клонотек на результаты анализа (принята равной 0.5). Конечное значение I определяли следующим образом:

если величина R превышала единицу, и если R 1, где S – функция, отражающая величину стандартного отклонения (алгоритм её вычисления можно найти в статье Букуровой Ю.С. и др. Поиск белковых маркеров для сывороточной диагностики рака на основе анализа профилей экспрессии микроРНК. 2010. Мол. Биол., статья в печати). Для дальнейшего анализа отбирали только те гены-кандидаты, величина I для которых составляла как минимум 3.

На последнем этапе повторяли анализ, выполненный по базе данных dbEST, с использованием базы данных SAGE (http://cgap.nci.nih.gov/SAGE) по окончании которого элиминировали все гены ранее описанные в литературе. В результате поиска было отобрано семь не идентифицированных ранее потенциальных прогностических маркеров РЖ, кодирующих следующие белки:

GPNMB (трансмембранный гликопротеин, определяющий метастатический потенциал опухолевых клеток);

SERPINH1 (мембранный белок ингибирующий активность сериновых протеаз, антитела к которому обнаруживаются в крови больных ревматоидным артритом);

SPARC (секретируемый во внешклеточное пространство белок с большим количеством отрицательно заряженных аминокислот и цистеина в первичной структуре, регулирующий пролиферацию клеток);

SULF1 (внеклеточный фермент отщепляющий сульфатные группы гепарин сульфатов) CLDN4 (белок участвующий в образовании тесных контактов между клетками и влияющий на их дифференцировку) эпителиальных тканях);

7) PMEPA1 (трансмембранный предстательной железы и другими гормонами).

Прогностический потенциал идентифицированных маркеров будет в дальнейшем оценен в собираемых в настоящее время коллекциях агрессивных (быстро метастазирующих) и менее агрессивных опухолей желудка интестинального и диффузного типа.

Для идентификации генов, уровень синтеза которых специфически повышается только в одном из двух подтипов РЖ (диффузном или интестинальном), проводили отбор генов-кандидатов с использованием базы данных Oncomine (коллекция образцов Chen). Отбор проводили по следующим критериям: 1) присутствие гена-кандидата среди 10% генов, экспрессия которых повышается (с наибольшей статистической значимостью) для данного подтипа опухолей (например, интестинального); 2) присутствие гена-кандидата среди 10% генов для которых характерно статистически значимое понижение уровня экспрессии для сравниваемого подтипа (т.е. диффузного). В результате было отобрано девять белков повышение уровня синтеза которых специфично для диффузных опухолей и восемь специфичных для интестинальных опухолей. Второй этап отбора проводили как описано выше с использованием базы данных dbEST, сравнивая уровень транскрипции гена в нормальных тканях желудка (анализ уровня экспрессии в опухолевых клетках интестинального и диффузного типа в данном случае невозможен из-за недостаточно информативной аннотации образцов) и в клетках костного мозга, белых клетках крови и сосудах. Все критерии отбора прошел только один ген - ECE1, транскрипция которого стабильно повышается в опухолях диффузного, но не интестинального типа. Однако, уровень повышения экспрессии использования в клинических тестах. Таким образом, в результате использования трёх различных методов биоинформатического поиска онкомаркеров РЖ было идентифицировано семь потенциальных прогностических маркеров опухолей желудка, тогда как поиск потенциальных диагностических маркеров и маркеров специфичных для интестинального или диффузного подтипов РЖ оказался непродуктивным.

4 Проведение 2-D протеомного анализа, выявление белковых пятен с высокой экспрессией, идентификация белков масс-спектрометрией 4.1 Экстракция белков и 2D анализ экстрактов 11 образцов опухолей желудка (пять интестинальных и шесть диффузных, стадии T1-4N0-1M0) после резекции максимально быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -70С. Диагноз подтверждали морфологически. Отсутствие опухолевых клеток в образцах нормальных тканей, расположенных на расстоянии 10— гомогенизировали и экстрагировали солевым буфером согласно предложенному нами ранее протоколу [4]. Концентрацию белка в экстрактах определяли методом Бредфорд [71]. 2D гель-электрофорез проводили согласно стандартному протоколу [72]. На трубку наносили 100 мкг белка и проводили изоэлектрофокусировку в направлении кислого буфера (300 В, 16 часов). Столбики геля извлекали из трубок, промывали 40 минут в буфере Лэммли и замораживали при -80°С. Разделение во втором направлении проводили в градиентном полиакриламидном геле (10-22%) при 25 мА, в течение 16 часов. После электрофореза гели окрашивали солями серебра Электрофореграммы сканировали на приборе Epson Perfection V750 Pro, [73].

позволяющем получать изображения прозрачных объектов в видимом диапазоне с разрешением 4800 dpi.

4.2 Идентификация белковых пятен Масс-спектрометрический анализ проводили на тандемном MALDI-TOF/TOF спектрометре Ultraflex II (Bruker Daltonics, Германия), оснащенном УФ лазером (Nd).

Кусочки геля дважды промывали в 100 мкл 40%-ого раствора ацетонитрила в 0.1 М NH4HCO3 (30 мин при 37°C) и после удаления раствора дегидратировали добавлением 100 мкл ацетонитрила. Ацетонитрил удаляли, образцы высушивали и добавляли 3 мкл раствора модифицированного трипсина («Promega», США, мкг/мл в 0,05 М NH4HCO3). Образцы инкубировали 12 ч при 37°C и добавляли мкл 0,5%-ной ТФУ в 10%-ном водном растворе ацетонитрила. На мишени смешивали 2 мкл надгелевого раствора и 0,3 мкл раствора 2,5-дигидробензойной кислоты («Aldrich», США, 20 мг/мл в 20%-ном водном растворе ацетонитрила с добавлением 0,5% трифторуксусной кислоты). Смесь высушивали на воздухе. Массспектрометрию проводили в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона в диапазоне 700-4500Да (общий разгоняющий потенциал в рефлектомоде +25кВ). Спектры фрагментации отдельных пептидов получали в тандемном режиме (Lift) при этом разгоняющий потенциал родительских ионов составлял +7кВ, а фрагментные ионы ускорялись до 28кВ. Точность измеренных масс после калибровки по пикам автолиза трипсина составляла минимум 0,005%, точность измеренных масс фрагментов - 1Да. Обработка масс-спектров проводилась с Идентификацию белков по «пептидному масс-фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot в базе данных белков человека NCBI с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и модификации цистеинов акриламидом. Идентификация белка считалась достоверной при значении интегрального параметра 71 (p 0,05). Если определение белка не удовлетворяло критериям надежности, получали спектры фрагментации отдельных пептидов и проводили поиск по МС+МС/МС с использованием программы BioTools v.3 (Bruker Daltonics, Германия).

4.3 Выбор белков, синтез которых повышен в опухолях, электрофореза Большинство протеомных исследований выполняются с использованием тотального экстракта ткани, содержащего высокий уровень структурных белков, что затрудняет выявление минорных растворимых белков. Для устранения высококопийных структурных белков в данной работе проводилась предварительная экстракция растворимых белков тканей солевым буфером [4]. Сравнение электрофореграмм, полученных после разделения 11 пар белковых экстрактов нормальной и опухолевой тканей желудка методом двумерного электрофореза позволило обнаружить 8 белковых пятен, интенсивность которых увеличена в опухоли по сравнению с нормой, как минимум в три раза, не менее, чем в четырёх образцах (Таблица 1). Двумерные электрофореграммы двух пар образцов представлены на Рисунке 1.

Цифрами обозначены белки: 4 – TXN, 6 – SOD2, 7 – S100A6; 1, 2,3, 5, 8 – белки, с повышенным уровнем синтеза в опухоли, имеющие скор-параметр менее 70.

Рисунок 1 - Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков растворимых в солевом буфере из нормальной (А, В) и опухолевой (Б, Г) Таблица 1. Результаты масс-спектрометрического анализа белковых пятен, разделенных методом двумерного электрофореза.

№ пятна Мол.вес Кандидаты по результатам масс-спектрометрии, Описание функции Участие в Продолжение таблицы Продолжение таблицы Масс-спектрометрический анализ белковых пятен с заметной разницей идентификации двух белков по интегральным параметрам: супероксиддисмутазы (SOD2) и белка S100A6 (значения параметра 73 и 72 соответственно, Таблица 1).

Кроме того, была проведена вероятная, но не окончательная идентификация белка TXN (значение параметра 69), повышение уровня синтеза которого в опухолях желудка было описано ранее [74]. Перечень белков, выявленных на основе двумерного гель-электрофореза, сверхэкспрессированных в опухолях желудка диффузного и интестинального типов по сравнению с нормальной слизистой тех же пациентов, представлен в Таблице 2.

содержанием в опухолях желудка.

Примечание повторяемость - отношение количества опухолей интестинального и диффузного типа с повышенным уровнем синтеза белка к общему количеству проанализированных опухолей интестинального и диффузного типа соответственно.

Небольшое количество идентифицированных маркеров РЖ по сравнению с результатами проведённого нами ранее 2D анализа других типов опухолей (толстой агрессивностью среды в полости желудка, так и резкой активизацией процессов некротического и апоптотического распада клеток через короткое время после резекции хирургического материала, которые приводят к появлению многочисленных продуктов протеолиза, затрудняющих разделение и идентификацию белков.

Два из трёх идентифицированных белков (S100A6 и TXN) являются секреторными и, следовательно, проникают в кровоток в процессе роста опухоли и её некротического распада. Эти маркеры могут использоваться для сывороточной диагностики широкого спектра опухолей, поскольку заметное и частое повышение уровня экспрессии белка S100A6 обнаружено при раках поджелудочной железы [78], прямой кишки [79] и легких [80], а для белка TXN при раке прямой кишки [81].

Сравнение частоты повышения уровня синтеза идентифицированных белков в гистологических подтипах РЖ показало, что повышение уровня синтеза белков TXN и SOD2 происходит в диффузных опухолях заметно чаще, чем в интестинальных (в два и четыре раза соответственно), тогда как в случае белка S100A6 разница оказалась незначительной. Преимущественная экспрессия белка TXN в опухолях классификации, во многом аналогичный диффузным опухолям) описана ранее [82].

Диффузный тип РЖ имеет значительно худший прогноз по сравнению с интестинальными опухолями, поэтому иммуногистохимический анализ экспрессии маркеров TXN и SOD2 в биопсийном материале, полученном при гастроскопии, может облегчить выбор оптимального метода лечения, с учетом того, что результаты гистологического анализа опухолей желудка очень часто неоднозначны.

Проверка статистической достоверности обнаруженных корреляций и возможности их практического применения в клинической практике потребует исследования более представительных выборок образцов методами иммунохимии.

Анализ функций идентифицированных белков показал, что два из них являются ферментами-антиоксидантами способными восстанавливать активные формы кислорода (в частности, перекись водорода) в цитоплазме клеток (TXN) и клеточных митохондриях (SOD2), защищая их от окислительного стресса (Таблица 1). Было показано, что на начальных этапах канцерогенеза в процессе иммортализации клеток происходит значительное повышение уровня синтеза ферментов-антиоксидантов (оксиредуктаз), ассоциированное с неблагоприятным прогнозом развития опухоли и резким увеличением вероятности перехода доброкачественной опухоли в злокачественное состояние [83]. Повышение уровня синтеза оксиредуктаз приводит к снятию оксидативного стресса, возникающего в результате аномального кровоснабжения опухоли, а также секреции активных форм кислорода макрофагами и гранулоцитами при их инфильтрации в опухоль. Кроме того, повышенный уровень оксиредуктаз в опухолевых клетках приводит к ингибированию процессов апоптоза и некроза. Роль тиоредоксина в возникновении и прогрессии широкого спектра опухолей хорошо документирована [82-84].

Функции этого белка состоят в инактивации перекисей, поставке атомов водорода для восстановления цитоплазматических редуктаз, а также регуляции клеточного цикла и супрессии апоптоза. Супероксиддисмутаза 2 инактивирует супероксиды, возникающие в митохондриях в результате утечки электронов из дыхательной цепи.

Присутствие некоторых полиморфизмов в составе гена SOD2 ассоциировано с повышенным риском возникновения целого ряда опухолей [85].



Pages:   || 2 |


Похожие работы:

«РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ: Первый проректор по учебной работе _ /Л.М. Волосникова/ _ 201г. НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА, включая научно-исследовательский семинар Учебно-методический комплекс для магистрантов программы Прикладная информатика в экономике очной формы обучения направления 230700.68 Прикладная...»

«Математическая биология и биоинформатика. 2011. Т. 6. № 1. С.102–114. URL: http:// www.matbio.org/2011/Abakumov2011(6_102).pdf ================== МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ================= УДК: 577.95 Неопределенность при моделировании экосистемы озера * **2 ©2011 Пахт Е.В. 1, Абакумов А.И. 1 ФГОУ ВПО Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный университет, Владивосток, 690087, Россия 2 Учреждение Российской академии наук Институт автоматики и процессов управления ДВО РАН,...»

«Сельскохозяйственные биотехнологии в развивающихся странах: варианты и возможности в производстве сельскохозяйственных культур, в лесном хозяйстве, в животноводстве, в рыбном хозяйстве и в агропромышленном комплексе для преодоления проблем продовольственной безопасности и изменения климата (ABDC-10) ГВАДАЛАХАРА, МЕКСИКА, 1- 4 МАРТА 2010 г. ИЗДАНИЕ для Региональной сессии для стран Европы и Центральной Азии: Сельскохозяйственные биотехнологии в Европе и в Центральной Азии: новые вызовы и...»

«ВВЕДЕНИЕ В широком смысле Маркетинг это философия управления, согласно которой разрешение проблем потребителей путем эффективного удовлетворения их запросов, ведет к успеху организации и приносит пользу обществу. Для эффективного решения этой задачи необходима подготовка квалифицированных специалистов в области маркетинговой деятельности, способных в начале следующего столетия работать в условиях развитой информатизации. От масштабов и качества использования информационных технологий в...»

«И.И.Елисеева, М.М.Юзбашев ОБЩАЯ ТЕОРИЯ СТАТИСТИКИ Под редакцией члена-корреспондента Российской Академии наук И.И.Елисеевой ПЯТОЕ ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению и специальности Статистика Москва Финансы и статистика 2004 УДК 311(075.8) ББК 60.6я73 Е51 РЕЦЕНЗЕНТЫ: Кафедра общей теории статистики Московского государственного университета...»

«Артемьева Галина Борисовна Медико-экономическая оценка реформирования региональной системы обязательного медицинского страхования (на примере Рязанской области) 14.02.03 – Общественное здоровье и здравоохранение А В Т О Р Е Ф Е РАТ диссертации на соискание учной степени доктора медицинских наук Рязань, 2014 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Рязанский государственный медицинский университет им....»

«СОДЕРЖАНИЕ ПРЕДИСЛОВИЕ 2 КРАТКИЙ ИСТОРИЧЕСКИЙ ОЧЕРК 3 Введение 4 Начальный период радиофизических исследований в БГУ 6 Подготовка специалистов по радиофизике и электронике 7 Открытие факультета.Годы самостоятельной деятельности 12 ФАКУЛЬТЕТ СЕГОДНЯ 21 Деканат, структура факультета, кадры 22 Учебный процесс 24 Научно-инновационная деятельность 27 Сотрудничество 33 Студенческая жизнь 35 КАФЕДРЫ Кафедра радиофизики и цифровых медиатехнологий...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Тверской государственный университет УТВЕРЖДАЮ Руководитель ООП подготовки Магистров 2012 г. Учебно-методический комплекс по дисциплине ИНОСТРАННЫЙ ЯЗЫК для студентов 1 курса магистратуры Направление подготовки 010400.68 – Прикладная математика и информатика Программа специализированной подготовки магистров Системный анализ Системное программирование...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный университет (НГУ) Кафедра общей информатики Е.Н. Семенова РЕАЛИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ЗАЩИЩЕННОГО ОБНОВЛЕНИЯ ПРОГРАММНЫХ СИСТЕМ ПО СЕТИ МАГИСТЕРСКАЯ ДИССЕРТАЦИЯ по направлению высшего профессионального образования 230100.68 ИНФОРМАТИКА И ВЫЧИСЛИТЕЛЬНАЯ ТЕХНИКА ФАКУЛЬТЕТ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ Тема...»

«МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ РАБОЧАЯ ПРОГРАММА дисциплины: Операционные системы, среды и оболочки для специальности 080801.65 Прикладная информатика (по областям) Факультет прикладной информатики Ведущая кафедра информационных систем Дневная форма обучения Вид учебной работы Курс, Всего часов семестр Лекции 2 курс, 4 семестр...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Амурский государственный университет Кафедра математического анализа и моделирования УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДИСЦИПЛИНЫ Теория вероятностей и математическая статистика Основной образовательной программы по специальности 160400.65–Проектирование, производство и эксплуатация ракет и ракетно-космических комплексов Благовещенск 2012 г....»

«Заведующий кафедрой Информатики и компьютерных технологий Украинской инженерно-педагогической академии, доктор технических наук, профессор АШЕРОВ АКИВА ТОВИЕВИЧ Министерство образования и науки Украины Украинская инженерно-педагогическая академия АКИВА ТОВИЕВИЧ АШЕРОВ К 70-летию со дня рождения БИОБИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ УКАЗАТЕЛЬ Харьков УИПА, 2008 ББК 74.580.42я1 А 98 Составители: Ерёмина Е. И., Онуфриева Е. Н., Рыбальченко Е. Н., Сажко Г. И. Ответственный редактор Н. Н. Николаенко Акива Товиевич...»

«ЭКОНОМИКА УДК 338:502.3 В.Н. Чупис, доктор физико-математических наук, АНО Научноисследовательский институт промышленной экологии, г. Саратов e-mail: v.chupis2112@yandex.ru А.Н. Маликов, кандидат экономических наук, профессор Саратовского института (филиала) РГТЭУ email: filsaratov@rsute.ru В.В. Мартынов, доктор технических наук, профессор Саратовского государственного технического университета им. Гагарина Ю.А. e-mail: filsaratov@rsute.ru П.Л. Бахрах, старший научный сотрудник АНО...»

«И.М.Лифиц СТАНДАРТИЗАЦИЯ, МЕТРОЛОГИЯ И СЕРТИФИКАЦИЯ УЧЕБНИК Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебника для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальностям Коммерция, Маркетинг, Товароведение и экспертиза товаров 5-е издание, переработанное и дополненное МОСКВА • ЮРАЙТ • 2005 УДК 389 ББК 30.10ц; 65.2/4-80я73 Л64 Рецензенты: М.А. Николаева — доктор технических наук, профессор, действительный член Международной академии информатизации: Г.Н....»

«СРГ ПДООС ПРЕДЛАГАЕМАЯ СИСТЕМА СТАНДАРТОВ КАЧЕСТВА ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ДЛЯ МОЛДОВЫ: Технический доклад (сокращенная версия, без приложений) Настоящий доклад подготовлен Полом Бяусом (Нидерланды) и Кармен Тоадер (Румыния) для Секретариата СРГ ПДООС/ОЭСР в рамках проекта Содействие сближению со стандартами качества воды ЕС в Молдове. Финансовую поддержку проекту оказывает DEFRA (Соединенное Королевство). За дополнительной информацией просьба обращаться к Евгению Мазуру, руководителю проекта в ОЭСР,...»

«2 Программа разработана на основе ФГОС высшего образования по программе бакалавриата 02.03.03 Математическое обеспечение и администрирование информационных систем. Руководитель программы Информационные технологии (очная форма обучения): Артемов Михаил Анатольевич, д.ф.-м.н., зав. кафедрой ПО и АИС. Описание программы: Целью программы является подготовка высококвалифицированных специалистов в области проблем современной информатики, математического обеспечения и информационных технологий;...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Кемеровский государственный университет в г. Анжеро-Судженске 1 марта 2013 г. РАБОЧАЯ ПРОГРАММА по дисциплине Математический анализ (ЕН.Ф.1) для специальности 080116.65 Математические методы в экономике факультет информатики, экономики и математики курс: 1, 2, 3 экзамен: 2, 3, 5 семестры семестр: 2, 3, 4, 5 зачет:2, 3, 4 семестры...»

«Мультиварка-скороварка RMC-M110 РУКОВОДСТВО ПО ЭКСПЛУАТАЦИИ www.multivarka.pro УВАЖАЕМЫЙ ПОКУПАТЕЛЬ! Благодарим вас за то, что вы отдали предпочтение бытовой технике REDMOND. REDMOND — это качество, надежность и внимательное отношение к нашим покупателям. Мы надеемся, что и в будущем вы будете выбирать изделия нашей компании. Мультиварка-скороварка REDMOND RMC-М110 — современ- способами. Теперь сварить кашу можно за 5 минут, приготовить ное многофункциональное устройство, в котором передовые...»

«УТВЕРЖДЕН ученым советом Государственного университета – Высшей школы экономики Протокол от 02.07.2010 г. № 15 ПРАВИТЕЛЬСТВО РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ОБРАЗОВАТЕЛЬНЫЙ СТАНДАРТ ГОСУДАРСТВЕННОГО ОБРАЗОВАТЕЛЬНОГО БЮДЖЕТНОГО УЧРЕЖДЕНИЯ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ - ВЫСШАЯ ШКОЛА ЭКОНОМИКИ, в отношении которого установлена категория национальный исследовательский университет по направлению подготовки 080500.62 БИЗНЕС-ИНФОРМАТИКА Уровень подготовки: Бакалавр Москва...»

«ПРЕДИСЛОВИЕ1 Интернет-версия пособия Информатика состоит из двух разделов: Теория (с задачами и решениями); • Практикум по алгоритмизации и программированию. • Теоретический раздел представляет собой попытку создания на доступном уровне цельной картины курса информатики в фундаментальном его аспекте. В нем рассматриваются такие содержательные линии курса информатики, как информация и информационные процессы, представление информации, компьютер, алгоритмы и исполнители, моделирование и...»






 
© 2014 www.kniga.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Книги, пособия, учебники, издания, публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.